高灵敏度电喷射接口的制作方法
【专利说明】高灵敏度电喷射接口
[0001 ] 相关申请
[0002]本申请根据U.S.C.§119(e)的规定要求下述在先申请的优先权:2013年8月29日提交的美国临时专利申请61/871，562，其在此通过引用纳入本文。
[0003]政府资助
[0004]本发明获得了由Nat1nal Institutes of Health提供的项目编号为R01GM096767的政府资助。美国政府对于本发明拥有一定的权益。
【背景技术】
[0005]自下而上蛋白质组学(Bottom-upProteomics)是鉴定蛋白质以及在质谱分析之前通过蛋白水解消化描述其氨基酸序列和转译后修饰的实用方法。自下而上蛋白质组学被广泛用于定性和定量分析复杂的生物样品。由微克的物料，有可能从哺乳动物细胞溶解产物鉴定超过10，000种蛋白质以及从原核生物溶解产物鉴定超过2，500种蛋白质。自下而上蛋白质组学方法，对于质量有限的样品，例如激光捕获微小切割组织、循环肿瘤细胞、单胚和单体细胞，操作性能会迅速降低。
[0006]有少量的报道涉及采用毛细管液相色谱(LC)-电喷射离子化(ESI)-串联质谱(MS/MS)方法纳克样品的自下而上蛋白质组学。Mann团队从具有几百ng蛋白质含量的单一胰岛细胞鉴定出2，000种蛋白质(ffaanders et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2009，106，18902) aKarger团队从50ng的醋酸甲烧八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)消化物鉴定出566种蛋白质(Yue et al.，Anal.Chem.2007，79，938)，并且从?2.5ng的宫颈癌细胞株的胰蛋白酶消化物鉴定出163种蛋白质(Luo et al.，Anal.Chem.2007，79，6174)。Smith小组利用精确质量和时间标签(AMT s ) [ 8 ]的方法从低微克量的耐辐射球菌(Deinococcusrad1durans)消化物中检测出870种蛋白质(Smith et al.，Proteomics2002，2，513)。31^访团队还报告了采用411'方法在0.5?8的样品中检测到三种最大丰度的蛋白质，并且报告在牛血清蛋白(bovine serum albumin)消化产物中对一种蛋白质的?1zmoIe检测极限(Shen et al.,Anal.Chem.2004,76,144) C3Dovichi及其同事利用具有高能碰撞离解的Q-Exactive质谱仪(Olsen et al.，Nat.Methods2007，4，709)从Ing的RAW264.7巨■细胞株消化物中鉴定出?100种蛋白组(Sun et al.,Rapid Commun.MassSpectrom.2013，27，157)。所有这些分析都需要至少一个小时的仪器时间。因此，对飞克(femtogram)量的蛋白质消化物的更为快捷的自下而上分析方法对于蛋白质组学领域是非常有价值的。
[0007]毛细管区带电泳-电喷射离子化-串联质谱(CZE-ES1-MS/MS)对于自下而上蛋白质组学受到关注，并且，对于低纳克样品来说，这种方法一致地优于LC-MS/MS方法。对于微小样品量而言CZE的改良性能大概是由于其非常简单的设计以及在喷射器和配件中消除了样品损耗。从Smith团队的开创性工作入手(Smith et al.,Anal.Chem.1988，60，1948)，为了毛细管电泳已经开发电喷射接口(Maxwell et al.，Anal.Chim.Acta2008，627，25)。然而，有必要开发出新的接口以降低因低鞘流率引起的样品稀释，免除机械栗，允许较宽范围的分离缓冲，以及在纳喷射状态的稳定操作。
[0008]发明概述
[0009]本发明提供了一种基于改进的动电栗鞘流接口的超灵敏和快速的毛细管区带电泳-电喷射离子化-串联质谱(CZE-ES1-MS/MS)系统。所述接口有多方面的优点，包括由于很低的鞘流率减少样品稀释，免除机械栗，允许较宽范围的分离缓冲，与商业毛细管电泳设备的相容性，以及在纳喷射状态的稳定操作。所述系统对于飞克(femtogram，毫微微克)量蛋白质消化物的快速自下而上分析是非常有用的并且能够提供极高的灵敏度。
[00?0] 于是，本发明提供了一种鞘流接口(sheath-flow interface)，用来从毛细管中形成电喷射，其中，所述接口包括:
[0011](a)毛细管，设置为含有被测物液体，所述毛细管具有用来接收被测物液体的注射端以及用来排放被测物流出物的末端，其中所述末端的部分的外径逐渐缩减到大约20μπι到大约200μηι范围的较小外径；
[0012](b)电喷发射体发射体，同轴地设置于至少在所述毛细管的末端周围，所述电喷发射体发射体具有末端，其逐渐变小终止于开口，所述开口被相对于所述毛细管的末端同轴设置；以及
[0013](c)鞘液储存器，流体地连通到所述电喷发射体发射体的内部，使得导电的鞘液能够流出所述鞘液储存器，经过所述毛细管和所述电喷发射体发射体的中间连接器件，穿过所述毛细管的末端，并且通过所述电喷发射体发射体的末端的所述开口。
[0014]所述鞘流接口可以设置为使得所述毛细管的末端和所述电喷发射体发射体的孔口在所述电喷发射体发射体内以约750μηι到约I OOnm的距离分开。在一些实施方式中，其中所述毛细管的外径小于所述发射体发射体孔口的直径，所述毛细管的末端可被设置为处于所述发射体发射体孔口的开口之内。另外，所述毛细管的末端可以从所述发射体发射体孔口的开口伸出达大约ΙΟΟμπι。
[0015]所述鞘液能够提供所述毛细管和所述电喷发射体发射体之间的电接触。所述鞘流接口可以设置用来由鞘流和所述被测物流出物混合的动电流形成纳喷射。此外，所述动电流可以通过所述电喷发射体发射体和与所述发射体发射体的所述开口接近但无物理接触的目标面之间的电势产生。
[0016]在各种实施方式中，所述毛细管的末端的外径可以是约20μπι到约75μπι，或者约45μm至约65μηι。所述末端的逐渐缩减到较小外径的部分可以是长度为大约0.1mm到大约10mm，尤其是大约5mm的部分。
[0017]所述鞘流接口，当与毛细管区带电泳装置和串联质谱仪配置时，可以在不到12分钟或不到10分钟的质谱仪器时间内从400飞克(f emtograms)的肽类样品中检测出多个肽类。所述肽类包括肽消化物，例如E.col i胰蛋白酶消化物。
[0018]所述鞘流接口可以配置毛细管区带电泳装置和质谱仪，其中多于150种肽类能够通过精确质量和时间标记从亚皮克(sub-p i cogram)量的复合蛋白质消化物中在不到12分钟、通常不到20分钟的质谱仪时间内被鉴别出来。
[0019]所述质谱检测极限能够是大约1-1OiX摩尔(zeptomoles)，例如可以低到大约IiX摩尔(zeptomole)。
[0020]本发明还提供了一种方法，用于分析蛋白质消化物，包括将权利要求1所述的鞘流接口配置毛细管区带电泳装置，其中所述分析物通过毛细管区带电泳在分离毛细管中被分离，并且施加约1kV的电势提供大约300V/cm的电场，以形成宽的分析物分离窗区，在此期间，分析物从所述毛细管在大约60分钟内迀移至所述接口。对于肽类分离，可获得平均的250，000理论板到大约350，000理论板。
[0021]在一些实施方式中，所述鞘流接口的分离毛细管的内径为约5μπι到约75μπι。在不同的实施方式中，喷射的总流率为约15到约200nL/minute，约20到约200nL/minute，约15到约25nL/minute，或者约20nL/minute。所述方法可包括将本文所述的鞘流接口配置串联质谱仪，其中所述鞘流接口被配置向质谱仪提供纳喷射进行分析，其中所述目标表面是质谱仪的输入孔口，并且其中所述蛋白质样品的检测下限为大约3飞克(femtograms)至大约5飞克。所述被分析肽类的检测极限可以为大约I仄摩尔(zeptomole)，尤其是对于较小内经的分离毛细管(例如，直径小于大约15微米，特别是大约10微米)。为了实现很低的质量检测极限，需要使用高灵敏度的质谱仪。高灵敏度质谱仪的一个实例是Q-Exactive Quadrupole-Orbitrap质谱仪(Thermo Fisher Scientific Inc.)。所述被分析肽类的信噪比可以是大约260:1到大约300:1。
[0022]本发明还进一步提供了一种方法，从而利用本文所述的鞘流接口从毛细管的分析物流出液形成纳喷射，包括施加电压到鞘液储存器足以驱动鞘液储存器中鞘液的电渗流，通过所述毛细管和所述电喷发射体发射体之间的连接构件，穿过所述毛细管的末端，并且通过所述电喷发射体发射体的末端的开口，其中所述分析物流出液在毛细管内通过电压施加到所述毛细管的注射端并由毛细管区带电泳进行分离。
[0023]在不同的实施方式中，所述分析物液体可利用动电力或机械栗力经由所述毛细管发生移动。所述分析物液体可在毛细管内被分离，其中采用毛细管区带电泳、胶束动电色谱、毛细管电色谱、毛细管等电聚焦、毛细管液相色谱法，或其组合。所述纳喷射可以通过例如电渗流而形成。所述分析物液体可在毛细管内通过电泳分离，其中所述纳喷射通过电渗流产生，并且其中的电泳和电渗流都是通过在所述毛细管的注射端、所述鞘液储存器和所述目标表面之间施加电势而被驱动。所述分析物液体可以通过色谱法分离，其中物流被通过常规液相色谱中的机械栗或通过电色谱中动电流驱动;这些情况下，电喷射可在发射体发射体内通过电渗流驱动。
[0024]所述鞘流接口可设置为向质谱仪作为分析提供纳喷射，并且其中所述目标表面是质谱仪的输入孔口。所述目标表面可以保持接地或者所述目标表面可以持有电位。所述鞘液可配置以提高分析物流出液与质谱仪的相容性能。电喷发射体发射体末端的开口的直径可以是约0.5μπ?到约50μ??，或者约0.5μπ?到约30μ??。
[0025]本发明还提供了一种方法，用于分析诸如蛋白质消化物的生物分子。所述方法可以包括从蛋白质消化物形成分析物流出液，并且，利用前述实施方式的流鞘接口，形成从毛细管的分析物流出液的纳喷射。所述形成分析物流出液纳喷射的方法可以包括施加电压到鞘液储存器足以驱动所述鞘液储存器的鞘流的电渗流，通过毛细管和电喷发射体发射体之间的连接构件，穿过毛细管的末端，并且经过位于所述电喷发射体发射体末端的开口。所述分析物流出液在毛细管内通过施加电压到毛细管注射端的毛细电泳进行分离。
[0026]附图简要说明
[0027]下述附图属于说明书的一部分并且是用来对本发明的一些实施方式或不同方面作进一步的描述。在一些实例中，本发明的实施方式可以通过参照附图并结合本文提供的详细描述得到更好地理解。这些描述和附图可以突出某些具体的实施例或者本发明的某些方面。然而，本领域技术人员应当理解这些部分的实施例或方面也可用于结合本发明的其他实施例或方面。
[0028]图1.(A)根据所公开实施方式的典型的接口的示意图。(B)带有质谱仪的典型的接口的示意图。所述鞘液可以被HV2和质谱仪入口之间电势差驱动的动电流栗送。所述分离作用可通过所述毛细管的入口(HVl)和出口(HV2)之间的电势差来驱动。
[0029]图2.根据一种实施方式的接口的组成。
[0030]图3.CZE-ES1-MS/MS系统。所述系统的略图(A)，电喷射发射体发射体中的蚀刻毛细管的略图(B)，以及所述发射体发射体中蚀刻毛细管的显微图(C)。
[0031]图4.利用CZE-ES1-MS/MS基于串联光谱鉴别从16pg量E.coli分析三重的50种高强度肽类的提取离子电泳图。提取的质量公差为2ppm。
[0032]图5.针对16量E.coli消化物每组三重的肽迀移时间的相对标准偏差(RSD)分布。所选择的电泳图是从154种高强度肽生成的。肽峰值提取的质量公差为3ppm。对电泳图进行高斯函数拟合，采用无监督非线性最小二乘拟合:Intensity(t) = a X exp-0.5*(t-to)2/width2+off set;其中t为时间，to为峰值迀移时间，a为峰值幅度，width为根据高斯标准偏差的峰值宽度，而offset是指dc偏移。采用MATLAB的拟合程序进行计算。各个电泳图中最高值的振幅和迀移时间被用作初始推测值a和to。对于width的初始推测值为3秒。对off set的初始估计值为所述电泳图的中值。对于三重的每样的电泳图迀移时间的相关标准偏差计算为std(to)/mean(t0) X 100%。
[0033]图6.针对16pg量E.co I i消化物三重样品通过CZE-ES1-MS/MS鉴别的肽类的峰值宽度分布。峰值宽度是采用图5所述的非线性回归分析确定。高斯函数半高处的总宽度=2.35X width，而在基线处的总宽度是4 X width。
[0034]图7.针对16pg量E.co I i消化物三重样品通过CZE-ES1-MS/MS鉴别的肽类的理论板数(N)分布。理论板数的计算为N= (to/width)2，其中to和width是采用图5所述的非线性回归分析确定。
[0035]图8.从16pg量E.coli消化物的不同测试分析获得的肽强度的相关性(A:对比16pg量E.co I iji试I的肽强度和16pg量E.co I iji试2的肽强度;B:对比16pg量E.co I iji试I的肽强度和16pg量E.coliJi试3的肽强度；C:对比16pg量E.coliJi试2的肽强度和16pg量E.col i_测试3的肽强度)。肽强度是利用数据库检索结果而获得，采用了 MaxQuantsoftware(v.1.3.0.5)软件，是总括的与被鉴别肽序列相关的全部同位素族的extracted1n Current(XIC)0
[0036]图9.加载量的E.coli消化物和基于串联光谱(点由线连接)及精确数量和时间标记(Star = AMTS)的鉴定之间的关系。蛋白质鉴别(A);肽鉴别(B)。每个样品均进行二重或三重的分析。所述基于AMTs从400fg量E.coli消化物的鉴别用星来标示。误差条为平均值的标准差。
[0037]图10.由400fg量被鉴别肽获得的提取离子电泳图(上部)，以及由16pg量E.coli消化物相应的电泳图(下部)，其基于精确质量和时间标记(AMTs)方法(其它153对电泳图未示出)。用于峰值提取的质量公差为3ppm。
[0038]图11.被鉴别的三种热不稳定延伸因子(elongat1nfactor Tu)肽提取电泳图(A，B和C)，其为通过MS/MS从400fg量的E.coli消化物进行肽的检测极限计算。
[0039]图12.血管紧张素II的加载量和碎片离子(y2+和b6+)强度在CZE-PRM分析之后的宽动态范围校正曲线。所述曲线为针对对数数据未加权线性拟合的结果。
[0040]图13.来自三重的CZE-PRM分析的迀移时间和血管紧张素II碎片离子(y2+)对于不同加载量(2amo I e-150f mo I e)的相对标准偏差(RSDs)。
[0041 ]图14.在CZE-ES1-MS分析之后MCF7消