1-3080)或热纤梭菌（Tyurin等， 2004，应用与环境微生物学(Appl. Environ.Microbiol.)70:883-890)中的标准方法。
[0109] 作为其他实例，电融合已描述用于产乙酸梭菌属MT351 (Tyurin和Kiriukhin, 2012,生物技术杂志(J Biotech): 1-12)。
[0110] 另一种示例性技术包括描述由于一氧化碳营养型产乙酸菌如粪味梭菌的原隧菌 体诱导（Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010,用于产生突变体的粪味梭菌ATCC 25775中的遗传修饰系统的开发（Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775for Generation of Mutants),Masters Project Western Kentucky University)。
[0111] 作为其他实例，可使用Herbert等，2003，（阳MS Microbiol 丄ett. 229:103-110)和 Wi 11 iams 等，1990 (J. Gen. Mi crob iol.l36:819-826)的结合方法。
[0112] 应理解，所述质粒可W裸核酸形式递送至亲本微生物或者可用一种或多种药剂配 制W促进转化过程(例如，脂质体结合核酸，运是一种其中含有核酸的生物体）。
[0113] 在某些实施方案中，由于在有待转化的微生物中具活性的限制系统，有必要将有 待引入微生物中的任何核酸(例如本发明的质粒）甲基化。运可使用多种技术(包括下文描 述的那些)来进行。
[0114] 举例来说，在一个实施方案中，本发明的重组微生物是通过包括W下步骤的方法 产生的： -向穿梭微生物中引入：（i)有待引入如本文所述的亲本微生物中的至少一个质粒，和 (i i)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体； -所述甲基转移酶基因的表达； -从所述穿梭微生物分离所述至少一个质粒;和 -将所述至少一个质粒引入目标微生物中。
[0115] 在一个实施方案中，所述甲基转移酶基因是组成型表达的。在另一个实施方案中， 所述甲基转移酶基因的表达是诱导型。
[0116] 所述穿梭微生物是一种微生物，优选是限制性酶阴性微生物，其促进构成本发明 质粒的核酸序列的甲基化。在一个特定实施方案中，所述穿梭微生物是限制性酶阴性大肠 杆菌、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtillis)或乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)。
[0117] 所述甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。
[0118] -旦一个或多个质粒和甲基化构建体/载体被引入穿梭微生物中，就会诱导在甲 基化构建体/载体上存在的甲基转移酶基因。诱导可能是通过任何合适的启动子系统，但是 在本发明的一个特定实施方案中，甲基化构建体/载体包含诱导型Iac启动子并且通过添加 乳糖或其类似物、更优选地异丙基-e-D-硫代半乳糖巧(IPTG)来诱导。其他合适的启动子包 括ara、tet或T7系统。在本发明的另一个实施方案中，甲基化构建体/载体启动子是组成型 启动子。
[0119] 在一个特定实施方案中，所述甲基化构建体/载体具有对穿梭微生物身份具特异 性的复制起点，W使得所述甲基化构建体/载体上存在的任何基因在所述穿梭微生物中表 达。
[0120] 甲基转移酶的表达导致有待引入亲本微生物的一个或多个质粒上存在的基因的 甲基化。然后可根据多种已知方法中的任一种从所述穿梭微生物分离所述质粒。例如，可根 据制造商的说明书使用市售试剂盒如Qiagen或Zymo。
[0121] 在一个特定实施方案中，同时分离甲基化构建体/载体与本发明的一个或多个质 粒。
[0122] 可使用任何数目的已知方法将指定用于亲本微生物的一个或多个质粒引入所述 微生物中。然而，举例来说，可使用在上文或下文实施例部分中所述的方法。
[0123] 可W设想，甲基转移酶基因可引入穿梭微生物中并且过度表达。因此，在一个实施 方案中，可使用已知方法收集所得甲基转移酶并且在体外用于甲基化有待引入亲本微生物 中的一个或多个质粒中。所述一个或多个质粒然后可引入目标(亲本)微生物中。在另一个 实施方案中，将甲基转移酶基因引入穿梭微生物的基因组中，接着将指定用于亲本微生物 的一个或多个质粒引入穿梭微生物中，从所述穿梭微生物分离所述一个或多个质粒，然后 将所述一个或多个质粒引入目标(亲本)微生物中。
[0124] 可W设想，指定用于亲本微生物的一个或多个质粒和如上文所定义的甲基化构建 体/载体可组合W提供物质组合物。运种组合物在阻遏限制屏障机制W产生本发明的重组 微生物中具有特别效用。
[0125] 在一个特定实施方案中，所述甲基化构建体/载体是质粒。
[0126] 本领域技术人员应了解用于产生根据本发明的微生物的多种合适的甲基转移酶。 然而，举例来说，可使用枯草芽抱杆菌隧菌体?!!甲基转移酶和W02012053905中描述的甲 基转移酶。考虑到所希望的甲基转移酶的序列和遗传密码，将容易地理解编码合适的甲基 转移酶的核酸。
[0127] 可使用适于允许甲基转移酶基因表达的任何数目的构建体/载体来产生甲基化构 建体/载体。然而，举例来说，可使用W02012053905中提及的那些。
[0128] 一旦质粒已引入所希望的亲本微生物中，则发生第一次选择。运设及选择表达至 少一个正向选择标记的一种或多种微生物。
[0129] 考虑到所使用的正向选择标记，可使用任何数目的已知技术来鉴定和选择运些微 生物。然而，作为一般实例，所述微生物可在含有毒素的培养基中或其上培养，所述毒素将 杀死不表达正向选择标记的任何微生物。作为特定实例，所述微生物可在毒性抗生素存在 下生长，其中本发明的质粒包括编码赋予微生物W抗生素抗性的产物的核酸。其中存在质 粒的那些微生物将存活并且不存在质粒的那些微生物将死亡。
[0130] 在选择表达正向选择标记的微生物中使用的方法和条件的其他实例描述于例如 Sambrook等,1989(如本文先前所述)中。其他实例提供于下文实施例部分中。
[0131] 本发明的方法还包括第二次选择。运设及选择不表达至少一个反向选择标记的一 种或多种微生物。
[0132] 在使用化化作为反向选择标记的情况下，不表达运种反向选择标记的一种或多种 微生物的选择包括在含有鸟巧类似物的培养基中或其上培养所述微生物。在一个特定实施 方案中，所述鸟巧类似物是更昔洛韦(ganciclovir)。含有并表达编码化化反向选择标记的 核酸的那些微生物在鸟巧类似物存在下将不会存活。因此，存活的那些微生物选择为已经 历所希望的双交叉重组事件。
[0133] 在使用变异化eS作为反向选择标记的情况下，不表达运种反向选择标记的一种或 多种微生物的选择包括在含有苯丙氨酸类似物的培养基中或其上培养所述微生物。在一个 特定实施方案中，苯丙氨酸类似物是如上文所示例。含有并表达编码变异化eS反向选择标 记的核酸的那些微生物在苯丙氨酸类似物存在下将不会存活。因此，存活的那些微生物被 选择为已经历所希望的双交叉重组事件。
[0134] 当使用变异化eS作为反向选择标记时，可能需要在培养基中还包括苯丙氨酸。
[0135] 本发明的方法包括同时和连续的选择步骤。例如，可使用正向选择标记关于单交 叉事件选择微生物并且随后使用反向选择标记关于双交叉事件选择微生物。可选地，正向 选择和反向选择可同时发生。作为实例，在编码正向选择标记的核酸位于同源臂外部的质 粒载体上时，可连续地选择单交叉事件，然后反向选择，选择双交叉事件。作为其他实例，在 编码正向选择标记的核酸位于同源臂之间（并且因此整合至亲本微生物的基因组中）时，正 向选择和反向选择可同时发生;具有整合至基因组中的正向选择标记并且抵抗反向选择标 记的任何细胞将发生双交叉事件。
[0136] 适于培养一种或多种微生物的任何培养基可用于本发明的方法中。基于公开信息 并考虑到本发明的性质和本文所述的亲本微生物，本领域技术人员将容易地了解适当的培 养基。优选地，所述培养基将是其中存在很少或不存在苯丙氨酸或者至少苯丙氨酸水平不 超过在反向选择期间的苯丙氨酸类似物的培养基。举例来说，任何适当的基本培养基将是 合适的，例如:梭菌基本培养基、基本确定培养基(MDM)、补充确定培养基(SDM)和完全确定 培养基(CDM)。特定实施例提供于下文实施例部分中。
[0137] 一旦根据本发明选择一种或多种微生物，就可使用已知方法将其培养并任选地储 存W供未来使用。
[0138] 现在将参考W下实施例仅举例描述本发明。 实施例 W下实施例描述用于反向选择性标记HSV-化和化eS*的质粒的构建，用于在合成气发 酵梭菌中反向选择的HSV-化和化eS*的功能性，和HSV-化和化eS*用于促进在合成气发酵梭 菌的基因组上的同源重组基因安置的用途。相同原理也可应用于其他梭菌家族成员，因为 在任何所测序梭菌中不存在服V-化基因的同源物并且地eS基因或梭菌物种是高度保守的。 标准重组DNA和分子克隆技术被用于本发明中并且由Sambrook等，1989和Ausubel等， 1987描述。使用大肠杆菌菌株T0P10(Life Technologies)和合成气发酵梭菌DSMiooedP DSM23693(DSM10061的衍生物）。如由Sambrook等，1989和Ausubel等，1987所述使大肠杆菌 在LB和SOB培养基中生长，而使合成气发酵梭菌在厌氧PETC培养基(表1)中生长。 与良 1 .PPT 厂 + 妾棠棘 r ATfY"+妾棠棘 1 7^/L.g 十。。
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[0139] 含有化v-tk的质粒的构建:人类瘤疹病毒胸巧激酶化sv-tk)的DNA序列获自NCBI (核酸和氨基酸）。化v-tk基因中的密码子经过优化W适应合成气发酵梭菌并通过GeneArt 合成并在其标准载体pM-RQ(Seq. ID. 1-pM-RQ-服V-tk)中递送。
[0140] 通过用Ndel和Miel限制酶(New化gland Biolabs)消化从pMK-RQ载体释放HSV-tk 并且克隆到修饰形式的大肠杆菌-梭菌穿梭载体PM化8315UFJ797651.1 ;Nigel Minton, University of Nottin曲am;Heap等，2009)(其被称为9]?化83155(沈Q ID 3))中，介于大肠 杆菌菌株 TOPlO (Life Techno Iogies)的相同位点之间 W产生 pMTL83155-Hsv-tk (Seq. ID. 2,图1)。所述PM化83155质粒在Notl与Ndel位点之间含有合成气发酵梭菌憐酸醋 乙酷转移酶基因的启动子序列（Seq. ID. 3)。
[0141] 突变地eS*的构建:在来自合成气发酵梭菌DSM 10061的序列（Seq. ID. 12)的基因 组中鉴定天然地eS。通过利用序列比对来比较大肠杆菌MG1655(Seq.ID.13)与合成气发酵 梭菌的地eS的序列，基于大肠杆菌的G284与G298之间的氨基酸的氨基酸序列（来自大肠杆 菌MG1655的化eS的氨基酸序列是SEQ ID 20)与合成气发酵梭菌的氨基酸G301和G315的同 源性来鉴定假定底物特异性位点（图3)。在碱基932处引入单点突变，用C取代G，导致编码甘 氨酸而非半脫氨酸的密码子(Seq. ID. 14)。
[0142] 含有pheS*的质粒的构建:将修饰pheS*与起始密码子上游的合成启动子和RBS位 点(P地eS*; Seq. ID. 17)转录偶联W允许高组成型表达。所述构建体还侧接化el限制位点W 实现基因克隆到可选载体中。通过GeneArt进行合成并利用限制酶PmeI亚克隆到载体 PMTL85151 中，产生最终载体pMTL85151-pheS*(Seq.ID.18;图4)。 敏感性测试：
[0143] Dレ4-氯苯丙氨酸的毒性测试:使大肠杆菌ToplO和带有空载体PM化85151的合成 气发酵梭菌DSM23693最初在化-4-氯苯丙氨酸存在下在平板上和在液体培养基中生长W确 定反向选择标记是否对生物体生长具有任何影响。注意到，化学物质不阻碍生物体在液体 培养基中或在平板上的生长并且对于大肠杆菌和合成气发酵梭菌来说菌落在24/48小时后 分别生长至相同尺寸。
[0144] 测试大肠杆菌中的地eS*:为了测试反向选择标记在大肠杆菌中起作用的能力，将 质粒PM化85151-地eS*转化至TOPlO中并且仅在氯霉素选择下生长。一旦培养已达到OD为 0.5,代表指数生长期，将IOOul涂在含有氯霉素和化-4-氯苯丙氨酸W及仅具有氯霉素作为 对照的LB平板上，一式S份，并且在37°C下溫育24小时。在24小时后，检查平板并且注意到， 在仅氯霉素平板上，如预期存在大菌落的菌苔，然而在含有氯霉素和化-4-氯苯丙氨酸的平 板上，存在小菌落的淡阴影（1 i gh t shad ing)，运表明DL-4-氯苯丙氨酸影响带有 pMTL85151-pheS*的大肠杆菌的生长。在36小时后，双重选择平板已经向外生长至与仅氯霉 素平板相同的水平。 合成气发酵梭菌的转化和质粒的确定：
[0145] 合成气发酵梭菌的转化:如W02012053905中所述将PMTL83155、PMTL83155-Hs v-tk 和pM化85155-PheS质粒引入合成气发酵梭菌DSM23693(DSM10061的衍生物）中。在阳TC肉汤 中进行向外生长并且在补充有15iig/ml甲讽霉素（Sigma)和lOiig/ml甲氧节晚（Sigma)的 PETC-琼脂培养基上扩展。在具有48 % CO、2 %肥、20 % C02、30 % N2的20ps i气体混合物的加 压气体罐中在37°C下溫育3天后观测到菌落。在含有15μg/ml甲讽霉素的PETC-琼脂培养基 上进行单菌落的划线。
[0146] 针对质粒的存在筛选转化株:通过PCR使用跨越PMTL83155和PMTL83155-Hs v-tk中 的革兰氏阳性复制子和ca1:P正向选择标记的引物r邱Hf (Seq. ID. 4)和catr (Seq. ID. 5)针对 PMTL83155 和 pM^SSlSS-Ksv-tk 质粒的存在随机筛选来自 LZ-PMTL83155 和 LZ-PMTL83155-hsv-tk转化结合子的2个菌落。未被修饰的合成气发酵梭菌用作运些PCR中的对照。将 Maxime PCR PreMix试剂盒用于PCR。也使用引物fDl (Seq. ID. 6)和巧2(Seq. ID. 7)和Maxime PCR PreMix试剂盒从运些转化株对16s rDNA进行PCR扩增。
[0147] 利用 repHF 和 CatR 引物的P