棘胸蛙快速无损伤取样方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛙类分子生物学研究领域，具体的说是涉及一种棘胸蛙快速无损伤取 样方法。
【背景技术】
[0002] 棘胸娃(Quasipaa spinosa)又名石娃、石鸡、石鳞，是我国特有的大型野生娃，是 蛙科系统关系研究的重要类群，对于研究两栖动物的进化和地理分布等都有着重大的科研 价值。棘胸蛙含有高蛋白质、氨基酸、多种维生素和矿物质，肉质脆嫩，味道鲜美，具有清热 解毒、滋补强身、防癌抗癌，而且还具有健肝润肺、清心明目、乌发驻颜、治疗疳疾等药用功 效。
[0003] 近年来，随着棘胸蛙食用及药用价值被人们所认识，棘胸蛙越来越受到消费者的 喜爱，市场需求不断攀升。同时，对棘胸蛙的研究也越来越深入，逐渐从外部形态向蛋白质、 基因等方面转变，尤其对其系统发生关系研究成了近年来研究的热点题。由于人们滥杀和 大量使用农药，污染水质，致使生态环境不断恶化，造成野生棘胸蛙日趋减少。实验室对棘 胸蛙的研究，必不可少的要提取棘胸蛙的肌肉，而传统的棘胸蛙的取样方法大多都是将棘 胸蛙杀掉，取其腿部肌肉，进行DNA提取，近来，也有学者运用剪取棘胸蛙脚趾的方法进行改 良实验，但根据本实验室的实验效果，这种剪脚趾的方法并不能保证棘胸蛙能存活下来，做 了实验证明这种剪脚趾的方法，养殖15天后70 %的棘胸蛙样本会死亡。
[0004] 目前现有的从动物(包括人）口腔中利用粘液、粘膜提取DNA的方法例如有申请号 为201210554081.0的发明《适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法》，其方案 如下：
[0005] 适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于：（1)、样本的预 处理过程为:刮取口腔细胞，将口腔细胞拭子浸入到1.5ml PBS溶液中，震荡混匀，然后再将 液体转入新的Ep管中，采用离心机进行离心2-5min，吸弃上清液，只保留沉淀；（2)、DNA样本 的提取过程为:在样本沉淀中加入350-420ul的溶解液1和10-15ul的20mg/ml蛋白酶K涡旋 混匀30-40min，温度为60-80°C，期间每隔lOmin震荡一次；（3)、DNA样本的纯化处理及检测 过程为:取出Ep管瞬甩，加入180-200ul的溶解液2,60-80°C保温10-15min，将Ep管中的液体 转移到新的1.5ml的Ep管中，采用离心机进行离心，离心6-8min，抽吸上清液到另一 Ep管中， 然后加入等体积的冷的异丙醇，颠倒混匀，采用离心机进行离心5-10min，缓缓倒出上清液， 在干净的吸水纸上倒扣Ep管将其中少量的液体倒出，再加入1 -3ml的70 %乙醇洗涤沉淀，采 用离心机进行离心5-8min，缓缓倒出上清，在干净的吸水纸上倒扣Ep管使其中少量的液体 自然流出，并晾干15-20min，加入30ul的DNA溶解液3，涡旋5秒，瞬甩，再采用离心机离心5-8min，吸取上清液，然后转移到新的Ep管中，采用分光光度计检测0D值。
[0006] 但是，采用上述方法提取棘胸蛙DNA效果不佳。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种棘胸蛙快速无损伤取样方法，以实现环保、 快速、无损伤的提取棘胸蛙DNA。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种棘胸蛙快速无损伤取样方法，包括如下 步骤：
[0009] 1 )、利用灭菌后的塑料膜棉签黏取蛙的口腔粘液；
[0010] 2)、将黏取了蛙口腔粘液的棉签放入至装有190~210ul(较佳为200ul)磷酸缓冲 盐溶液(PBS)的离心管（1.5ml离心管）中，搅拌均匀；从而使口腔粘液中的细胞尽量多融入 磷酸缓冲盐溶液(PBS)中；
[0011] 所述磷酸缓冲盐溶液为PBS(pH7.2-7.40.01M);
[0012] 3)、用试剂盒genomic DNA Mini Kit提取样本DNA(提前将水浴锅或恒温震荡仪升 温至 55±1°C):
[0013] 向步骤2)所得的离心管（即，收集了口腔细胞的离心管）中加入170~190ul(较佳 为180ul)基因消化缓冲液(Genomic Digestion Buffer)和20yL蛋白酶K(Proteinase K)， 充分混合(可用震荡仪震荡确保充分混合），弃棉签;然后，于55±1°C (水浴或金属浴)恒温1 ~2h(从而使细胞完全裂解，上述恒温处理过程中，不时上下颠倒离心管）；
[0014] 4)、将步骤3)的所得物于11000~12000rpm离心3~4min(得位于上层的透明液体 和位于下层的沉淀），将离心所得的透明液体转至另一个离心管（1.5ml离心管）中；
[0015]备注说明：该步骤是为了除去口腔细胞外的其他物质；
[0016] 5)、在步骤4)所得的装有透明液体的离心管中加入19~21ul(较佳为20ul)RNase A，混匀（不时上下来回颠倒混匀）后室温静止孵育1.5~2.5min(较佳为2min);然后再加190 ~210ul(较佳为200ul)细胞溶解缓冲液混匀(不时上下颠倒混匀）；接着再加入190~210ul (较佳为200ul)无水乙醇混匀(上下摇晃5秒即可混匀）；
[0017] 6)、将步骤5)所得的离心管中的全部溶液加入柱式集合管，弃离心管；
[0018] 7)、室温，将步骤6)所得的柱式集合管（即，连同柱式集合管内的溶液）8000~ 12000rpm离心1 ~1 · 5min(较佳为lOOOOrpm离心lmin);
[0019] 8)、取出步骤7)所得的柱式集合管内的吸附柱（即，弃收集管），将该吸附柱放入另 一个柱式收集管中；加480~520ul (500ul)洗涤缓冲液I (Wash Buf f erl)到吸附柱内，室温 8000~12000rpm离心1 ~1 · 5min(较佳为lOOOOrpm离心lmin);
[0020] 9)、取出步骤8)所得的柱式集合管内的吸附柱（即，弃该废液收集管），将该吸附柱 放入另一个柱式收集管中；加480~520ul(500ul)洗涤缓冲液Π (Wash Buffer2)，以10000 ~12000rpm的转速离心3~4min;
[0021] 取出离心所得的吸附柱（即，取出该步骤所得的柱式集合管内的吸附柱，并弃该收 集管)进行下述步骤；
[0022] 10)、将吸附柱转入离心管（1.5ml离心管）中，加25~200ul DNA保存缓冲液 (Genomic Elution Buffer);静止1 ~1 · 5min，室温，以 10000~12000rpm的转速离心 1 ~ 1.5min；
[0023] 离心所得的液体即为提取的DNA。该DNA立即可进行下一步实验，-4 °C短时间保存 或放-20°C长期保存。
[0024] 备注说明：本发明的上述所有步骤中，没有明确告知温度的，均为在室温下进行。
[0025] 作为本发明的棘胸蛙快速无损伤取样方法的改进:将步骤10)离心所得的吸附柱 重复进行步骤10)1~3次。目的是为了获取更多的DNA。
[0026] 作为本发明的棘胸蛙快速无损伤取样方法的进一步改进:所述步骤1)中，灭菌后 的塑料膜棉签的制备方法为：
[0027] 取顶部带有棉花头的棉签，先将塑料膜进行高压湿热蒸汽的灭菌处理（即，将塑料 膜于0.1 MPa压力的水蒸汽中灭菌20~40分钟）；得灭菌塑料膜；
[0028] 再将灭菌塑料膜包裹在棉签上的棉花头上后进行高压湿热蒸汽灭菌（即，于 0.1 MPa的压力的水蒸汽中灭菌20~40分钟），得灭菌后的塑料膜棉签。
[0029] 备注说明：塑料膜要求能包裹住整个棉花头，且要求能耐受上述高压湿热蒸汽的 高温灭菌。
[0030] 本发明的步骤中所接触棘胸蛙DNA的器具，均经过高温灭菌;本发明的塑料膜棉签 可运用一次性自制棉签进行。
[0031] 本发明中所使用的基因消化缓冲液（Genomic Digestion Buffer)、蛋白酶K (Proteinase K)、包括各种洗涤缓冲液、DNA保存缓冲液等，均由试剂盒genomic DNA Mini Kit提供。
[0032] 在本发明中，采用塑料膜棉签粘取蛙的口腔粘液，具有如下优点：下层的棉花（即， 棉签上的棉花头)有助于保护棘胸蛙口腔，上层的灭菌塑料膜可起到防止口腔细胞粘附于 棉花头上，便于口腔细胞脱落至装有PBS离心管中，利于消解。
[0033] 本发明的有益效果是:本发明通过棘胸蛙空腔表皮细胞及分泌粘液的特点，运用 自制的灭菌塑料膜棉签，对棘胸蛙口腔内细胞进行取样，将取出的口腔细胞放入离心管，加 入roS，使口腔细胞充分融入roS中，用试剂盒genomic DNAMini Kit提取样本DNA。将取样过 的棘胸蛙重新放入仿生态养殖池中，养殖20天后，成活率达95 %以上。
[0034] 本发明的棘胸蛙快速无损伤取样方法具有对棘胸蛙机体损伤小、取样速度快、死 亡率低、提取DNA效果好、方法简便、易于操作等优点，本方法运用到棘胸蛙DNA的提取过程 中，可以为棘胸蛙取样提供一种新方法，新思路。这种棘胸蛙快速无损伤取样方法与传统的 杀蛙取肌肉及取脚趾相比，既节约资源，又保护环境，而且根据实验结果表明，提取的DNA效 果更佳。本方法运用到棘胸