一种生物巯化物的检测方法
【专利摘要】本发明属于生物检测领域，涉及一种生物巯化物的检测方法。主要是利用在酸性条件下生物巯化物及显色剂3，3’，5，5’-四甲基联苯胺竞争与银离子结合，从而抑制银离子引发的显色剂蓝色显色复合物的生成，在波长范围340nm-780nm进行比色测定，用656nm处的吸收峰进行生物巯化物的检测。该方法在实现生物样本中生物巯化物快速测定的同时，兼具操作简单、成本低廉等优点，适用于血清、细胞裂解液等生物样本中生物巯化物的测定。
【专利说明】一种生物巯化物的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，涉及一种用于检测样品中生物巯化物的方法。
【背景技术】
[0002] 生物巯化物，包括半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽等等，在生物体内各生化过 程起着至关重要的作用。它在体内的含量对维持生物机体内氧化还原环境平衡等方面发挥 着重要作用。近年来若干研宄表明，生物机体内生物巯化物浓度的变化常与各类疾病息息 相关，当其在生物体内表达过低时，常会引起生长趋缓、肝脏损伤等，而当其在机体内呈现 高表达时又会引起阿尔兹海默病、帕金森综合症及心血管疾病的发生。因而，生物机体内生 物巯化物的检测可以为这些疾病的临床诊断和治疗提供许多重要的信息。
[0003] 现今检测生物巯化物的技术主要包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、荧光光谱 测定法等等。这些方法在检测灵敏度、选择性、检测时间和稳定性方面各有优势，但同时也 存在操作繁琐、仪器设备昂贵等不足之处。因此，发明一种简单、直观、可行的生物巯化物检 测方法显得非常迫切。
[0004] 比色法是通过比较或测量有色物质溶液的颜色深浅度来确定待测组分含量的方 法，常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律为基 础。目视比色法，只需用眼睛观察就可得到直观的实验现象，光学比色法只需要使用紫外分 光光度计就可以得到灵敏的实验结果，所需实验设备简单、操作简便。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了建立一种生物巯化物的简便检测方法。该方法通过检测体系 中一种常见显色剂3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺所形成的蓝色显色复合物的生成量，即可实 现生物样本中生物巯化物的间接检测。
[0006] -种生物巯化物的检测方法，利用生物巯化物和银离子的强亲和力，在酸性条件 下竞争原本可以使得显色剂3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺溶液显色的银离子，从而抑制显色 剂蓝色复合物的生成，在波长656nm比色测定，通过制定的标准曲线，最终换算成生物巯化 物的浓度。
[0007] 所述的生物巯化物与显色剂3,3'，5,5' -四甲基联苯胺之间对银离子的竞争，显 色剂3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺与银离子的终浓度分别是ImM及100μM。
[0008] 本发明生物巯化物的检测方法，于室温（约25°C)、pH4. 0条件下，加入生物巯化 物样品反应1小时，在波长340nm-780nm进行比色测定，利用656nm的吸收峰进行定量。
[0009] 本发明生物巯化物的检测方法中，采用了一种常见的生物巯化物样品半胱氨酸 (分析纯）为标准样品，测定标准曲线，然后再根据样品比色值结果测算实际生物巯化物的 含量。
[0010] 本发明的有益效果在于，建立了一个可用实际样本生物巯化物的检测方法，通过 溶液颜色的变化实现生物样本中生物巯化物的快速检测的同时，兼具操作简单、成本低廉 等优点，适用于血清、细胞裂解液等生物样本中生物巯化物的测定，在实际生产生活中有一 定的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1为100μΜ半胱氨酸及对照实验的紫外可见吸收光谱图。体系中包括lmM3， 3'，5, 5' -四甲基联苯胺、100μM银离子及（a)对照组，水；(b)对照组，半胱氨酸的巯基阻 断剂N-乙基顺丁烯二酰亚胺（NEM) ; (c)实验组，100μM半胱氨酸；（d)对照组，100μM半 胱氨酸及巯基的阻断剂ΝΕΜ。
[0012] 图2为检测不同浓度半胱氨酸（从a到j分别为0. 5μΜ、1μΜ、10μΜ、25μΜ、 50μΜ、75μΜ、100μΜ、200μΜ、500μΜ、1000μΜ)时得到的紫外可见吸收光谱图。
[0013] 图3为紫外吸收峰值（Abs656nm-753nm)与半胱氨酸浓度的关系图，插入图为半胱 氨酸浓度在〇. 5μΜ-50μM范围内，紫外吸收峰值（Abs656nm-753nm)与半胱氨酸浓度的线 性关系图，插入图为半胱氨酸的标准曲线。
[0014] 图4为检测特异图，体系中含有20种不同氨基酸（从左到右分别为丙氨酸、精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、 赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸）对应的紫外 可见吸收光谱吸收峰值（Abs656nm_753nm)柱状图。
[0015]
【具体实施方式】
[0016] 实施例一：实验原理验证
[0017] 称取TMB粉末，用无水乙醇于37度水浴溶解至浓度为10mM。称取AgNO3粉末、半胱 氨酸粉末、巯基阻断剂NEM，用双蒸水分别溶解至浓度为ImM、10mM、10mM。配制IM醋酸-醋 酸钠缓冲液，pH值4. 0。分别进行以下四组实验：（a) 800μL双蒸水；(b) 750μLlOmMNEM溶 液，50μL双蒸水；（c) 20μLlOmM半胱氨酸溶液，780μL双蒸水；（d) 20μLlOmM半胱氨酸溶 液，750μLlOmMNEM溶液，30μL双蒸水，四个反应体系于室温放置1小时。1小时后，再往 每组实验体系中加入200μLlOmMTMB溶液，200μLlmMAgNO3溶液，800μLlM醋酸-醋酸 钠缓冲液（ΡΗ4. 0)混合1小时后，肉眼观察实验现象并用紫外可见分光光度计进行检测，扫 描波长从320nm-780nm。如图1中a曲线所示，当体系中存在TMB和Ag+时，溶液的颜色会 从无色变成蓝色，即在656nm处出现一个吸收峰，而当体系中存在200μM半胱氨酸时，溶液 的颜色显示为无色（图1，c曲线）。同时图1中b、d曲线则表明，当体系中的巯基被阻断 剂阻断后，溶液颜色依然为蓝色，在656nm处有一个吸收峰，这就证明了体系中溶液颜色的 变化是和疏基相关。
[0018] 实施例二：不同浓度半胱氨酸的标准曲线
[0019]体系中加入 200yLlOmMTMB溶液，200yLlmMAgN03溶液，800μLlM醋酸-醋酸 钠缓冲液混合，再往体系中加入不同浓度的半胱氨酸（〇. 5μΜ、1μΜ、10μΜ、25μΜ、50μΜ、 75μΜ、100μΜ、200μΜ、500μΜ、1000μΜ)的待测标准溶液，室温放置1小时后，肉眼观察实 验现象并用紫外可见分光光度计进行320nm-780nm的扫描。如图2所示，随着半胱氨酸浓 度的提高，在656nm的紫外吸收峰值逐渐减小，而当体系中半胱氨酸浓度为100μM(图2,曲 线g)时，体系的颜色几乎是无色，反应在紫外可见吸收光谱上就是在656nm附近的吸收光 谱几乎是一条直线。这主要是由于随着半胱氨酸浓度的增加，越来越多的Ag+与半胱氨酸上 的巯基结合，进而抑制了Ag+引发的显色复合物的变色。图3为重复多次实验（η= 3)得 出的紫外吸收峰差值与半胱氨酸浓度作图所得。图3中的插入图显示，当半胱氨酸的浓度 在0. 5μΜ-50μM之间变化时，半胱氨酸浓度与紫外吸收峰的变化值呈现良好的线性关系， 可以作为半胱氨酸的定量检测的依据。
[0020] 实施例三：检测方法特异性研宄
[0021] 体系中加入 200yLlOmMTMB溶液，200yLlmMAgNCV^液，800μLlM醋酸-醋酸钠 缓冲液混合，再往体系中加入各20种氨基酸（200μΜ)，室温放置1小时后，肉眼观察实验现 象并用紫外可见分光光度计进行320nm-780nm的扫描。图4所示，在针对20种氨基酸的特 异性实验中，只有半胱氨酸的紫外吸收峰值发生了明显的变化，即在颜色上，只有半胱氨酸 样品组的颜色几乎呈现无色，其他氨基酸实验样本均显示为蓝色，即本方明方法只针对20 氨基酸中的半胱氨酸的检测有效。
[0022] 实施例四：实际生物样本中生物巯化物的检测
[0023] 饲养奶牛，通过颈动脉取血的方式取得奶牛的新鲜血液，以3000Xg离心10分钟 得到新鲜的牛血浆。将离心所得的牛血浆稀释100倍后取50μL，与200μLlOmMTMB溶液， 200μLlmMAgNO3溶液，800μLlM醋酸-醋酸钠缓冲液及蒸馏水混合至总体积2mL，混匀后 室温放至1小时，肉眼观察实验现象并用紫外分光光度计进行320nm-780nm的扫描。检测 结果经分析后，如表1所示，所测牛血浆中生物巯化物的浓度为486μM。同时为了验证体系 的实际可操作性，我们往牛血浆中加了一定浓度的半胱氨酸（1250μΜ、2500μΜ)，根据本 发明方法检测所得到的半胱氨酸浓度与实际加入的半胱氨酸浓度相符合（表I)，证明了该 体系具有实际的操作性，有较好的可信度和重复度。
[0024] 表1牛血清样品实测结果
[0025]
【权利要求】
1. 一种生物巯化物的检测方法，其特征是利用在酸性条件下，生物巯化物和银离子的 强亲和力，竞争原本可以使得显色剂3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺溶液显色的银离子，抑制显 色剂蓝色复合物的生成，在波长656nm比色测定，通过制定的标准曲线，最终换算成生物巯 化物的浓度。
2. 根据权利要求1所述的生物巯化物的检测方法，其特征是所述的生物巯化物与显色 剂3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺之间与银离子结合的竞争。
3. 根据权利要求1所述的生物巯化物的检测方法，其特征是所述的利用生物巯化物中 的巯基与银离子的强亲和力，进行银离子与生物巯基的共价结合。终浓度分别为100 UM及 ImM银离子与显色剂3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺溶液，于室温（约25°C )、pH4. 0条件下，加 入生物疏化物样品反应1小时，在波长340nm-780nm进行比色测定，利用656nm的吸收峰进 行定量。
4. 根据权利要求1所述的生物巯化物的检测方法，其特征是采用半胱氨酸（分析纯） 为标准样品，测定标准曲线，然后再根据样品比色值结果测算实际生物巯化物的含量。
【文档编号】G01N21/31GK104483275SQ201410244414
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】许媛媛, 张源淑, 韩天, 李夏青 申请人:南京农业大学