一种微生物转化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明采用摩根菌转化心色氨酸生产R-(-)-吗I噪-3-乳酸，属于工业微生物领域。
【背景技术】
[0002] R-(-)-日引噪-3-乳酸也叫R-(-)-3-日引噪-乳酸，英文名为:R-(-)-indole-3-lactic acid、R-(-)-2-hydroxy-3-(lH-indol-3-yl)propanoic acid、R-(-)-Indolelactic acid、 R-(-)-Indolelactate。它具有抗菌活性，同时也是植物激素吗I噪乙酸的前体。基于R-(-)- 吗I噪-3-乳酸的重要应用价值，本专利提出了采用变形杆菌属微生物转化心色氨酸生产R- (-)-吗I噪-3-乳酸的方案。k色氨酸当前主要通过微生物发酵法生产，原料丰富易得。
[0003] 摩根菌(Morganella)是一类可使苯丙氨酸氧化脱氨的革兰氏阴性细菌。现有2个 种和2个亚种：摩根摩根菌（Morganella morganii)、耐冷摩根菌（Morganella psychrotolerans)、摩根摩根菌摩根亚种（Morganel la morgani i subsp.morgani i)和摩根 摩根菌西伯尼亚种(Morganella morganii subsp.Sibonii subsp.)。摩根菌具有强大的氧 化脱氨能力（Sherris Medical Mic;robiology，2004,4th 0(1.)，1^-色氨酸可W被摩根菌氧 化脱氨成吗I噪-3-丙酬酸。
[0004] 相关文献认为运些微生物只能将心色氨酸氧化成吗I噪-3-丙酬酸，而无法进一步 还原成吗I噪-3-乳酉《（曰-keto 曰cids 曰re novel siderophores in the genera proteus, providencia,and morganella and are produced by amino acid deaminases，1993， Journal of bacteriology, 175(9),2727-2733)，运可能与之条件选择不当有关。
[0005] 本发明可通过摩根菌属微生物将心色氨酸转化成光学纯的R-(-)-吗I噪-3-乳酸。 吗I噪-3-丙酬酸虽然是更为直接的底物，但价格较高，因此k色氨酸是最佳的底物。摩根菌 是一种兼性厌氧菌，可W在厌氧条件或好氧条件下转化生产R-(-)-吗I噪-3-乳酸，具有高转 化率和高纯度的特点。
【发明内容】
[0006] 本发明通过培养摩根菌属微生物菌体，转化k色氨酸生产R-(-)-吗I噪-3-乳酸，技 术方案如下：
[0007] 1、菌株
[000引本发明所用的菌株有购自美国ATCC菌种库的Morganella morganii subsp. sibonii ATCC 49948、Mo;rganella morganii subsp.mo;rganii ATCC 25830?及购 自中国工业微生物菌种保藏管理中屯、的Morganella morganii CICC 21517和购自BCCM/ LMG Bacteria Collection的Morganella psychrotolerans LMG 23374。
[0009] 2、菌体培养
[0010] 液态发酵培养基组成为:碳源0-50g/L，氮源0-50g/L，憐酸氨二锭0-2g/L，憐酸二 氨钟0-lg/L，硫酸儀0-0.5g/L，硫酸亚铁0-0.5g/L，氯化纳0-5g/L，可调节抑至2-8，可也抑 自然;接种量为5-20%，发酵溫度为20-40°C，发酵周期为24-72小时。种子和发酵均采用此 培养基。
[0011] 用于培养菌种的碳源可W是葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、薦糖、半乳糖、甘油。培养 用氮源可W是硫酸锭、氯化锭、硝酸锭、蛋白腺、酵母膏、尿素、玉米浆等有机氮源。碳源和氮 源可W是一种或多种的组合。
[0012] 液态培养菌体的过程可W采用厌氧或好氧方式。
[OOU] 3、转化产R-(-)-吗隙-3-乳酸
[0014]转化过程采用的方案有巧中：
[001引（1)细胞的液态培养过程，将k色氨酸底物加入上述的培养体系中；k色氨酸添加 量为 O-lOg/L。
[0016] (2)将液态发酵培养物离屯、去除发酵液得到菌体，将菌体放入含有k色氨酸底物 的水溶液反应体系中进行;转化过程溫度20-40°C，pH 2-8，转化时间1 -24小时。转化液中k 色氨酸起始浓度为0.1-lOg/L。
[0017] 4、样品的检测分析
[0018] 转化液采用PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，色谱条件为:流 动相是甲醇-0.1%甲酸水(40:60)、采用汉邦MegresC18色谱柱(4.6X250mm，5皿），流速 0.6ml/min、柱溫30°C、进样量20μ1、检测器波长200nm。
[0019]采用江苏汉邦科技有限公司的DAC-HB50制备色谱柱制备转化样品，制备色谱条件 为:流动相50 %甲醇、柱溫自然、流速3ml/min、进样量5ml。样品达到色谱纯99.9%，反复进 样分离得到的产品于50°C下真空旋转蒸干。称取制备得到的样品0.5g，溶于去离子水中并 定容至50ml，采用日本爱岩AP-300全自动旋光仪测定放光度。进一步采Varian Gemini 2000(VnmrS 600MHz，600/54/ASP)分析样品的核磁数据。样品进一步采用UPLC-QTOF-MS法 分析分子量，仪器为Waters MLDI SYNAPT QT0F MS液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1
[0021] 转化产物的分析测定。
[0022] 配制培养基如下:酵母膏5g/L，蛋白腺lOg/L，氯化钢5g/L"500mlS角瓶中装液量 为100ml，共50瓶，120°C，20分钟灭菌。取Mo巧anella morganii CICC 21517甘油管种子液 ImL接种，发酵溫度30°C，摇床转速20化pm。培养24后，将发酵液离屯、（转速1000化pm，时间 lOmin)，去除上清液获得菌体，离屯、获得的菌体用无菌水清洗两遍。取20g湿菌体放入心色 氨酸浓度为lOg/L的1000ml溶液中，混合均匀。于37°C摇床振荡（100巧m)24小时后，100°C水 浴加热3分钟杀灭菌体。再离屯、（转速1000化pm，时间lOmin)去除菌体，得到转化后的上清 液。液相分析R-(-)-吗I噪-3-乳酸浓度为2.2g/L，剩余k色氨酸浓度为5.1g/L。采用制备色 谱得到1.8g纯品。
[0023] 旋光仪分析其旋光度为=-瓦3〇。核磁数据为：1H匪R(D20 600MHz) :δ 7.75(lH，d J 7.9Hz)，7.45(lH，d，J 8.1Hz)，7.23(2H，m，J 7.6Hz)，7.14(lH，d，J 0.98， 7.49Hz)，4.35(lH，dd，J4.29,7.65)，3.22(lH，ddd，J4.26,4.8甜z)，3.11(lH，dd，J7.65， 14.86Hz)〇13C NMR(D2〇,600MHz):S183.73,138.43,129.62，
[0024] 126.45,124.23,121.52,121.34,114.12ai3.46,74.42,32.32〇
[0025] 转化产物的质谱数据为：（-ESI,negative mode)m/z:204.0[M-l]。
[0026] 根据W上数据，确定其分子及光学结构与R-(-)-吗I噪-3-乳酸完全一致。
[0027] 实施例2
[00%]好氧培养与厌培养的比较。配制培养基:葡萄糖30g/L，蛋白腺20g/L，憐酸氨二锭 Ig/L，憐酸二氨钟Ig/L，硫酸儀0.3g/L，硫酸亚铁0.3gA;起始pH和发酵过程pH均为自然 500mlS角瓶中装液量为100ml，共2瓶，120°C，20分钟灭菌。
[00巧]取Mo;rganella morganii subsp.sibonii ATCC 49948甘油管种子液 1 血接种 1瓶， 于厌氧培养箱中35°C培养72小时，离屯、获得的菌体用无菌水清洗两遍。取O.lg湿菌体放入 k色氨酸浓度为2g/L的4ml溶液中，混合均匀，厌氧培养箱中35°C静置转化24小时后，100°C 水浴加热3分钟杀灭菌体。再离屯、(转速1000化pm，时间lOmin)去除菌体，得到转化后的上清 液。液相分析R-(-)-嘲噪-3-乳酸浓度为0.6g/L，剩余k色氨酸浓度为0.5g/L。
[0030] 取Mo;rganella morganii subsp.sibonii ATCC 49948甘油管种子液 1 血接种1瓶， 于摇床(200巧m)中35°C培养24小时。将发酵液离屯、(转速10000巧m，时间lOmin)，去除