重组微生物和其使用方法
【专利说明】重组微生物和其使用方法 相关申请的交叉引用
[0001 ]本申请要求2013年9月12日提交的临时申请号61 /877，272的优先权，该临时申请 的内容特此W引用的方式并入。
技术领域
[0002] 本发明设及用于制备重组梭菌属(Clostridi皿spp)的选择标记。
【背景技术】
[0003] 用于制造重组生物体的方法是已知的。所述方法通常包括用外源核酸载体转化生 物体，所述外源核酸载体可与宿主基因组整合或保持在稳定的独立(例如，染色体外)状态。
[0004] 将外源核酸整合至宿主基因组中设及载体与内源核酸之间的双交叉事件。双交叉 重组在过低的频率下发生W致于不能仅靠偶然来可靠地鉴定整合体。因此，选择一个或两 个交叉的方法在时间和劳力上都对鉴定频率具有巨大益处。
[0005] 用于筛选重组事件的选择标记是已知的。运些标记通常是赋予宿主生物体W选择 性优点（正向选择)或缺点(反向选择)的蛋白质编码序列。多种正向选择和反向选择标记是 已知的并且可W用于筛选其中已发生所希望的重组事件的生物体。正向选择标记通常包含 当表达时允许生物体在特定生长环境中存活的基因。反向选择标记通常包含当表达时产生 对生物体致命的毒素的基因。
[0006] 在除梭菌之外的细菌中，存在过多的可用反向选择标记，但不幸的是由于生理或 遗传原因，绝大多数在梭菌中不起作用。
[0007] 本发明的一个目的是克服现有技术的一个或多个缺点，或至少向公众提供有用的 选择。
【发明内容】
[000引在第一方面，本发明提供化iK和/或曲eS在从亲本微生物产生重组微生物的方法 中作为反向选择标记的用途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述化eS相比于野 生型化eS包括至少一个变异W使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似 物来氨基酷化tRNA。
[0009] 在第二方面，本发明提供编码化iK和/或PheS的核酸在用于从亲本微生物产生重 组微生物的质粒中的用途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述化eS相比于野生 型化eS包括至少一个变异W使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物 来氨基酷化tRNA。
[0010] 在第S方面，本发明提供包含编码化iK和/或PheS的核酸的质粒用于从亲本微生 物产生重组微生物的用途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述化eS相比于野生 型化eS包括至少一个变异W使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物 来氨基酷化tRNA。
[0011] 在第四方面，本发明提供用于从亲本微生物产生重组微生物的方法，所述方法包 括至少如下步骤： a) 用质粒转化亲本微生物，所述质粒包含： 1. 编码选自PheS和化化的至少一个反向选择标记的至少一个核酸序列，其中所述化eS 相比于野生型PheS包括至少一个变异W使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙 氨酸类似物来氨基酷化tRNA; 2. 编码至少一个正向选择标记的至少一个核酸序列;和 3. 与所述亲本微生物的基因组内的目标位置周围的所选区域同源的两个核酸序列，其 允许所述质粒与所述亲本微生物的基因组重组； b) 选择表达所述至少一个正向选择标记的一种或多种微生物;和 C)选择不表达所述至少一个反向选择标记的一种或多种微生物。
[0012] 在一个实施方案中，选择步骤b)和C)是同时进行的。在另一个实施方案中，选择步 骤b)和C)是依序进行的。
[0013] 在一个实施方案中，所述质粒还包含有待插入亲本基因组中的至少一个所关注核 酸序列。
[0014] 在第四方面，本发明提供编码PheS的核酸，其中所述PheS相比于野生型PheS变异 W使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酷化tRNA,并且其中 所述野生型化eS是源自梭菌属或者是其功能等效变异体。
[0015] 在第五方面，本发明提供包含根据本发明的第四方面的核酸的核酸载体。在一个 实施方案中，所述载体是质粒。
[0016] 在一个实施方案中，所述载体是质粒并且还包含W下中的一种或多种： a. 编码至少一个正向选择标记的至少一个核酸序列;和 b. 与亲本微生物的基因组内的目标位置周围的所选区域同源的两个核酸序列，其允许 所述质粒与所述亲本微生物的基因组重组。
[0017] 在一个实施方案中，所述质粒还包含希望插入亲本微生物的基因组中的至少一个 所关注核酸序列。
[0018] 在第六方面，本发明提供PheS，其中所述PheS相比于野生型PheS包含一个或多个 变异W使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酷化tRNA,并且 其中所述野生型化eS是源自梭菌属或者是其功能等效变异。
[0019] 在第屯方面，本发明提供包含根据本发明的第四方面的核酸、根据本发明的第五 方面的载体和/或根据本发明的第六方面的PheS的细胞。
[0020] 在本发明的上述方面的一个实施方案中，野生型曲eS和/或编码化eS的野生型核 酸是源自梭菌属或者是其功能等效变异体。
[0021] 在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，PheS相比于野生型的至少一 个变异包括一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加。
[0022] 在本发明的上述方面和实施方案的一个特定实施方案中，PheS的至少一个变异位 于底物特异性位点内。在一个实施方案中，所述底物特异性位点位于相对于合成气发酵梭 菌(C.autoethanogenum)的野生型化eS(SEQ ID 21)的氨基酸位置读取的氨基酸306与313 之间。在一个实施方案中，所述至少一个变异是在位置311处的氨基酸取代。在一个实施方 案中，所述至少一个变异是在氨基酸311处用Cys取代Gly。
[0023] 在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，所述化eS是源自合成气发酵 梭菌(Clostridium autoethanogenum)或者是其功能等效变异体。
[0024] 在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，变异的化eS包含SEQ ID No. 21的氨基酸序列。
[0025] 在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，编码相比于野生型化eS包括 至少一个变异的化eS的核酸相比于编码野生型化eS的核酸包含至少一个变异。在一个实施 方案中，编码PheS的核酸中的至少一个变异包括一个或多个核巧酸取代、缺失和/或添加。 在一个实施方案中，核酸序列中的一个或多个变异位于编码化eS的底物特异性位点的核酸 区域内。在一个实施方案中，编码底物特异性位点的核酸区域位于相对于编码合成气发酵 梭菌的野生型化eS(SEQ ID 12)的基因的核巧酸位置读取的碱基918与939之间。在一个实 施方案中，所述至少一个变异是在碱基932处的核巧酸取代。在一个实施方案中，所述至少 一个变异是在碱基932处用C取代G。
[0026] 在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，编码化eS的核酸是源自合成 气发酵梭菌或者是其功能等效变异体。
[0027] 在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，编码变异PheS的核酸包含 沈Q ID No. 14的序列。
[0028] 在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，所述苯丙氨酸类似物选自氯 苯丙氨酸、氣苯丙氨酸和漠苯丙氨酸。在一个特定实施方案中，所述苯丙氨酸类似物选自 Dk4-氯苯丙氨酸和对氯苯丙氨酸、对氣-心苯丙氨酸、对氣-〇心苯丙氨酸、对漠 A-苯丙氨 酸。
[0029] 在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，所述化iK和/或编码化化的 核酸是来自1型单纯瘤疹病毒或2型单纯瘤疹病毒化SV-TK)、VZV、CMV、WV7、HHV7、WV8、 邸V，或者是其中任何一种或多种的功能等效变异体。
[0030] 本发明也可W概括地称为在于本申请说明书中单独地或集合地W两种或更多种 部分、要素或特征的任何或所有组合形式提及或指示的所述部分、要素和特征，并且在本文 提及特定整数时，其在本发明所设及领域中具有已知等效物，运些已知等效物被视为如同 单独地阐述一样并入本文中。
【附图说明】
[0031] 根据W下说明，应在所有新颖方面考虑的本发明的运些和其他方面将变得显而易 见，所述说明是仅参考附图作为实例给出的，在所述附图中： 图1:示出质粒PMTL83155-HSV-tk的图谱。 图2:示出在合成气发酵梭菌转化株中跨越PMTL83155和pM化83155-Hsv-tk化巧化2)上 的革兰氏阳性复制子和Ca巧标记的约1.化b片段的PCR扩增。未被修饰的合成气发酵梭菌 (C)被用作对照。筛选LZ-pMTL83155(P巧日P2)和LZ-pMTL83155-Hsv-tk化1和h2)的各2个菌 落。 图3:示出来自大肠杆菌MG1655的曲eS(Seq ID 13)与来自合成气发酵梭菌的曲eS的逐 对翻译的核巧酸序列比对，其中假定底物特异性区域呈粗体并加下划线。 图4:示出质粒pMTL85151-pheS*的图谱。 图5:示出包含服V-tk的质粒的代表性图谱。 图6:示出包含曲eS的质粒的代表性图谱。 图7 :示出来自利用AM041和AM042的PCR筛选的TAE琼脂糖凝胶电泳结果。泳道1含有 GeneRuler 1化梯(Thermo)。泳道2含有不具有外加模板的PCR。泳道3是具有野生型合成气 发酵梭菌基因组DNA作为模板的PCR，其显示预期野生型产物大小(3137bp)。泳道4-7含有具 有对氯苯丙氨酸和甲讽霉素抗性菌落作为模板的PCR。泳道6示出用来自肺炎克雷伯菌 化.pne皿onia)的下二醇脱氨酶基因对天然下二醇脱氨酶基因的成功双交叉置换的预期大 小（3570bp)的PCR产物。 图8:示出内含子目标位点（2113、287曰、388曰、40〇3、4333和552曰)的基因图谱。也示出引 物结合位点(底部，水平箭头）。 图9A-9C:第II组内含子插入的证实。图9A:433s和388a(暗淡条带），图9B:211s和287曰， 图9C:287a和433。 序列信息的简要说明
[0032]在下文所示的附图之前，本说明书包括与本发明相关的核酸和多肤的序列的细 节。提供W下序列： Seq. ID. 1 :pMK-RQ-Hsv-tk的核酸序列 Seq. ID. 2: pMTL83155-Hsv-tk的核酸序列 Seq.ID.3:pMTL83155 的核酸序列 Seq. ID.4:引物r邱册的核酸序列 Seq. ID. 5:引物catr的核酸序列 Seq. ID.6:引物巧1的核酸序列 Seq. ID. 7:引物巧2的核酸序列 869.10.8:使用引物巧2获得的1^2可]?化83155-1的168诚酷核酸序列 Seq. ID. 9:使用引物巧2获得的LZ-PMTL83155-2的16s rRNA核酸序列 569.10.10:使用引物巧2获得的1^2可]?化83155-113￥-14-1的168诚酷核酸序列 Seq. ID. 11:使用引物巧2获得的LZ-pMTL83155-hsv-tk-2的16s rRNA核酸序列 Seq. ID. 12:编码合成气发酵梭菌的曲eS的核酸序列 Seq. ID. 13:编码大肠杆菌MG1655的曲eS的核酸序列 Seq. ID. 14:编码合成气发酵梭菌的变异曲eS*的核酸序列 Seq. ID. 15:用于证实化eS质粒的存在的正向引物序列-M13F Seq. ID. 16:用于证实化eS质粒的存在的反向引物序列-M13R Seq. ID. 17:合成启动子化heS* Seq.ID.18:pMTL85151-pheS* 的核巧酸序列 Seq. ID. 19:编码1型人类瘤疹病毒（1型单纯瘤疹病毒）的服V-TK的核酸序列 Seq. ID. 20:大肠杆菌MG1655的化eS的氨基酸序列 Seq. ID. 21:合成气发酵梭菌的化eS的氨基酸序列 Seq. ID.22:编码1型人类瘤疹病毒（1型单纯瘤疹病毒）的化化的核酸序列 Seq. ID. 23:编码产气芙膜梭菌(Clostridium perfringens)的化巧的核酸序列 Seq. ID. 24:编码艰难肤梭菌(Peptoclostridium diff icile)的ErmB的核酸序列 Seq. ID. 25:编码大肠杆菌的TetA的核酸序列 Seq ID 26:用于组装pPheS*-ErmB的化eS*盒和具有traj PCR产物的Co化1的核酸序列 Seq ID 27:用于组装pPheS-化抓HXXKp抓H的pPheS片段PCR产物的核酸序列（实施例2) Seq ID 30:用于组装pPheS*-ErmB的PCB102复制起点PCR产物的核酸序列 Seq ID 33:用于组装pPheS*-ErmB的红霉素抗性盒PCR产物的核酸序列 Seq ID 36:用于扩增用于组装pPheS-化抓HXXKp抓H的骨架质粒的pPhes-ErmB模板的 核酸序列 Seq ID 39:用于组装pPheS-化抓HXXKp抓H的上游同源臂PCR产物的核酸序列 Seq ID 42:用于组装pPheS-化抓HXXK地DH的肺炎克雷伯菌下二醇脱氨酶基因 PCR产物 的核酸序列 Seq ID 45:用于组装pPheS-化抓HXXKp抓H的氯霉素乙酷转移酶盒PCR产物的核酸序列 Seq ID 48:用于组装pPheS*-化抓HXXKp抓H的下游同源臂PCR产物的核酸序列 Seq ID 53:合成气发酵梭菌的变异曲eS*的氨基酸序列 Seq ID 54:1型人类瘤疹病毒（1型单纯瘤疹病毒)的氨基酸序列 Seq ID 55:合成气发酵梭菌的伯醇:仲醇脱氨酶的核酸序列 Seq ID 56:内含子打祀区域 Seq ID 57:156F的引物序列 Seq ID 58:939R的引物序列 本发明的其他相关序列描述于本文其他地方。例如，参见实施例2中的表3。
【具体实施方式】
[0033] W下是W-般术语给出的本发明的说明，包括其优选实施方案。根据在下文标题 "实施例"下给出的公开内容进一步阐明本发明，其提供支持本发明的实验数据、本发明的 各种方面的具体实施例和实施本发明的方法。
[0034] 重组微生物的产生可包括将外源核酸引入亲本微生物中，其中在所述外源核酸与 所述微生物的基因组之间发生双交叉重组事件W使得至少一个所希望的遗传变异可引入 所述基因组中。双交叉重组在通常过低的频率下发生W致于不能仅靠偶然来可靠地鉴定整 合体。因此，本发明人认为，选择一个或两个交叉的方法在时间和劳力上都对鉴定频率具有 巨大益处。本发明人在其实验室中已注意到，单交叉重组频率虽然较低，但通过筛选适当数 目的菌落可发现，然而第二交叉事件的情况并非如此。本发明提供通过针对引入亲本微生 物中的外源核酸中存在的条件致死基因产物反向选择来选择第二事件的方法。运意味着， 在反向选择剂存在下仅发生单交叉事件的任何微生物中，条件致死基因产物的表达将杀死 未经历二次交叉事件并释放含有编码反向选择标记的基因的核酸的任何细胞。
[0035] 反向选择标记是已知的。然而