一种微生物转化合成苯乳酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化工合成技术领域，具体涉及一种微生物转化合成苯乳酸的方法。
【背景技术】
[0002]苯乳酸是一种对革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌等具有广谱抗菌性的新型抑菌剂，也是合成抗血小板凝聚和心肌梗塞药物的前体，还可用于合成新型功能聚合物材料，在医药、食品、化妆品及材料领域有重要的应用前景。传统化学法合成苯乳酸过程中存在诸如需要使用高毒单体和催化剂、合成路线复杂、副产物多、环境污染、溶剂残留等问题，影响了其安全性。近几年，微生物转化合成开始成为苯乳酸制备的新途径。
[0003]已报道的微生物如植物乳杆菌、芽孢杆菌、白地霉菌、丙酸短棒菌、米根霉菌及荧光威克酵母菌等可代谢合成苯乳酸。其中，以苯丙酮酸为主要底物，利用植物乳杆菌为主力菌株，通过微生物转化合成进行苯乳酸的制备，是微生物法合成苯乳酸的主要途径。但现有一些菌株在特定条件下会存在潜在的安全性问题，而安全性好的部分食品源产苯乳酸微生物常受限于产物和底物抑制，使苯乳酸转化产率低，浓度低，难以达到工业化生产要求。因此，探索微生物合成苯乳酸的新途径及新菌株，是目前迫切需要解决的问题，具有重要意义。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的上述问题，本发明目的是提供一种微生物转化合成苯乳酸的方法。
[0005]所述的一种微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于以布氏乳杆菌为全细胞催化剂，对关键底物苯丙酮酸进行微生物转化，得到苯乳酸。
[0006]所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
1)对布氏乳杆菌的菌体进行通透化处理后，分散于缓冲溶液中，制成含微生物细胞的悬浮液；
2)向步骤1)得到的含微生物细胞的悬浮液中加入关键底物苯丙酮酸和辅助底物葡萄糖，进行微生物转化合成苯乳酸。可以经离心分离和产物纯化等后续处理获得所需纯度的苯乳酸，离心分离和产物纯化为常规技术。
[0007]所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤1 )中对布氏乳杆菌的菌体进行通透化处理所用的方法为冻融法，菌体冷冻温度-15?_25°C，室温解冻。
[0008]所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤1 )中所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，其浓度为100 mM，pH为7?8。
[0009]所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤1 )中含微生物细胞的悬浮液中菌体浓度为50?150 g/Lo
[0010]所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤1 )中苯丙酮酸浓度为4?18 g/L，葡萄糖浓度为10?18 g/L。
[0011]所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤2 )中的转化合成温度为25?45°C，转化反应时间为4?6 h。
[0012]所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述转化合成优化条件为：菌体浓度100 g/L，苯丙酮酸浓度12 g/L，葡萄糖浓度14 g/L，温度35°C，转化反应时间4 h。
[0013]所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述自动控温摇床的转速为60-80 rpmD
[0014]通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明利用布氏乳杆菌为催化剂，通过微生物转化途径合成苯乳酸的方法，其步骤少、反应条件温和、反应时间短、操作简单、无需使用高毒试剂和催化剂、成本低，规模化转化制备容易实现，具有广阔的应用前景；
2)本发明所用的底物和缓冲溶液都是常规的，容易获得和配制；所用的微生物菌株是来源于食品的安全微生物，可从传统泡菜等发酵食品中方便地分离获得，使得转化合成的苯乳酸具有很好的安全性；
3)本发明通过冻融法对布氏乳杆菌细胞进行通透化处理，无需采用有机溶剂通透化等常规微生物转化用细胞的通透化方法，处理过程简单方便，是安全高效的绿色化方法，无毒性；
4)本发明利用布氏乳杆菌通过微生物转化途径合成苯乳酸的方法，苯乳酸的转化收率(苯乳酸产物与苯丙酮酸底物的摩尔比率)可达91%，转化液中苯乳酸产物的浓度可达11 g/L，转化收率和产率都较高，微生物转化合成过程高效，优于已有利用植物乳杆菌转化合成苯乳酸的方法。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
将500 mg布氏乳杆菌菌体于_15°C进行冻融处理，然后置于锥形瓶中室温解冻，加入5 mL pH为8.0的100 mM Na2HP04_NaH2P04缓冲液，使菌体均匀分散，形成含微生物细胞的悬浮液；向该悬浮液中加入70 mg葡萄糖和20 mg苯丙酮酸，在自动控温摇床上于30°C、转速75 rpm下反应时间4h后，从转化液中取样，离心后取上清液进行高效液相色谱检测分析，分析条件为：Agilent 1260 infinity液相色谱系统，DAD检测器（G1315D)，AgilentZorbax SB-C18色谱柱（4. 6 mmX150 mm, 5 ym);流动相：水+0.05%三氟乙酸⑷和甲醇+0. 05%三氟乙酸(B)，梯度洗脱：0~20 min时候B由10%线性变化为100%, 20-23 min保持100%, 23-25 min线性降为10% ;流速1 mL/min，检测波长210 nm，柱温30°C，所得转化液中苯乳酸含量为3. 3 g/L，转化收率为81 %。
[0016]实施例2
将500 mg布氏乳杆菌菌体于-20°C进行冻融处理，然后置于锥形瓶中室温解冻，加入5mL pH为7. 5的100 mM Na2HP04_NaH2P04缓冲液，使菌体均匀分散，形成含微生物细胞的悬浮液；向该悬浮液中加入70 mg葡萄糖和60 mg苯丙酮酸，在自动控温摇床上于35°C、转速80 rpm下反应时间4h后，从转化液中取样，8000 rpm离心15 min，取上清液进行高效液相色谱检测分析（同上，下同)，所得转化液中苯乳酸含量为11 g/L，转化收率为91 %。
[0017]实施例3
将750 mg布氏乳杆菌菌体于-25°C进行冻融处理，然后置于锥形瓶中室温解冻，加入5mL pH为8的100 mM Na2HP04_NaH2P04缓冲液，使菌体均匀分散，形成含微生物细胞的悬浮液。向该悬浮液中加入90 mg葡萄糖和90 mg苯丙酮酸，在自动控温摇床上于45°C、转速75 rpm下反应时间4h后，从转化液中取样，离心后取上清液进行高效液相色谱检测分析，所得转化液中苯乳酸含量为5. 1 g/L，转化收率为28 %。
[0018]实施例4
将250 mg布氏乳杆菌菌体于-25°C进行冻融处理，然后置于锥形瓶中室温解冻，加入5mL pH为8的100 mM Na2HP04_NaH2P04缓冲液，使菌体均匀分散，形成含微生物细胞的悬浮液。向该悬浮液中加入50 mg葡萄糖和20 mg苯丙酮酸，在自动控温摇床上于25°C、转速75 rpm下反应时间6h后，从转化液中取样，离心后取上清液进行高效液相色谱检测分析，所得转化液中苯乳酸含量为2. 4 g/L，转化收率为60 %。
[0019]实施例5
将500 mg布氏乳杆菌菌体于-20°C进行冻融处理，然后置于锥形瓶中室温解冻，加入5mL pH为7.0的100 mM Na2HP04_NaH2P04缓冲液，使菌体均匀分散，形成含微生物细胞的悬浮液。向该悬浮液中加入50 mg葡萄糖和20 mg苯丙酮酸，在自动控温摇床上于30°C、转速60 rpm下反应时间4h后，从转化液中取样，离心后取上清液进行高效液相色谱检测分析，所得转化液中苯乳酸含量为3. 5 g/L，转化收率为86 %。
【主权项】
1.一种微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于以布氏乳杆菌为全细胞催化剂，对关键底物苯丙酮酸进行微生物转化，得到苯乳酸。2.如权利要求1所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤: 1)对布氏乳杆菌的菌体进行通透化处理后，分散于缓冲溶液中，制成含微生物细胞的悬浮液； 2)向步骤I)得到的含微生物细胞的悬浮液中加入关键底物苯丙酮酸和辅助底物葡萄糖，在自动控温摇床中进行微生物转化合成苯乳酸。3.如权利要求2所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤I)中对布氏乳杆菌的菌体进行通透化处理所用的方法为冻融法，菌体冷冻温度-15?-25°C，室温解冻。4.如权利要求2所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤I)中所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，其浓度为100 mM，pH为7?8。5.如权利要求2所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤I)中含微生物细胞的悬浮液中菌体浓度为50?150 g/Lo6.如权利要求2所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤I)中苯丙酮酸浓度为4?18 g/L，葡萄糖浓度为10?18 g/Lo7.如权利要求2所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤2)中的转化合成温度为25?45°C，转化反应时间为4?6 h。8.如权利要求2所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述转化合成优化条件为:菌体浓度100 g/L,苯丙酮酸浓度12 g/L,葡萄糖浓度14 g/L,温度35°C，转化反应时间4 ho9.如权利要求2所述的微生物转化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述自动控温摇床的转速为60-80 rpm。
【专利摘要】一种微生物转化合成苯乳酸的方法，属于生物化工合成技术领域。所述方法是以苯丙酮酸为关键底物，以冻融通透化处理的布氏乳杆菌菌体为全细胞催化剂，在一定温度条件下进行转化合成苯乳酸。本发明优化条件下苯乳酸的转化收率可达91%，转化液中苯乳酸产物的浓度可达11g/L。所用菌种为源于食品的安全微生物，其通透化处理过程简单方便，安全无毒性；微生物转化过程步骤少，时间短，成本低，转化收率高，可实现安全快速合成制备，在苯乳酸制备领域具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12R1/225, C12P7/42
【公开号】CN105039434
【申请号】CN201510565255
【发明人】贠军贤, 倪正, 关今韬, 沈绍传, 张颂红, 韩朝飞
【申请人】浙江工业大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年9月8日