检测血液中微生物的方法及装置的制造方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及微生物检测，特别是血液中的微生物的检测方法、宿主感染病原体的 检测方法及其装置。
【背景技术】
[0002] 基于宿主与微生物的关系，宿主中的微生物可分为多种，包括正常菌群、与宿主共 生的包括寄生的微生物、引起机体感染致病的微生物--病原体等。宿主的血浆含有游离 DNA，包括来源于宿主的和来源于微生物的游离DNA片段。
[0003] 不明原因发热（fever of undetermined origin, fever of unknown origin，FUO)，是指反复发热超过38. 3°C，病程持续3周以上，并且经1周详细的检查仍无 法明确诊断的疾病。根据潜在病因将FU0分为4种亚型-经典型（classic FU0)、院内型 (nosocomial FU0)、免疫缺陷型（neutropenic FU0)和 HIV相关型（HIV associated FU0)。
[0004] 据文献报道，目前FU0大约占发热病例的10%，其确诊率大约在90%左右。在已 确诊的病例中，感染性疾病大约占到50% -55%，其中细菌感染大约占感染性疾病75%，占 诊断明确疾病40%左右；病毒感染大约占感染性疾病20%，占诊断明确疾病10%左右；其 他感染约占感染性疾病4%，占诊断明确疾病2%左右，包括真菌感染、支原体感染、立克次 体感染、及寄生虫感染。非感染性疾病占45% -50%，其中自身免疫疾病约占非感染性疾病 50%，占诊断明确疾病23%左右；肿瘤性疾病占非感染性疾病49%，占诊断明确疾病16%。
[0005] 不明原因发热的诊断关键在找出病因，临床上主要应鉴别4类疾病，即感染性疾 病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病及其他可引起发热的疾病。目前针对不明原因发热病因诊断 展开了大量的研究，研究证明感染仍是不明原因发热研究性报告中最为普遍的病因。
[0006] 目前，不明原因发热明确诊断方法中以血清学和（或）细菌学为主，其次为组织学 活检，再次为临床过程和（或）治疗反应、影像学检查、体液或骨髓检查、手术探查。这些技 术在临床诊断中已发挥了巨大的作用，但仍存在一些不足之处，例如培养技术繁琐而费时， 组织学活检及手术探查等可能会给病人带来痛苦及负担，这些不足之处需要应用新的技术 去弥补。
【发明内容】
[0007] 本发明一方面提供一种检测血液中微生物的方法，微生物包括细菌、病毒和真菌， 包括：（1)提取血液样本核酸，对核酸的至少一部分进行序列测定，获得测序数据；（2)去除 (1)中的测序数据中的宿主测序数据；(3)将（2)中余下的测序数据比对到微生物参考数据 库，获得比对结果，所说的微生物参考数据库包含多种细菌的参考序列和多种病毒的参考 基序列；(4)依据（3)的比对结果，确定微生物包含的物种及物种的丰度。
[0008] 本发明的另一方面提供一种确定宿主感染病原体的方法，所说的宿主包括人和哺 乳动物，所说的病原体包括致病细菌和/或致病病毒，该方法包括：（1)提取宿主血液样本 核酸，对核酸的至少一部分进行序列测定，获得测序数据；（2)去除（1)中的测序数据中的 宿主测序数据；（3)将（2)中余下的测序数据比对到病原体参考数据库，获得比对结果；(4) 依据（3)的比对结果，确定样本包含的致病物种及其丰度；（5)将（4)中致病物种的丰度与 所述致病物种的不致病丰度进行比较，两者有显著性差异则确定该宿主感染这种病原体。
[0009] 本发明的再一方面提供一种确定宿主感染病原体的装置，该装置包括：A.核酸提 取单元，用于提取宿主血液/血浆/血清样本核酸，对核酸的至少一部分进行序列测定，获 得测序数据；B.数据去除单元，连接A单元，用于接收A中的测序数据，去除测序数据中的 宿主测序数据；C.比对单元，连接B单元或者连接A和B单元，用于将B中余下的测序数据 比对到病原体参考数据库，获得比对结果；D.丰度计算单元，与C单元连接，用于接收C中 的比对结果，确定样本包含的病原体种类及各种病原体的丰度；E.判定单元，与D单元连 接，用于接收D中的致病物种的丰度，将致病物种的丰度与该致病物种的不致病丰度进行 比较，二者有显著性差异则确定宿主感染该致病物种。
[0010] 本发明提供的血液微生物的检测方法、检测宿主感染病原体的方法和装置，是基 于新一代的高通量测序技术来进行的，本发明提供的方法只需要宿主的血液/血浆/血清 即可，与组织学活检及手术探查等技术相比可以大大的减轻受检者的痛苦。同时，本发明的 方法仅需要2-3天左右的时间，可以尽早的为受检者找到相关的微生物或病原体，以便及 时的调整治疗方案以解除受检者或者患者的痛苦。此外，本发明的方法或装置的成本也相 对较低，通量高，符合大多数受检者或患者的支付水平，可以在临床中广泛推广，快速检测 用于辅助临床诊断。还可用于血质的检测，利于健康输血用血。
【附图说明】
[0011] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将 变得明显和容易理解，其中：
[0012] 图1是本发明的一个【具体实施方式】中的四个血浆样本病原体细菌丰度 (abundance2)表达值前10位的数据趋势图；
[0013] 图2是本发明的一个【具体实施方式】中的四个血浆样本病原体病毒丰度 (abundance2)表达值前10位的数据趋势图；
[0014] 图3是本发明的一个【具体实施方式】中的不明原因发热病原体检测信息分析流程 示意图。
【具体实施方式】
[0015] 根据本发明的一个实施方式，提供了一种检测血液中微生物的方法，所说的微生 物包括细菌、病毒和真菌，该方法包括如下步骤：
[0016] 步骤一：获得血液样本核酸测序数据
[0017] 所说的血液样本，包括全血样本、血浆样本和/或血清样本。获得宿主血液样本 后，可处理血液样本获得血清或者血浆样本，提取血清或血浆中的核酸，对核酸的至少一部 分进行序列测定，获得测序数据。血浆或血清中的核酸为游离核酸，为来自宿主以及宿主 中的微生物的核酸混合物。这边的宿主可以是人也可以是其它哺乳动物，这边核酸可以是 DNA，也可以是RNA，测定DNA和/或RNA的序列，可以依据所选用的测序方法进行相应的 文库制备，可选用的测序方法根据来自的测序平台包括但不限于BGISEQ1000、BGISEQ100、 Illumina/Solexa、ABI/SOLiD和Roche 454,依据所选测序平台进行相应的单端或双端测 序文库的制备。根据本发明一种【具体实施方式】，宿主是人，提取的核酸是人血浆中游离DNA， 利用华大基因（BGI)的BGISEQ100平台及其DNA文库构建说明DNA测序，获得测序数据，测 序数据由多个测序序列（reads，读段）组成。在本发明的一个【具体实施方式】中，获得测序数 据后，还去除获自BGISEQ100平台的测序数据中小于50bp的读段，因为获自BGISEQ100的 读段长度不一，这样较严格的去掉较短的读段能提高整体读段的质量，提高数据利用率，利 于后续准确检测。
[0018] 步骤二：去除测序数据中的宿丰测序数据
[0019] 将步骤一的测序数据比对到宿主人的参考序列上，将比对上人参考序列的测序数 据去除。参考序列为已知序列，他人公开或是自己测定。人的参考序列可以是已知的基因 组或是已知的基因组的一部分序列，比如组装片段。序列比对可以利用已知软件比如SOAP 或BWA来进行。在本发明的一个【具体实施方式】中，人参考基因组为HG19,获自NCBI网站，t匕 对是利用Life Technologies的TMAP软件进行的，将比对上HG19的读段去除，屏蔽掉比对 上的序列，得到非人的测序数据。去除大量的宿主源的数据，减少对微生物源核酸数据的干 扰，便于后续微生物检测鉴定。
[0020] 步骤三：获得金下的测序数据的比对结果
[0021] 将步骤二中余下的测序数据比对到微生物参考数据库，获得比对结果，所说的微 生物参考数据库包括多种细菌的参考基因序列和多种病毒的参考序列。细菌或病毒的参考 序列可以是已知的该细菌或病毒的基因组或是基因组的一部分序列，比如该细菌/病毒的 组装片段。细菌或病毒基因序列可以获自公开数据库，比如NCBI。在本发明的一个具体实 施方式中，选择各种与人相关的细菌和病毒的参考基因组，分别构成细菌参考数据库和病 毒参考数据库。针对细菌参考数据库中的每种细菌选择其一株菌株，优先选择遗传信息数 据最多的菌株，这样可以保证细菌参考数据库物种的唯一性和全面性，以免受到物种内不 同菌株由于高度近缘，序列高度相似而影响物种的定量分析；病毒参考数据库包含所有与 宿主人相关的病毒全基因组序列，由于病毒变异较大，所以保留同种病毒不同亚型，即某种 病毒的参考基因组包括该病毒的所有亚型的参考基因组，且选择基因组大小为600bp以上 的病毒株的基因组作为参考序列。
[0022] 步骤四：确定检测到的微牛物物种及各物种的丰度
[0023] 依据步骤三的比对结果，确定样本中包含的微生物种类及各物种的丰度。在本 发明的一个【具体实施方式】中，根据与细菌和/或病毒数据库的比对结果，确定样本中细 菌或病毒源核酸表达丰度。各微生物物种的量化，即表达丰度，包括依据比对结果中比 对上该物种的测序数据计算得到的该物种的覆盖度和覆盖深度。在本发明的一个具体 实施方式中，根据覆盖度和深度信息推演获得以下两组病原体量化公式：公式I :丰度
:,其中，i表示物种；和/或，公式II :
j表示与物种i同一参考数据