一种促进微生物产漆酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种促进微生物产漆酶的方法，属于微生物发酵领域。本发明方法包括在阿魏蘑等高等真菌液态发酵过程中，添加β?胡萝卜素及其它部分类胡萝卜素物质或者产β?胡萝卜素微生物以及含有β?胡萝卜素及其它部分类胡萝卜素物质的提取物来提高漆酶的活性，提高幅度最高可达不添加的12倍。此方法简单、可提高漆酶活性的幅度较大，具有良好的应用前景。
【专利说明】
一种促进微生物产漆酶的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种促进微生物产漆酶的方法，属于微生物发酵领域。
【背景技术】
[0002] 漆酶(苯二酚:氧氧化还原酶，EC 1.10.3.2)是一类在自然界中广泛分布的含铜多 酚氧化酶，能直接催化酚类、芳胺类等多种有机底物发生氧化反应。漆酶能对多种底物进行 单电子氧化，这使其在制浆造纸、废水处理、有机合成等多个工业领域有诱人的应用前景。
[0003] 在自然界中丝状真菌，特别是担子菌和子囊菌是主要的漆酶合成菌，但是担子菌 和子囊菌较低的漆酶产量不能满足日益增长的工业需求。担子菌和子囊菌发酵法合成漆酶 的水平除了与菌种、营养物质、培养条件有关外，还受一些促进因子的影响，其中铜离子是 漆酶活性中心的组成成分，也是漆酶合成的一种有效促进因子。同时，某些小分子芳香族化 合物由于结构与木质素结构单元类似，也可以作为漆酶合成的促进因子，在研究中被广泛 用于提高漆酶产量，如愈创木酚、藜芦醇、香兰素和肉桂酸等。但是当前已发现的有效的促 进因子，通常价格昂贵，这在一定程度上提高了漆酶生产成本，而且添加铜离子和芳香化合 物会污染环境，发酵结束后，发酵液需要脱毒处理，不利于漆酶产业化的应用。因此，寻找与 发现经济、安全、高效的新型促进因子，是促进漆酶生产的一个重要方向，也将为微生物发 酵产漆酶的实际应用和工业化生产注入新的可能与活力。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的首先是提供一种微生物产漆酶的促进剂。
[0005] 所述促进剂的有效成分是类胡萝卜素。包括类胡萝卜素中的一种或者几种的混合。
[0006] 所述微生物主要包括产漆酶的丝状真菌。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述促进剂的有效成分是β_胡萝卜素和/或番茄红 素。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述丝状真菌包括但不限于阿魏蘑、变色栓菌、粗皮 侦U耳、灵芝。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述促进剂可以是类胡萝卜素、产类胡萝卜素的微生 物或者含有类胡萝卜素的提取物。
[0010] 本发明还提供一种促进微生物产漆酶的方法，是在微生物产漆酶的过程中添加所 述微生物产漆酶的促进剂。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述微生物主要包括产漆酶的丝状真菌。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述丝状真菌包括但不限于阿魏蘑（Pleurotus ferulae)、变色检菌（Trametes versicolor)、粗皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、灵芝 (Ganoderma Lucidum)。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述微生物产漆酶的促进剂的添加形式可以是类胡 萝卜素化合物或者含有类胡萝卜素的混合物;添加量和添加时间可以根据微生物产漆酶的情 况进行调整或者选择。所述含有类胡萝卜素的混合物可以是产类胡萝卜素的活性微生物或者 灭活菌体，或者含有类胡萝卜素的提取物等。所述产类胡萝卜素的活性微生物包括但不限于 胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa)、红发夫酵母（Phaffia rhodozyma)、锁掷酵母 (Sporidiobolus pararoseus)、粘红酉孝母（Rhodotorula glutinis) 〇
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所涉及的菌种均为本领域常见菌种；菌种培养方法 均可为本领域常用培养方法。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，类胡萝卜素的添加量为0.1-30mg/L，添加方法为称取 定量类胡萝卜素溶于丙酮中，溶液过有机滤膜除菌，得到的无菌溶液通过减压旋转蒸发仪上 蒸干，再将上述物质溶于已灭菌的植物油中，分别将油溶物添加微生物产漆酶的发酵培养 基中。
[0016] 所述含有类胡萝卜素的混合物可以是产类胡萝卜素的活性微生物或者灭活菌体，或 者含有类胡萝卜素的提取物。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，添加产类胡萝卜素的活性微生物是培养产类胡萝卜素 的微生物，在产漆酶的微生物的发酵过程中，添加适量微生物菌体，共培养一段时间。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，添加产类胡萝卜素的灭活菌体是将培养好的产类胡 萝卜素的微生物在70°C下水浴lh，在产漆酶的微生物的发酵过程中，添加适量灭活菌体，继 续培养一段时间。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，添加含有类胡萝卜素的提取物是收集菌体，反复冻融 使菌体破碎，然后70°C热处理lh，离心后去上清，然后在沉淀中加入一定体积的植物油，轻 微振荡提取lh，即获得油提物，在上述操作过程中，保证油提物无菌;将油提物添加至发酵 体系中并继续发酵一段时间。
[0020] 本发明的优点：
[0021] 1、添加形式具有多样性。即可直接添类胡萝卜素，也可添加含有类胡萝卜素的提取 物或者添加产类胡萝卜素的微生物，也可添加经过处理的产类胡萝卜素的微生物。
[0022] 2、作用范围广泛。添加的物质对多种微生物产漆酶的均具有促进作用。
[0023] 3、促进作用显著。本发明发现添加类胡萝卜素或者产类胡萝卜素的酵母都可使阿魏 蘑所产漆酶的活性提高2倍以上，对其他高等真菌所产漆酶的活性提高幅度可达12倍。
【具体实施方式】
[0024]漆酶活性的测定方法：
[0025] 以ABTS为底物，在lmL反应体系中，含有880yL 0. lmol · L-1乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.5)，100yL终浓度lmmol · I/1的ABTS底物和20yL稀释一定倍数的粗酶液(须使最终的吸光 值在0.2-0.8之间），在30°C下反应5min后在420nm下测定其吸光值（以热灭活的酶液为空白 对照）。
[0026]漆酶的酶活力定义:在上述反应条件和反应体系下，每分钟氧化lwnol ABTS底物 所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
[0027] 酶活力按以下公式计算：
[0028]
[0029]心一空白对照的吸光值；
[0030] a2-反应后的吸光值；
[0031] t-反应的时间；
[0032] ε-ABTS的摩尔吸光系数，为3.6X104L · mol-1 · cm-、
[0033] β_胡萝卜素的测定方法：
[0034] (1)标准溶液的配置:精确称取2mg的β-胡萝卜素或番茄红素标准品，用氯仿定容至 10mL的棕色容量瓶中，-20摄氏度避光保存备用。
[0035] (2)样品的制备：a发酵液中β-胡萝卜素或番茄红素含量测定：取80ml发酵液，加 80ml氯仿振荡提取15分钟，分离后将氯仿溶液置于减压旋转蒸发仪上浓缩至10ml，制备成 含胡萝卜素或番茄红素的氯仿提取液;b胶红酵母中β-胡萝卜素含量测定:将胶红酵母菌体 冷冻干燥后，称取lg菌体于研钵中充分研磨破碎，转移至5mL ΕΡ管中，加入2mL的氯仿振荡 提取15min，离心后取上清氯仿定容至10mL，制成含β-胡萝卜素的氯仿提取液，；c共培养体系 中胡萝卜素含量测定:取150ml发酵液，离心后去上清，菌体沉淀经充分研磨破碎后加80ml 氯仿振荡提取15分钟，分离后将氯仿溶液置于减压旋转蒸发仪上浓缩至10ml，制备成含β-胡萝卜素的氯仿提取液。
[0036] (3)进行LC-MS检测。色谱条件：米用WatersAcquity UPLC BEH C18柱（2 · 1mm X 100mm)分离，WatersAcquity PDA检测。流动相:A相：10/90的乙腈/异丙醇;B相：乙腈。柱温 45°C，流速0.3mL.mL-S进样量2yL。质谱条件：所用仪器WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS; 离子化方式:ESI+;毛细管电压:3.5kV，锥孔电压:30V;脱溶剂气温度:400°C ;脱溶剂气流速 700L · Hr-1;碰撞能量:6eV;质量范围：100-1500;检测电压1800V。
[0037] (4)β_胡萝卜素含量按以下公式计算：
[0038] m: 10ml样品中β-胡萝卜素或番茄红素含量(mg)
[0039] m1:标样进样体积中β-胡萝卜素含量或番茄红素 (mg)
[0040] m2:样品称样质量(mg)
[0041 ] A1:标样峰面积
[0042] A2:样品峰面积
[0043] Vi:样品进样质量(μL)
[0044] V2:样品进样体积(ml)
[0045] 实施例1:添加 β-胡萝卜素和番茄红素提高阿魏蘑所产漆酶的活性
[0046]麸皮基本培养基(g · I/1):葡萄糖20,玉米粉10,麸皮粉10，K2S〇4〇.1742,初始ρΗ = 9.0，用于阿魏蘑的种子培养和液体发酵培养。
[0047] 阿魏蘑种子培养:取2块0.5cm2大小的菌块，接种于80mL种子培养基中，150r · min -\25°(：培养 7d。
[0048]阿魏蘑发酵培养：向150mL麸皮基本培养基中加入3% (体积分数）的种子培养基， 150r · min-\25°(：培养7d。
[0049] 分别称取4mgi3-胡萝卜素和4mg番茄红素分别溶于30mL丙酮中，溶液过0.22微米的 有机滤膜除菌，得到的无菌溶液移至灭菌的50ml离心管中，用除菌封口膜封住管口，置于减 压旋转蒸发仪上蒸干。将上述物质溶于已灭菌的l.OmL植物油中，分别将lmL油溶物添加至 阿魏蘑发酵2d的培养基中继续发酵5d。对照组添加不含β-胡萝卜素或番茄红素的植物油。发 酵结束后，进行酶活测定。发酵过程中测定发酵液中β-胡萝卜素、番茄红素的含量，结果表明 发酵初始及发酵第1、2、3、4天，β-胡萝卜素的含量分别是25.37mg/L、13.13mg/L、6.90mg/L、 1.66mg/L、0mg/L，番前红素的含量分别是 24.83mg/L、3 · 22mg/L、1 · 59mg/L、0 · 31mg/L、0mg/ L〇
[0050] 与对照组相比，采用实施例1的方法，添加 β-胡萝卜素后漆酶酶活提高至7600U · L 一S是对照组的2.1倍;添加番茄红素后漆酶酶活提升至7000U · L一、
[0051] 实施例2:添加产β-胡萝卜素的胶红酵母提高阿魏蘑所产漆酶的活性
[0052] Yro液体培养基(g · L-蛋白胨20,酵母膏10,葡萄糖20，ρΗ自然，用于胶红酵母种 子培养。
[0053]胶红酵母种子培养：用接种环划取适量胶红酵母，接种于SOmLYH)液体培养基中， 200r · min-\30°(：培养48h。
[0054]阿魏蘑采用实施例1中的培养方法。
[0055]阿魏蘑与胶红酵母共培养:在阿魏蘑单培养48h后，接种3 % (体积分数）的胶红酵 母种子，继续培养5d。对照组中不添加胶红酵母，发酵结束后，分别进行酶活测定。发酵过程 中测定共培养体系(发酵液和菌体)中胡萝卜素，结果表明共培养第1、3、5天，β-胡萝卜素的 含量分别是〇 · 〇〇 15mg/L、0 · 0040mg/L、0 · 013mg/L。
[0056] 采用实施例2的方法，对照组漆酶活性只有3500U · I/1，添加胶红酵母的实验组漆 酶活性达到了 7630U · L一、
[0057] 实施例3:添加产β-胡萝卜素的红法夫酵母、锁掷酵母、粘红酵母提高阿魏蘑所产漆 酶的活性
[0058]阿魏蘑采用实施例1中的培养方法。
[0059] 红法夫酵母、锁掷酵母、粘红酵母采用实施例2中胶红酵母的培养方法。
[0060] 阿魏蘑与红法夫酵母、锁掷酵母、粘红酵母共培养采用实施例2中阿魏蘑与胶红酵 母共培养方法。
[0061 ] 其中实验组中酵母接种量分别为1.25mL、2.5mL、5mL和1 OmL，对照组为不添加任何 酵母。
[0062]在阿魏蘑单培养第2d接入2.5mL的红法夫酵母种子液继续培养5d后，漆酶酶活约 是单培养的2倍。
[0063]阿魏蘑与锁掷酵母共培养后，锁掷酵母接种量为2.5mL、5mL和10mL时均对阿魏蘑 产漆酶有明显促进作用，且当接种量为2.5mL时漆酶酶活最高，达到约10000U · Γ1，且此条 件共培养过程中第1、3、5天β-胡萝卜素的含量分别为0 · 027mg/L、0 · 036mg/L、0 · 040mg/L。 [0064]阿魏蘑与粘红酵母共培养后，当酵母接种量为1.25mL时，漆酶酶活最高，约为 7161U · L-、其中对照组酶活约为3700U · L-1。
[0065]实施例4:添加经热处理的产β-胡萝卜素胶红酵母对阿魏蘑所产漆酶活性的影响 [0066]按实施例1的方法对阿魏蘑进行培养。
[0067]按实施例2的方法对胶红酵母进行培养。将获得的胶红酵母菌体分别在55°C、60 °C、65°C和70°C下水浴处理lh，高温灭菌组为将胶红酵母菌体在121°C下灭菌20min。对照组 1为不添加胶红酵母，对照组2为添加未经处理的胶红酵母。以平板涂布的方式考察不同热 处理温度的效果。发现55°C时热处理lh后，胶红酵母菌落数减少50%以上，且随着温度的升 高，菌落数迅速降低，当70°C热处理lh和高温灭菌处理，均可以将胶红酵母细胞全部杀死。 [0068] 在阿魏蘑培养48h后分别加入热处理过和高温灭活的湿重1.5g、3.0g、4.5g、6.0g 的酵母菌体，继续培养5d后进行酶活测定。发现添加经55-70Γ热处理的胶红酵母均可提高 阿魏蘑所产漆酶的活性，其中添加70°C热处理的非活性胶红酵母可以提高漆酶酶活，且随 着酵母添加量的增加漆酶酶活不断升高，添加量为6g时的酶活水平与添加未处理胶红酵母 (活酵母接种量3% )时相当，达到7260U · L'
[0069] 而同样添加高温灭活的菌体至阿魏蘑发酵培养基中，漆酶酶活却几乎没有变化， 与不添加胶红酵母组酶活相差不多，可能是高温灭菌已将胡萝卜素破坏。
[0070] 实施例5:添加 β-胡萝卜素的的提取物对阿魏蘑所产漆酶活性的影响 [0071 ]按实施例1的方法对阿魏蘑进行培养。
[0072]按实施例2的方法对胶红酵母进行培养。
[0073]在无菌条件下收集4g(湿重)胶红酵母菌体，等体积加入无菌水反复冻融，使菌体 破碎，然后70 °C热处理lh。离心后去上清，在沉淀中加入一定体积的灭菌植物油，轻微振荡 提取lh，即获得胶红酵母的油提物。将提取物添加到发酵至第2d的阿魏蘑发酵培养基中，继 续培养5d后进行酶活测定。对照组添加等量的植物油。
[0074] 添加311^的植物油提取物后，漆酶酶活提高35%左右，达到约48501]·!/1。
[0075] 实施例6:添加产β_胡萝卜素的胶红酵母对其他高等真菌产漆酶的影响
[0076] 选取变色栓菌、粗皮侧耳和灵芝等研究较多的产漆酶高等真菌，在其培养过程中 添加胶红酵母共培养。
[0077] 按实施例2的方法对胶红酵母进行培养。
[0078] 变色栓菌、粗皮侧耳和灵芝的培养基及培养方式为:麸皮1% ;玉米粉1% ;葡萄糖 2% ;MgS〇4 · 7Η20 0.2% ;ΚΗ2Ρ〇4〇.3% ;变色栓菌、粗皮侧耳、灵芝的一级种子生长时间分别 为5(1、6(1、8(1，真菌接种量为3%，培养体系为在50〇1^三角瓶中装液量15〇111匕同样在培养4811 后接种胶红酵母，酵母接种量分别为〇、1.5%、3%、6%，共培养发酵5天后进行漆酶酶活测 定。
[0079] 添加胶红酵母均能提高变色栓菌、粗皮侧耳、灵芝所产漆酶的活性。在不添加胶红 酵母时，变色栓菌所产漆酶酶活最高达到18731]*1/ 1，当添加量为6%时可达37971]*1/1;当 胶红酵母添加量为3%时，粗皮侧耳所产漆酶酶活最高达到1147U · I/1，约是不添加时的4 倍;灵芝在不添加胶红酵母时漆酶酶活只有80.3U · I/1，随着胶红酵母添加量的提高，漆酶 酶活也随之升高，最高酶活为982.8U · Γ1，约是不添加时的12倍。
[0080] 以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多 改进和变化而不会背离本发明的基本精神，如利用分子生物学技术，构建产β-胡萝卜素或者 番茄红素的基因工程菌或者从植物中提取的含有β-胡萝卜素或番茄红素的物质等添加到阿 魏蘑等高等真菌产漆酶的发酵过程中，亦可起到提高漆酶活性的作用。因此，所有这些变化 和改进都在本发明的保护范围之内。
[0081] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种微生物产漆酶的促进剂，其特征在于，有效成分是类胡萝卜素，包括类胡萝卜素中 的一种或者几种的混合。2. 根据权利要求1所述的一种微生物产漆酶的促进剂，其特征在于，所述微生物主要包 括产漆酶的丝状真菌，包括但不限于阿魏蘑、变色栓菌、粗皮侧耳、灵芝。3. 根据权利要求1所述的一种微生物产漆酶的促进剂，其特征在于，有效成分是β_胡萝 卜素和/或番茄红素。4. 根据权利要求1-3任一所述的一种微生物产漆酶的促进剂，其特征在于，所述促进剂 是类胡萝卜素，或者含有类胡萝卜素的混合物，或者产类胡萝卜素的微生物，或者含有类胡萝卜 素的提取物。5. -种促进微生物产漆酶的方法，其特征在于，是在微生物产漆酶的过程中添加权利 要求1所述微生物产漆酶的促进剂。6. 根据权利要求5所述的一种促进微生物产漆酶的方法，其特征在于，所述微生物主要 包括产漆酶的丝状真菌;所述丝状真菌包括但不限于阿魏蘑(Pleurotus ferulae)、变色栓 菌（Trametes versicolor)、粗皮侧耳（Pleurotus ostreatus)、灵芝（Ganoderma Lucidum)〇7. 根据权利要求5所述的一种促进微生物产漆酶的方法，其特征在于，所述微生物产漆 酶的促进剂的添加形式是类胡萝卜素化合物或者含有类胡萝卜素的混合物;添加量和添加时 间根据微生物产漆酶的情况进行调整或者选择。8. 根据权利要求7所述的一种促进微生物产漆酶的方法，其特征在于，所述含有类胡萝 卜素的混合物是产类胡萝卜素的活性微生物或者灭活菌体，或者含有类胡萝卜素的提取物。9. 根据权利要求8所述的一种促进微生物产漆酶的方法，其特征在于，所述产类胡萝卜 素的活性微生物包括但不限于胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa)、红发夫酵母 (Phaffia rhodozyma)、锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus)、粘红酵母（Rhodotorula glutinis) 〇10. 根据权利要求8所述的一种促进微生物产漆酶的方法，其特征在于，添加产类胡萝卜 素的活性微生物是培养产类胡萝卜素的微生物，在产漆酶的微生物的发酵过程中，添加适量 产类胡萝卜素的活性微生物的菌体，共培养一段时间。
【文档编号】C12R1/645GK105907731SQ201610507284
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】丁重阳, 郭超林, 赵丽婷, 鲁冰心, 王琼, 彭林, 陆健, 顾正华, 石贵阳
【申请人】江南大学