nes)、酪下酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum)、尤里氏梭菌 (Clostridium uliginosum)、突男P梭菌（Clostridium ultunense)、多毛梭菌（Clostridium villosum)、维利梭菌（Clostridium viride)、解木素梭菌（Clostridium xylanol}ft;ixum)、 食木聚糖梭菌（Clostridium 巧lanovorans)、双酶梭菌（Clostridi皿 bife;rmen1:ans)和生 抱梭菌。
[0049] 在一个特定实施方案中，所述亲本生物体选自产乙酸梭菌属群组。在一个特定实 施方案中，所述亲本微生物选自包含物种合成气发酵梭菌、永达尔梭菌、拉氏梭菌、食一氧 化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌和克氏梭菌的产乙酸 一氧化碳营养型生物体的群组。
[0050] 在一个实施方案中，所述亲本微生物选自包含物种合成气发酵梭菌、永达尔梭菌 和"拉氏梭菌"和相关分离株的一氧化碳营养型梭菌群集。运些包括(但不限于)菌株合成气 发酵梭菌JAI-1T(DSM10061 )((Abrini ,Naveau和Nyns，1994)、合成气发酵梭菌LBS1560 (DSM19630)(W0/2009/064200)、合成气发酵梭菌 LBS156UDSM23693)、永达尔梭菌 PETCT (DSM13528=ATCC 55383) (Tanner,Miller和化ng, 1993)、永达尔梭菌邸I-2(ATCC 55380) (美国专利5,593,886)、永达尔梭菌C-Ol(ATCC 55988)(美国专利6,368,819)、永达尔梭菌 0-52(ATCC 55989)(美国专利6,368,819)或。拉氏梭菌PllT" (ATCC BAA-622KW0 2008/ 028055)和相关分离株如"克氏梭菌"（美国专利2011/0229947)和其突变菌株如永达尔梭菌 0TA-l(Tirad〇-Acevedo 0.使用永达尔梭菌从合成气生产生物乙醇（Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium I jungdahlii).博：t论文，北卡罗 莱纳州立大学（No;rth Carolina Sl:ate University),2010)。
[0化1] 运些菌株形成梭菌rRNA群集I内的子群集(Collins等，1994)，其在16S rRNA基因 水平上具有至少99 %同一性，但如通过DNA-DNA再结合和DNA指纹实验(WO 2008/028055、美 国专利2011/0229947)确定为不同物种。
[0052]运个群集的菌株是由共同的特征限定，具有类似的基因型和表型，并且它们都共 有相同的能源节约和发酵代谢模式。运个群集的菌株缺乏细胞色素并且通过化f复合物节 约能源。
[0化3] 运个群集的所有菌株具有约4.2MBp的基因组大小(K6pke等，2010)和约32摩尔％ 的GC组成(Abrini等，1994; Kopke等，2010 Shnner等，1993) (WO 2008/028055;美国专利 2011/0229947)，和编码Wood-Ljungdahl途径酶(一氧化碳脱氨酶、甲酯-四氨叶酸合成酶、 亚甲基-四氨叶酸脱氨酶、甲酯-四氨叶酸环水解酶、亚甲基-四氨叶酸还原酶和一氧化碳脱 氨酶/乙酷基-CoA合成酶）、氨化酶、甲酸脱氨酶、化f复合物(rnfCDGEAB)、丙酬酸:铁氧还蛋 白氧化还原酶、醒：铁氧还蛋白氧化还原酶的保守的必要关键基因操纵子（KSpke等， 2010，2011)。已发现负责气体吸收的Wood-Uungdahl途径基因的组织和数目在所有物种中 相同，但核酸和氨基酸序列不同（K6pke等，2011)。
[0054] 所述群集的菌株都具有类似的形态和大小(对数生长的细胞为0.5-0.7 X 3-5WI1)， 是嗜中溫(最佳生长溫度为30-37°C )和严格厌氧菌(Abrini等，1994;化nner等，1993) (WO 2008/028055)。此外，它们都共有相同的主要系统发育性状，例如相同的抑范围(pH 4-7.5， 最佳初始抑为5.5-6)，在含CO气体上W相似生长速率强烈自养生长，和具有乙醇和乙酸作 为主要发酵最终产物的代谢分布，其中在某些条件下形成少量的2,3-下二醇和乳酸 (Abrini等，1994; KGpke等，2011; I^nner等，1993) (WO 2008/028055)。对于所有物种已观 巧蝴吗I噪产生。然而，所述物种在各种糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖）、酸(例如葡糖酸盐、巧樣 酸盐）、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)或其他底物(例如甜菜碱、下醇）的底物利用中不同。发 现一些物种对某些维生素(例如硫胺素、生物素)具营养缺陷性，而其他没有。在一系列运些 生物体中已显示簇酸还原成其相应醇(Perez ,Richter ,Lof 1:us和Angenent ,2012)。
[0055] 因此，所述性状对一种生物体如合成气发酵梭菌或永达尔梭菌不具特异性，而是 一氧化碳营养型乙醇合成梭菌的一般性状。本发明可W预期不仅在运些菌株间，而且在所 有梭菌物种间起作用，但性能可能存在差异。
[0056] 在特定实施方案中，所述亲本微生物选自包含合成气发酵梭菌、永达尔梭菌和拉 氏梭菌的群组。在一个实施方案中，所述群组还包含克氏梭菌。在一个特定实施方案中，所 述亲本微生物是合成气发酵梭菌DSM23693。
[0057] 亲本微生物可能含有或可能不含编码苯丙氨酸tRNA合成酶的核酸或表达苯丙氨 酸tRNA合成酶。
[005引在整个本说明书中，对于化eS、变异化eS和化化蛋白质/肤和编码其的核酸提供示 例性序列信息。提供运种信息W鉴定可应用于本发明的示例性蛋白质/肤和核酸并且允许 本领域技术人员在无过度实验的情况下实施本发明的特定实施方案。应了解，在不同微生 物之间的核酸和氨基酸序列可能不同。因此，本发明不应理解为局限于运些特定实施方案， 而是扩展至具有不同序列但是基本上能够执行相同功能的蛋白质/肤和核酸。对于化eS，所 希望的功能(作为苯丙氨酸tRNA合成酶的亚基)是用苯丙氨酸将tRNAPhB氨基酷化。对于变异 的化eS，所希望的功能(作为苯丙氨酸tRNA合成酶的亚基)是用苯丙氨酸类似物将tRNA氨基 酷化。对于化化，所希望的功能是催化如下反应： Thd+ATP一TMP+ADP 其中化d是脱氧胸巧，ATP是5 ' -S憐酸腺巧，TMP是5 憐酸脱氧胸巧并且ADP是5 二憐 酸腺巧。
[0059]通常，运些替代或变异蛋白质/肤将与本文示例的PheS(包括变异PheS)或化化蛋 白具有至少约75%氨基酸序列相似性。在特定实施方案中，运些替代蛋白将与本文示例的 PheS(包括变异化eS)或化iK具有至少约80%、85%、90%、95%或99%序列相似性。在特定 实施方案中，运些替代蛋白将与本文示例的PheS(包括变异化eS)或化化具有至少约75%、 80 %、85 %、90 %、95 %或99%序列同一性。在核酸水平下，编码运些替代或变异蛋白的基因 通常将与编码本文示例的化eS(包括变异化eS)或化化的核酸具有至少约75%序列同源性。 在特定实施方案中，运些变异或替代核酸将与编码本文示例的化eS(包括变异化eS)或化化 的核酸具有至少约80%、85%、90%、95%或99%序列同源性。在一个特定实施方案中，运些 核酸将与编码本文示例的化eS(包括变异化eS)或化化的核酸具有至少约75%、80%、85%、 90%、95%或99%序列同一性。如所述的替代或变异核酸或蛋白质/肤可在本文称为"功能 等效变异体"。
[0060] 此外应理解，PheS、变异曲eS或化化的功能等效变异体无需与其为变异体的蛋白 质/肤具有相同活性水平。所需要的仅是保持一定程度的所需活性。本领域技术人员将知晓 用于评估PheS、变异PheS或化iK的活性的测定法。然而，举例来说:可使用测量氨基酷化的 方法来测试Phe S的功能或活性。作者使用氨基酷化速度和地eS的动力学参数来测试在利 用苯丙氨酸时PheS的活性变化化ast等，1991(分子生物学杂志（J. Mol. Biol )222:99-124))。可通过使用关于培养或生长微生物已知的方法观测在苯丙氨酸的毒性类似物的存 在下的生长来进行变异PheS的功能或活性化ast等，1991(分子生物学杂志（J.Mol.Biol) 222:99-124))。可使用如化 ockenbrough 等（核医学生物学（Nucl Med Biol. )2007,34(6): 619-23)和化nsson和McIvoH分析生物化学(Anal Biochem. )1991,199(2) :232-7)所述的 活性测定法或利用如例如来自BioVendoH目录号901/902)的市售化ISA试剂盒来测试化化 的功能或活性。
[0061] 对于"转化"亲本微生物的提及应宽泛地理解为包括将外源核酸转移或引入本领 域中已知的微生物中的任何方法。举例来说，"转化"包括(但不限于)转染、转导、结合和电 穿孔。 本发明的方面和实施方案
[0062] 本发明提供化iK和/或化eS在用于从亲本微生物产生重组微生物的方法中作为反 向选择标记的用途。其还提供编码化ik和/或化eS的核酸、包含所述核酸的核酸载体，和所 述核酸和/或质粒用于从亲本微生物产生重组微生物的用途。另外，本发明提供从亲本微生 物产生重组微生物的方法。根据本发明，所述亲本微生物是如上文所述的梭菌属，并且所述 PheS相比于野生型化eS包括至少一个变异W使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用 苯丙氨酸类似物将tRNA氨基酷化。 PheS
[0063] PheS是双亚基蛋白苯丙氨酸tRNA合成酶的a亚基。苯丙氨酸tRNA合成酶负责用苯 丙氨酸将tRNAPhB氨基酷化，运对于细胞中的蛋白质产生是关键的。所述酶催化苯丙氨酸乙 酷化成其同源tRNA。通过延伸因子将所得tRNAPhe递送至核糖体，随后结合至mRNA上存在的 其同源反密码子。一旦结合，氨基酸就共价连接至其前面的氨基酸，从而增加肤链。
[0064] 本发明的PheS是相比于野生型PheS包括至少一个变异W使得在使用中苯丙氨酸 tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酷化tRNA者。将苯丙氨酸类似物并入细胞蛋白 中导致不稳定的或非功能性蛋白。因此，包括变异化eS的任何细胞通常将不能够存活。
[0065] 变异化eS的基础野生型化eS可能来自任何适当来源，包括任何数目的不同自复制 生物体，例如植物、动物、真菌和微生物。在一个特定实施方案中，所述PheS是来自微生物。 在一个实施方案中，所述化eS是来自梭菌属或者是其功能等效变异体。仅举例来说，所述梭 菌属可包括：
[0066] 合成气发酵梭菌、永达尔梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭 菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌、克氏梭菌、丙酬下醇梭菌、拜氏梭菌、糖乙酸多下醇梭 菌、糖下酸梭菌、热纤梭菌、解纤维梭菌、植物发酵梭菌、己斯德梭菌、科氏梭菌、艰难梭菌、 肉毒梭菌、生抱梭菌、产气芙膜梭菌、丙酬下醇梭菌、溶酸梭菌、耐酸梭菌、尿酸梭菌、耐氧梭 菌、阿卡氏梭菌、奥德氏梭菌、奥吉氏梭菌、解木聚糖梭菌、碱纤维梭菌、氨基戊酸梭菌、苦杏 仁巧梭菌、北极梭菌、阿根廷梭菌，金黄下酸梭菌、己氏梭菌、肉毒梭菌、鲍曼梭菌、下酸梭 菌、拜氏梭菌、尸毒梭菌、卡氏梭菌、食一氧化碳梭菌、肉梭菌、隐藏梭菌、速生梭菌、解纤维 梭菌、纤维素梭菌、瘤胃梭菌、梭状样梭菌、球形梭菌、匙形梭菌、耳蜗形梭菌、肠道梭菌、艰 难梭菌、二醇梭菌、双抱梭菌、德雷克氏梭菌、坚初梭菌、醋梭菌、橘诈梭菌、费新尼亚梭菌、 尔维梭菌、菲氏梭菌、蚁酸醋酸梭菌、戈氏梭菌、乙二醇梭菌、甘氨酸溶根瘤梭菌、溶血梭菌、 嗜面梭菌、破伤风梭菌、产气芙膜梭菌、植物发酵梭菌、梭状梭菌、解多糖梭菌、包氏梭菌、丙 酸梭菌、蛋白溶解梭菌、解航梭菌、嗜冷梭菌、紫色梭菌、普瑞梭菌、腐化梭菌、腐败梭菌、橡 树梭菌、奎尼梭菌、多枝梭菌、玫瑰色梭菌、糖下酸梭菌、解糖梭菌、糖乙酸多下醇梭菌、撒下 岛梭菌、粪堆梭菌、斯氏梭菌、争论梭菌、类产气芙膜梭菌、类腐败梭菌、帕斯崔梭菌、己斯德 梭菌、诺维氏梭菌、败毒梭菌、溶组织梭菌、径基苯甲酸梭菌、海利氏梭菌、无害梭菌、科氏梭 菌、乳酸发酵梭菌、拉库氏梭菌、拉腊氏梭菌、兰托氏梭菌、缓腐梭菌、食甲氧苯梭菌、甲基戊 糖梭菌、硝基苯酪梭菌、诺维氏梭菌、海梭菌、乳清酸梭菌、草酸梭菌、第=梭菌、破伤风梭 菌、破伤风形梭菌、热醋酸梭菌、热自养梭菌、嗜热碱梭菌、热下酸梭菌、热纤梭菌、热粪梭 菌、热硫化氨梭菌、热解糖梭菌、帕姆酒耐热梭菌、嗜热溶纸梭菌、热解糖梭菌、热产硫梭菌、 酪下酸梭菌、尤里氏梭菌、突那梭菌、多毛梭菌、维利梭菌、解木素梭菌、食木聚糖梭菌、双酶 梭菌和生抱梭菌。
[0067] 在某些实施方案中，所述化eS是来自选自梭菌属群组的微生物或者是其功能等效 变异体。在一个实施方案中，所述化eS是来自选自产乙酸梭菌属群组的微生物或者是其功 能等效变异体。在一个特定实施方案中，PheS是来自选自包含物种合成气发酵梭菌、永达尔 梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭 菌和克氏梭菌的产乙酸一氧化碳营养型生物体群组的微生物，或者是其中任何一种或多种 的功能等效变异体。
[0068] 在一个实施方案中，PheS选自上文已经描述的包含物种合成气发酵梭菌、永达尔 梭菌和"拉氏梭菌"的一氧化碳营养型梭菌和相关分离株的群集。仅举例来说，适当的野生 型化eS蛋白（和相应的核酸序列)包括公共数据库如GenBank中所述的那些，如下：来自永达 尔梭菌DSM13528(GenBank ADK16487.1);食一氧化碳梭菌P7(GenBank :EET86555.1);苯丙 氨酷基-tRNA合成酶亚基a[科氏梭菌]WP_012620882.1;苯丙氨酷基-tRNA合成酶亚基a[产 气芙膜梭菌菌株13]GenBank:BAB81592.1;苯丙氨酷基-tRNA合成酶亚基a[肉毒梭菌A菌株 ATCC 3502化enBank:YP_001255621.1;苯丙氨酷基-tRNA合成酶亚基a[生抱梭菌化enBank: WP_00：3495653.1;苯丙氨酷基-tRNA 合成酶亚基 a[拜氏梭菌 NCIMB 8052]GenBank:YP_ 001308703.1;苯丙氨酷基-tRNA合成酶亚基a[丙酬下醇梭菌ATCC 824]GenBank:NP_ 348973.1;苯丙氨酷基-tRNA合成酶亚基a[热纤梭菌ATCC 27405化enBank:YP_001036648.1 的化eS。在一个实施方案中，所述PheS是来自合成气发酵梭菌并且具有SEQ ID No. 21的氨 基酸序列。也可使用运些示例性蛋白质的功能等效变异体。
[0069] 在一个实施方案中，PheS相比于野生型化eS的至少一个变异位于包含底物特异性 位点的区域内。在一个实施方案中，所述底物特异性位点位于关于来自合成气发酵梭菌SEQ ID No.