法在1分钟内从400f g消化物中鉴定了超过60种蛋白质。
[0116]纳克样品的自下而上蛋白质组方法，采用毛细管液相色谱(LC)-电雾化电离(ESI)-串联质谱(MS/MS)分析，需要至少一个小时的仪器时间。在本实施例中，报道了基于改进的动电栗鞘流接口的一种超灵敏和快速的毛细管区带电泳(CZE)-ES1-MS/MS系统。我们展示了对飞克量的E.coli蛋白消化物进行快速自下而上分析的系统。
[0117]对于低纳克样品CZE-ES1-MS/MS总是优于LC-MS/MS，部分原因在于其改进的接口。本实施例描述了另外一种接口的开发，其基于动电栗鞘液接口(图3A)(见Wojcik etal.，RapidCommun.Mass Spectrom.2010，24，2554foran example of aprev1us sheath-flowinterface)。所述新的接口有几个优点，包括由于鞘流流速很低而减少样品的稀释，免除机械栗，允许使用宽泛的分离缓冲剂，以及使得纳喷射体系操作稳定。我们还将CZE连接到三重四极质谱仪并且采用了利用多重反应监测针对复杂混合物中亮氨酸-脑啡肽进行量化分析的接口，而且我们获得了335zmole的肽检测极限，其显示出所述系统对于高灵敏分析的能力(Li et al.,Anal.Chem.2012,84,6116)o
[0118]动电栗鞘流接口的COMSOL模型预测以及实验验证了灵敏度随着所述毛细管末端靠近所述发射体孔口而增加。毛细管尖端和孔口之间的典型最小距离，在使用150微米外径毛细管时为大约1_，以及当使用375毫米外径毛细管时为大约2.5mm。所述距离的下限阀值被分离毛细管的外径所限制，其最终抵到所述锥形发射体的内壁。
[0119]如本文所述，发明人用氢氟酸蚀刻了分离毛细管尖端的外部几个毫米，将其外径从约15 Ομπι减小到约6 Ομπι或约5 Ομπι。这种简单的步骤允许我们将所述毛细管的末端在很大程度上更为接近所述发射体的孔口(例如，?200μπι)(图3Β和3C)，这样就使系统的灵敏度得到显著的改进。发明人使用了未经涂覆的熔融硅石毛细管(32cm和40cm，ΙΟμπι内径/150μπι外径)进行电泳，以及使用了 Q-Exactive质谱仪进行肽的鉴定。实验的细节陈述与本实施例的实验部分。
[0120]娃石毛细管的制备在SutterInstrument Company Pipette Cookbook中已有描述(2011,Novato,CA,http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf)。然后这些毛细管能够被蚀刻从而为本发明所述的接口提供毛细管。根据一种实施方式，可用毛细管的实施例具有下列尺寸:25_30cm长度，1(^111内径/15(^1]1外径，带有锥形端头(?51111]1长度，?50-60μηι外径)。对于具有较大外径的毛细管(例如250-300μηι外径)，所述蚀刻端头的外径可以减小到大约200μπι外径，例如，在所述毛细管发射体被设置为允许所述毛细管的末端位于距离所述发射体开口不到750μπι的情形。所述毛细管的末端也可被蚀刻使外径减小到约 20μηι 到约 I ΟΟμπι，约 20μηι 到约 80μηι，约 40μηι 到约 80μηι，约 60μηι 到约 80μηι，约 40μηι 到约 60μπι，或约 50μηι 到约 60μηι。
[0121 ]发明人首先评估了对于28pg量E.coli消化物的分离电压的效果。所述分离操作是在32cm长的毛细管内并在15kV(500V/cm)和10kV(300V/cm)的条件下进行的。电泳图谱的形成采用了MaxQuant软件(V.1.3.0.5)(Nat.B1technol.26，1367-1372(2008))。所述1kV电势，与15kV相比，产生了较宽的分离窗区，使得明显更多的蛋白质(129 ± 18vs.88 ± 14)和肽(375±27￥8.246±19)得到鉴另丨」。下述工作中使用了30(^/011的电场。
[0122]然后我们评估了我们的CZE-ES1-MS/MS系统并采用40cm毛细管对于16pg的E.coli蛋白消化物进行分析的可重复性。基于串联质谱三重的自下而上分析，发明人鉴别了 105±17种蛋白质和256±9种肽。对于复杂蛋白质消化物的串联质谱分析的工艺水平是在Ing级别具有?100种蛋白的鉴别。发明人的系统从两个量级较少的样品实现了相同数量的蛋白质鉴别。
[0123]所述分离是可重复并且是高效的。来自50种肽的信号被概括形成提取离子电泳图(图4)。154种肽的迀移时间的平均相对标准偏差为0.7% (图5)。所述电泳峰是相当尖锐的，根据采用高斯函数的标准偏差对峰值进行拟合所定义的平均宽度为0.7s(半高处全宽1.6s)(图6)。对于肽的分离，发明人获得一致的平均超过300,000理论板(图7)。不同的测试之间，峰值强度也是一致的(图8)。分离操作是在不到10分钟的时间完成，与现有的高灵敏自下而上复合蛋白质组分析相比，体现出在分析时间上一个量级的改进。
[0124]然后，我们测定了基于串联质谱的的鉴定数目和E.coli消化物装载之间的关系(图9)。在400fg装载的双重样品中，在对串联质谱的手动评估之后确信地鉴别出了对应于4± I种蛋白质的9种肽。在E.coli中的最大丰度蛋白质，延长因子Tu，构成总蛋白质量的?I % ο这样，对于400f g的E.co I i消化物的分析就会包括大约4f g的这种蛋白。通过串联质谱进行鉴别的最小蛋白量为不到4fg，从而表现出工艺水平上两个量级的提升(Shen et al.，Anal.Chem.2004，76，144)。当样品的装载量增至84pg时，蛋白质和肽的鉴定数目分别增加到 162±8 和 570±11(图 9)。
[0125]发明人还以16pg的E.coli数据作为数据库采用了Smith精确质量和时间标签法。超过60种蛋白质和150种肽被从400fg的E.Coli消化物中被鉴别，质量公差为3ppm，迀移时间公差为0.3min(未对齐)，并且对每个肽具有至少两个被检测的同位素峰(图9)。图10显示了一种典型的提取离子电泳图谱。结果是，对于基于亚皮克蛋白质组分析的AMTs，获得了蛋白鉴定数量上20倍的改进。
[0126]最后，我们从所述400fg的E.Coli数据对肽的检测极限进行了评估。我们对来自延长因子Tu(由MS/MS光谱鉴别出来具有Ippm的质量偏差)的三种肽的电泳图进行了手动提取。利用X calibur软件(Thermo Fisher Scientific)求得信噪比，其中米用峰后0.3min至
2.3min的噪声区域(图11)。基于样品(4fg)中存在的延长因子Tu的量及其分子量(?43kDa)，取?10zmole的这些肽进行分析。这些肽产生的信噪比(S/N)为270?290;质量检测极限(S/N = 3)为?Izmole(?600个分子)，呈现出对基于MS的肽检测工艺水平一个量级的改进。
[0127]针对从CZE-MS系统获得高灵敏度的解释包括以下方面的内容。第一，所述肽只需要0.2s或以下的时间从所述毛细管端部迀移到所述喷射发射体的端部(基于发明人工作的近似计算)，这样大大地减少了样品在喷射发射体的扩散并且形成更高的肽信号，从而获得更佳的肽检测极限。第二，所述分离毛细管和在所述喷射发生器中的电渗流率是大致相同的，由于相似的缓冲剂和施加的电压(?300V/cm)，并且喷射的总流率为大约20nL/min，其产生高的离子化效率，导致高的灵敏度。第三，我们使用了相当窄小内径的毛细管，其减小了样品的流率并且产生非常有效的分离。
[0128]我们还注意到，在本次工作中获得的蛋白质鉴定数量为?200种蛋白，由于相对较短的肽分离窗区，限制了所获串联光谱的数量，这样就限制了生物样品中较低丰度蛋白质的检测。基于CZE-MS系统Waysto改进蛋白质鉴别，是在所述CZE-MS分析之前进行在线/离线肽预分馏，使用较长的分离毛细管以减慢分离，或使用涂覆的毛细管以减少电渗析并增大分离窗区。
[0129]总之，本实施例描述了一种用于飞克蛋白质组学分析的超灵敏和高通量CZE-ES1-MS/MS系统。采用所述系统导致了在由串联质谱所获材料的量、利用精确质量和时间标签法从亚皮克的复杂蛋白质消化物鉴定的蛋白质量、肽质量检测限以及分析时间诸方面的一到两个量级的改进。所述系统可用于单细胞分析。迄今，可用于单细胞蛋白质分析的最高灵敏度的工具采用了激光诱导荧光检测。尽管灵敏，荧光固有地会产生低信息含量的信号，其仅仅提供信息蛋白识别的不完整信息。开发具有1-zmol检测极限的CZE-质谱系统为对较高丰度蛋白具有确信鉴别的单细胞蛋白质分析打开了大门。
[0130]材料:牛胰腺TPCK处理的胰蛋白酶、尿素、碳酸氢铵(NH4HCO3)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)是购自3丨8111&41(^(*(3七丄01^，10)。乙腈(厶0~)、甲酸(卩厶)、氢氟酸(册)是购自 Fisher Scientif ic (Pittsburgh, USA)。甲醇和水是购自 Honeywe I IBurdi ck&Jackson(Wicklow，Irel and)。恪融娃石毛细管(ΙΟμπι内径/150 μπι外径)是购自Pol ymicroTechnologies(Phoenix，USA)。完整的微型蛋白酶抑制剂的混合物(EASY包袋中提供)是购自Roche(Indianapolis，USA)。例如PEEK交叉构件、螺母、套环，套筒和PHFA管道的设备或构件可以购自诸如Idex Health and Science(Oak Harbor，WA，USA)的供应商。
[0131]E.coli样品的制备:E.coli(Dh5_Alpha)是根据Faserl et al.(Anal.Chem.2011，83，7297)所描述的方案培养的。所述E.coli颗粒在经过培养之首先用PBS洗涤(3次)。然后，所述颗粒被悬浮于SM尿素和10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH 8.0)缓冲液，其含有蛋白酶抑制剂，并且在冰上声波处理15分钟以细胞裂解。将所述裂解液在18，000g g离心15分钟，然后米用BCA方法((Cohen et al.,Annu.Rev.Anal.Chem.2008，I，165))测定蛋白质浓度。将等份试样的蛋白质(900yg)用冷的丙酮在-20°C沉淀过夜。离心后，所述蛋白质颗粒用冷的丙酮再次进行洗涤以除去污染物质。蛋白质在室温(?22°C)下培养几分钟至干燥后，被溶于10mM NH4HCO3(pH 8.5)中300yL的8M尿素，然后在37°C历时60分钟进行蛋白质改性，利用DTT (8mM)在60 V还原I小时，并且利用IAA( 20mM)黑暗中在室温下经过30分钟烷基化。
[0132]接着，加入1.2mL的10mM NH4HC03(pH 8.5)以稀释尿素浓度到2M以下。最后，将经过处理的60yL等分试样的蛋白质溶液(36yg)采用胰蛋白酶/蛋白之比为I /30 (w/w)的胰蛋白酶进行消化在37 0C过夜。所述消化物通过甲酸(FA) (0.5 %最终浓度)酸化以终止反应。胰蛋白酶的消化物被利用2丨口11口(:18(1;[11丨口0代，1^(^(^(1，1]3六)进行脱盐，然后由真空浓缩器(Thermo Fisher Scientif ic ,Marietta，USA)进行冻干。干燥后的蛋白质消化物被溶解于含有20% (v/v)CAN的0.05% (v/v)FA含水缓冲液，从而得到浓度为0.lmg/mL和0.01mg/mL的溶液，用于后续分析。
[0133]分离毛细管的制备:采用温和火焰去除Icm长度的聚酰胺涂层，其与熔融硅石毛细管(ΙΟμπι内径/150μηι外径，?50cm长度)的一端相距大约3_4cm。在200yL的Eppendorf管的底部采用比毛细管外径略大的钻头钻一小洞，从而制得反应室。毛细管被拧进所述小洞，从而所烧制部分的毛细管被保持在所述Eppendorf管中。
[ΟΙ34] 最后，将?150yL的氢氟酸(HF，?50%w/w)加入到所述Eppendorf管中，并在风柜中在室温培养?20分钟。蚀刻之后，蚀刻区域的外径为大约60μπι，而毛细管的内径不变，因其未与HF接触。所述毛细管的外部用去离子水洗涤，以除去残余的HF，然后所述毛细管被截至?40cm长，并且在所述末端带有?5mm蚀刻区域。在进行HF溶液的操作过程中，应当小心并采取适当的安全措施。被蚀刻的毛细管依次采用氢氧化钠(IM)、去离子水、盐酸(IM)、去离子水和0.5% (v/v)FA进行洗涤。
[0135]CZE-ES1-MS/MS分析:所述毛细管电泳系统是利用曾经报道过的部件组装而成(see Moini,Anal.Chem.2007,79,4241；Li et al.,Anal.Chem.84,1617-1622(2012)；Sunet al.，Anal.Chem.85，4187-4194(2013))。还可参见图3A。采用两个Spellman CZE 1000R高压电源为所述分离和电喷射过程提供高压。电压程序是通过LabView软件进行控制的。
[0136]分离毛细管的总长度为40cm(对于400fg、4pg和16pg量的E.colUf^t*)S32cm(对于28pg和84pg量的E.coli消化物)。分离缓冲剂为去离子水中的0.5%(v/v)FA，以及鞘液为0.1%(v/v)FA，其中包括10%(v/v)甲醇。样品溶解在含有0.05%(v/v)FA和20%(v/v)乙腈的水性缓冲剂。所述样品利用空气压力(10-20psi和l-9s)被注入分离毛细管，并且所述样品的注射容积是基于Po iseuil I e定律计算的。
[0137]动电栗鞘流接口被用来将毛细管连接到质谱仪。电喷射发射体是由硼硅玻璃毛细管(I.0mm外径，0.75mm内径和1cm长度)米用Sutter instrument P-1OOOf laming/brown型微量移液管拉制器拉成的。所述发射体尖端为?8μπι外径和6μπι内径并带有3mm锥形。分离毛细管的蚀刻端部被抒进aPEEK锥形交叉端口(Upchurch，Oak Harbor USA)并进入所述喷射发射体。所述毛细管尖端和发射体尖端之间的距离为200μπι(见图3B和C)。鞘液通过连接到所述交叉构件的HPFA管路被引入电喷射尖端。所述交叉构件的第四端口连接到注射器，用于实验开始时冲洗发射体。
[0138]喷射电压(HVII，图3Α)在每项试验中为1.2kV。高电压I(HVI，图3Α)对于32cm毛细管为11.2kV(13.2kV对于40cm毛细管)以形成穿过分离毛细管的?300V/cm电场。并且16.2kV的电势作为HVI被施加于28pg量的E.coli消化物，同时对分离条件进行优化。
[0139]为了获得不同的载样量，在含有20% (v/v)CAN的0.05 % (v/v)FA含水缓冲剂中的0.01mg/mL的E.coli消化物被用作400fg实验的样品，以及0.lmg/mL的E.coli消化物被用作4-和84-pg实验的样品。每个样品的分析多进行了两次或三次。
[0140]在实验中使用Q-Exacf