微生物的检测方法和微生物检测装置的制作方法

专利名称：微生物的检测方法和微生物检测装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过压电振子对例如菌体等微生物的存在与否或者微生物的增殖速度进行检测的方法和微生物检测装置。
背景技术：
目前，对于食品安全的意识正在提高，早期发现使食品或饮料等腐败的腐败菌成为重要的课题。以往，作为进行在食品或饮料等中是否含有腐败菌的判断的方法，使用Immimo Assay (免疫计测法)、ELISA 法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay 酶结合免疫吸附法)、气相色谱质量分析仪(GC/MS:feis Chromatograph/Mass Spectrometry)、液相色谱质量分析仪(LC/MS =Liquid Chromatograph/Mass Spectrometry)等的计测法，但是测定的前处理繁杂，判定的精度也不能说充分。从而，通常为花费很长时间来培养腐败菌的方法。该培养方法通过如下方式进行将可能存在于试样溶液中的腐败菌，在培养温度为30°C 60°C下，例如花费2天到4天进行培养，并在此基础上，进行菌丛的目视检查。但是，该方法难以适用于食物或饮料等需要在短期间内进行判定的试验对象，存在制造后短期间内不能出厂的课题。在专利文献1中，记载了用于识别生物试样的方法，其涉及与传感器阵列结合的成分通过测定其表面上的质量的增加而被直接决定，以及表面的质量增加的检查方法是用石英振子天平，生物试样是真菌、病毒、细菌，但是没有记载本发明。现有技术文献专利文献1 日本特表2000-513436(权利要求第1、7和15项)

发明内容
发明要解决的课题本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供能够在更短的期间内简便且迅速地检测试样溶液中微生物的有无或者微生物的增殖速度的方法。用于解决课题的方法本发明的微生物的检测方法，其特征在于，包括使用在两面形成有电极的压电振子，对在该压电振子的一面侧的电极形成的作为吸附层的培养基层，供给可能混入有作为检测对象的微生物的试样溶液的工序；和通过振荡电路使该压电振子振荡、并测定压电振子的振荡频率的工序，其中，基于上述振荡频率的经时变化，求得微生物的有无和微生物的增殖速度中的至少一者。另外，本发明的另一个微生物的检测方法，其特征在于，包括使用在两面形成有电极的压电振子，对在该压电振子的一面侧的电极形成的作为吸附层的抗体层，供给可能混入有具有通过抗原抗体反应而吸附于上述抗体层的抗原的作为检测对象的微生物的试样溶液的工序；对上述抗体膜供给液体培养基的工序；和通过振荡电路使该压电振子振荡、并测定压电振子的振荡频率的工序，其中，基于上述振荡频率的经时变化，求得微生物的有无和微生物的增殖速度中的至少
“"者 ο另外，举出上述检测方法的具体例子。(a)培养基是层厚为0. 1 μ m 1 μ m的灭菌琼脂培养基。(b)上述压电振子包括在两面形成电极而构成的微生物检测用第一振动区域； 和隔着弹性的边界层设置在与上述第一振动区域不同的区域、且在上述压电振子的两面形成电极而构成的参照用第二振动区域，在上述第一振动区域的一面侧的电极形成有上述吸附层，在上述第二振动区域的任意电极均不形成吸附层。(c)包括将上述振荡频率的测定值作为时间序列数据显示在显示部的工序。(d)测定上述振荡频率的经时变化的工序，在将压电振子放入到具备温度调节部的恒温的培养容器内的状态下进行。(e)微生物是菌体。进而，其他发明是一种检测装置，其使用在两面形成有电极的压电振子，使作为检测对象的微生物吸附于在该压电振子的一面侧的电极形成的抗体层，基于从该压电振子得到的振荡频率的经时变化，求得微生物的有无和微生物的增殖速度中的至少一者，由此对检测对象物进行检测，该检测装置的特征在于，包括培养容器，其具有被供给试样溶液的培养空间，用于在该培养空间中以朝向形成有上述抗体层的面的方式保持压电振子；试样溶液供给部，其对该培养容器供给试样溶液，该试样溶液可能混入有具有通过抗原抗体反应而吸附于上述抗体层的抗原的作为检测对象的微生物；对上述培养容器供给液体培养基的培养基供给部；和用于使上述压电振子振荡的振荡电路。
举出上述检测装置的具体例子。(f)压电振子包括在两面形成电极而构成、并在其中一面侧的电极形成有上述吸附层的微生物检测用第一振动区域；和参照用第二振动区域，其隔着弹性的边界层设置在与上述第一振动区域不同的区域，在上述压电振子的两面形成电极而构成，并且在该两面的电极中的任意电极均不形成吸附层，该检测装置包括使上述第一振动区域振荡的第一振荡电路；和使上述第二振动区域振荡的第二振荡电路。(g)上述培养容器具备用于将培养空间内保持为恒温的温度调节部。(h)上述微生物是菌体。发明效果本发明通过形成在压电振子的电极上的培养基来培养试样溶液中的微生物，将菌体的增殖作为谐振频率的变化进行检测。其结果，能够简便且迅速地检测微生物的有无或者增殖速度。


图1是表示本发明的实施方式的培养装置的一部分的外观立体图。图2是表示上述培养装置的各部件的上表面侧的分解立体图。图3是表示上述培养装置的纵截面图。图4是示意地表示本发明的实施方式的在电极的上表面形成有培养基的石英振子的纵截面图。图5是示意地表示在添加有试样溶液的培养基层中正在培养菌的状态下的上述石英振子的纵截面图。图6是示意地表示上述培养装置的整体结构的图。图7是表示上述石英振子的频率温度特性的1个例子的特性图。图8是表示由上述培养装置的测定结果的1个例子的特性图。图9是表示第二实施方式的微生物检测装置的结构的说明图。图10是表示放置在上述微生物检测装置的培养器内的石英振子的结构的示意图。图11是表示在上述微生物检测装置中使用的石英振子和配线基板的立体图。图12是表示具备上述石英振子的压电传感器的立体图。图13是表示上述微生物检测装置的检测结果的1个例子的特性图。附图标记说明7:培养器4 石英压紧部件10 培养基层15 检测对象物(腐败菌)2 石英振子22:激励电极50:振荡电路51 信号处理部52 个人计算机71 支承体81 盖体
具体实施例方式使用

本发明的菌体检测方法的实施方式。图1和图2分别是表示在该实施方式中使用的培养装置的一部分的外观立体图和分解立体图。7是培养器(培养容器)， 由支承体71和盖体81构成，在两者之间，如图3所示从下方起依次还重叠密封部件3A、配线基板3、石英振子2、石英压紧部件4的各部件而构成。作为压电振子的石英振子2，如图2所示由作为压电片的圆形的石英片21、激励电极22和导出电极M、25(在图4中没有图示)构成。在石英片21的表面侧，箔状的激励电极22形成为直径比该石英片21小的圆形，此外，箔状的导出电极M的一端侧与上述激励电极22连接。该导出电极M沿着石英片21的端面弯曲，迂回到石英片21的背面侧。另一方面，在石英片21的背面侧，激励电极22和导出电极25也与表面侧同样的布局进行连接。上述激励电极22和导出电极M、25的等效厚度例如是0.2 μ m，作为电极材料，例如能够使用金或银等。如图4所示，在石英片21设置的表面侧(与试样溶液接触的一侧)的激励电极 22，形成有成为微生物例如作为菌体的腐败菌的培养环境的作为吸附层的培养基层10。作为该培养基层10，例如能够使用灭菌琼脂培养基。该琼脂培养基的层厚例如是0. Ιμπι 1 μ m。这是因为，层厚为0. 1 μ m以下则菌的增殖难以进行，另外，如果层厚超过1 μ m,则由于琼脂的粘度高而不容易驱动石英振子。在激励电极22上形成培养基层10的方法例如如下述那样进行。首先，在石英晶片的正背两个面，在与多个石英片的形成位置相对应的位置形成电极图案。接着，将该石英晶片在旋转自如的真空卡盘(vacuum chuck)(具备真空吸附功能的旋转台))，在使晶片中心与旋转中心进行对位后的状态下保持为水平。而且，将含有调整为规定的琼脂浓度的培养基的溶液供给到晶片的中心，并且通过与旋转卡盘(spin chuck)的旋转轴连结的电动机使该旋转卡盘旋转，由此，使溶液在晶片的表面扩展，形成薄的液膜。由于能够根据转速来调整该液膜的厚度，因此通过调整该转速，能够在晶片上形成层厚为Ο. μπι Ι.Ομπι的培养基层10。然后，通过切割(dicing)切断晶片，得到石英振子的单片。另外，图面中描绘了仅在激励电极上形成有培养基层10的情况，而如果利用该旋涂法，则在石英片的整个表面形成培养基层10。在该情况下，通过构成为使电极的面积相对于石英片的整个表面面积的比例变大，培养基的重量不会对石英振子的驱动产生影响。 使该时刻的该石英振子的振荡频率作为微生物检测时的基准。这时，如果琼脂浓度为一定， 则粘性阻力视为一定，使用KANAZAWA-G0RD0N的式子。返回图2，配线基板3例如由印刷基板构成，在其表面隔开间隔地设置有电极31、 电极32。在与上述电极31、32之间，如后述那样形成有石英振子2的背面侧的激励电极22 面对的构成气密空间的作为凹部的贯通孔33，其口径形成为收容激励电极22的大小。在配线基板3的后端侧，设置有连接端子部34、35，分别经由导电通路与电极31、32电连接。密封部件3A由在中央形成有凹部的圆形体构成，起到闭塞贯通孔33的下表面并形成为石英振子2的背面侧气氛的气密空间的作用。石英振子2的导出电极M、25用导电性粘接剂进行电连接。石英压紧部件4使用弹性材料例如硅橡胶制作成与配线基板3相对应的形状。在石英压紧部件4的下表面如图3所示，构成为将石英振子2的激励电极的周围部分压紧于支承体71 一侧。石英压紧部件4的作用是，在将石英振子2压紧于在配线基板3形成的贯通孔33的外侧区域、且盖体81安装于支承体71时，石英压紧部件4将石英振子2和配线基板3压紧于支承体71—侧。盖体81如图3所示，通过使形成在下表面的凹部82与设置在支承体71 —侧的突起75嵌合，相对于支承体71进行定位，并通过将螺栓83螺纹嵌入到支承体71 一侧的孔74 中来进行固定。另外，在构成培养器7的盖体81和支承体71设置有作为温度调节部的加热器60，通过该加热器60将放置有培养基层的气氛设定为预先设定的温度气氛(恒温气氛)°支承体71设置有收容并保持配线基板3的凹部72，在该凹部72卡合突起73在垂直方向上延伸，与配线基板3的卡合孔37a、37b和石英压紧部件4的卡合孔46a、46b卡合， 固定配线基板3和石英压紧部件4的位置。
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接着，说明培养装置的电路部分和信号处理部分，图6中，50是振荡电路，51是信号处理部，52是个人计算机，该个人计算机52的画面构成显示部。振荡电路50与在配线基板3形成的电极34、35电连接，例如设置在支承体71。信号处理部51将来自振荡电路50的频率的信号进行模拟/数字转换(A/D转换)，进行规定的信号处理，计测频率信号的频率。接着，对使用这样构成的培养装置来检测试样溶液中是否存在作为目标的菌体的工序进行说明。在该例子中，如果菌体是腐败菌，则准备腐败菌可通过的过滤器(filter)， 使试样溶液通过该过滤器。接着，例如用滴液吸管(spuit)汲取(收集)通过后的液体，滴下到在支承体71安装的已述的石英振子2上的培养基层10的表面上，较薄地延伸。然后， 将盖体81安装于支承体71，通过加热器60将培养器7内的温度(放置有石英振子2的气氛的温度)加热到例如40 60°C，在本例中加热到45°C。然后，上述气氛被气密地保持，培养基层10上的试样溶液蒸发，例如该气氛成为饱和水蒸汽气氛。另一方面在个人计算机52中，按时间序列取入石英振子2的振荡频率的计测值，在其画面上显示该时间序列数据。培养器7内，试样溶液的水分蒸发至成为饱和为止，石英振子2的电极上的试样溶液和培养基层10的合计质量发生变化，但是当确立饱和气氛时，合计质量稳定。如图5所示，如果在涂覆于培养基层10的试样溶液中存在腐败菌 (检测对象物15)，则取入培养基层的养分进行增殖，因此电极上的部分的质量从增殖开始起增加，振荡频率变大。因此，如果将振荡频率的时间序列数据做成曲线显在示例如个人计算机52的画面上，则能够通过例如目视检测振荡频率的上升来确认腐败菌的存在。另外，通过求得振荡频率的增加的幅度(程度)，能够得到腐败菌的增殖速度。这种情况下，如果预先求得振荡频率与搭载在石英振子2的电极22上的搭载物的质量之间的关系，则能够求得例如每规定的时间间隔的增殖速度。另外，在培养器7上连接有分别与上述气氛连通的送气管(送气路径)、排气管(排气路径)(未图示)，在使排气管为开放的状态下，从送气管供给气体例如干燥空气，某种程度地去除石英振子2上的水分。接着也可以，在培养器7内的设定温度下，将例如与饱和水蒸汽气氛相比水蒸汽稍微少一点的空气送入，关闭设置在送气管和排气管中的各个阀，石英振子2上的水分稍稍蒸发而上述气氛成为饱和水蒸汽之后，进行振荡频率的计测。另外，对于培养温度的设定值，优选使其为在菌体的生育温度的范围内，石英振子的频率的温度特性为最稳定的温度。图7中示出了 AT切断的石英振子的频率温度特性的1 个例子。在该情况下，在生育温度范围内，每单位温度变化的频率变化量为最小的温度，优选是曲线的极值时的温度即45°C，将培养温度设定为该温度。试样溶液，在饮用水的情况下能够使其原样通过上述过滤器来作成，而在调查食品中有无腐败菌的情况下，用基于公定法的方法培养腐败菌或者将腐败菌直接混入水中后通过上述过滤器，由此作成试样溶液。根据这样的菌体的检测方法，将试样溶液滴下到培养基层10，在频率稳定以后，例如在数十分钟以后振荡频率开始增加，因此能够在短时间内检测有无菌体。从而，能够迅速地检测在食品或饮用水中是否存在腐败菌。此外，操作简单，测定精度也较高。另外，本发明中所谓菌体是指真菌和细菌等。使用上述的培养装置，如已述那样，使含有腐败菌的试样溶液附着于石英振子2的培养基层10，在频率稳定以后，测定频率差值相对于该频率的经时变化。图8示出测定结果。作为石英振子，使用直径Φ8.7πιπι、9ΜΗΖ的AT切断石英振子(电极直径 Φ 5. 0mm)，频率的计测以IOmHz/秒进行。作为成为检测对象物的菌株，使用AlicyccAaillu acidoterrestris的标准株(ATCC49025)，将它们在层厚为0. 5 μ m的石英振子上的琼脂培养基中在摄氏45度下进行培养。另外，在该琼脂中，添加了酵母提取物(extract)、葡萄糖、 各种微量元素等。如图8所示，从培养开始起大约0. 5小时以后，频率降低1Hz，然后固有频率还持续下降。这是由腐败菌的增殖引起的质量增加导致的，由此能够确认腐败菌的增殖。另外，作为用于检测频率的装置，使用由申请人销售的能够以极高的精度测定频率的装置(登记商标NAPiCOS系统)。另外，通过事先求得表示重量与振荡频率的关系的检量线(校准线)，能够将频率差转换为质量增加量，因此能够使各培养经过时刻的质量变化的速度，即各培养经过时刻的检测对象物的增殖速度数值化。接着，说明利用抗体检测菌体等微生物的第二实施方式。本例的微生物的检测方法中，在石英振子加的激励电极22上设置有抗体层作为吸附层，在该石英振子加的载置气氛中供给培养基溶液(液体培养基)，来进行微生物的培养，这一点与在激励电极22上形成培养基层10并进行培养的第一实施方式的检测方法不同。图9示出了利用第二实施方式的微生物检测方法的微生物检测装置70的结构。图9中，对与第一实施方式共用的结构要素标注与图1 图6中的附图标记相同的标记。在图9所示的微生物检测装置700中，培养器700使用石英压紧部件4和密封部件3A，将由石英振子加和配线基板3a构成的压电传感器保持在培养器700内，这一点与图2、图3所示的培养器7相同。另一方面，在该培养器70的盖体81，设置有用于向该培养器700内供给试样溶液的供给口(port) 704，和用于从培养器700内排出试样溶液的排出口 705，能够从外部供给试样溶液或培养基溶液，这一点与在培养基层10涂敷试样溶液并配置在密闭气氛内的第一实施方式的培养器7不同。培养器700的供给口 704具备抑制试样溶液与培养基溶液的混合的同时暂时保持各溶液的未图示的试样环管(sample loop)，并且在保持有培养基溶液的由注射泵 (syringe bomp)等构成的培养基溶液供给部701、保持有试样溶液的由注射器等构成的试样溶液供给部702之间，连接有切换供给口 704的连接端(目的地)的供给液切换部703。 另一方面，排出口 703经由吸引泵707与排液接收槽708连接，利用该吸引泵707，向培养器 700内进行培养基溶液或试样溶液的供给和排出。另外，本例的培养器700和与石英振子加连接的振荡电路50 —起，配置在例如热风式恒温腔室(chamber) 706内，由此进行石英振子加的配置气氛的温度调节，这一点与使用加热器60进行温度调节的第一实施方式不同。另外，石英振子加与振荡电路50连接，经由信号处理部51，连接到个人计算机52 上，这一点与图6所示的第一实施方式相同。这里，本实施方式的石英振子加中，如图10、图11 (a)、图11(b)所示那样，在石英片21的正背两面设置的激励电极22a、22b设置有2组，分别形成第一振动区域20a和第二振动区域20b。而且，在第一振动区域20a的表面侧的激励电极2 的上表面形成有抗体层 11，该抗体层以在作为检测对象物15的菌体的表面特别含有的膜蛋白质等作为抗原，载持与该抗原发生反应的抗体而成，构成使菌体吸附在激励电极22a的表面的微生物检测用振动区域。另一方面，在第二振动区域20b的激励电极22b的表面，形成有由难以与上述抗原发生反应的蛋白质等构成的阻挡层(blocking layer) 12，菌体难以吸附到该激励电极22b 的表面。从而，第二振动区域20b构成用于检测不起因于微生物的吸附而是起因于其他主要原因(例如后述的环境变化)的振荡频率的变化的参照用振动区域。抗体向激励电极22a的固定，例如通过对另一侧的激励电极22b被预先遮蔽 (mask)的石英振子加的上表面侧供给含有上述抗体的试剂(试药)而露出的激励电极22a 的表面形成抗体层11。阻挡层12向另一侧的激励电极22b的形成也同样，将形成抗体层 11的激励电极2 遮蔽以后，通过使该另一侧的激励电极22b与含有成为阻挡层的蛋白质的试剂接触等来进行。而且，如图12所示，石英振子加配置在能够从第一振动区域20a和第二振动区域 20b分别独立地取出振荡频率的配线基板3a上，各区域20a、20b与各个振荡电路50连接。 在图11、图12所示的例子中，表面侧的激励电极22a、22b经由共用的导出电极M和配线基板3 —侧的电极32被引出到连接端子部35，与振荡电路50 —侧的接地线连接。另一方面，背面侧的激励电极22a、22b经由各个导出电极25和配线基板3 —侧的电极31被引出到连接端子部34，分别与独立的振荡电路50连接。例如，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)等芽胞细菌在50°C 70°C这样比较高的温度条件下也能够增殖，因此成为在这样的温度条件下保存的食品腐败的主要原因。从而，在以芽胞细菌作为检测对象物15的情况下，需要在与食品的保存状态相同的温度条件下，保持与试样溶液接触的石英振子加，测定吸附于抗体层11的菌体的存在与否或者菌体有无增殖。另一方面，已知石英振子加的振荡频率特性根据周围的温度变化或流体的粘度变化等(为了简便，以下称为环境变化)发生变化，但是难以通过短时间的测定来判别振荡频率的变化是由菌体向抗体层11的吸附引起的，还是由恒温腔室706中的温度控制的变动或周围流体的粘度变化引起的。因而，本实施方式的微生物检测装置70在相同的环境下配置有设置有菌体吸附的抗体层11的第一振动区域20a ；和设置有菌体不吸附的阻挡层12的第二振动区域20b。 由此，从第一振动区域20a取得起因于菌体的吸附、环境变化双方的振荡频率的变化，另一方面，从第二振动区域20b去除菌体的吸附，能够取得仅以周围的环境变化为起因的振荡频率的变化。从而，通过取得分别从第一、第二振动区域20a、20b取得的振荡频率的差，能够从第一振动区域20a的振荡频率去除环境变化的影响，能够仅取出以菌体的吸附为起因的振荡频率的变化。以下，说明上述的微生物检测装置70的作用。首先，在培养器700内安装压电传感器，对恒温腔室706的温度进行设定，以使得培养器700内和振荡电路50周围的温度成为例如包含在试样溶液中的食品的保存温度。如果恒温腔室706的温度稳定，则将供给液切换部703连接到培养基溶液供给部701 —侧后，使吸引泵707动作，在培养器700内和与其连接的配管内，充满培养基溶液作为送液缓冲(buffer)。而且，使振荡电路50动作，开始从第一、第二振动区域20a、20b取得振荡频率。然后，将供给液切换部703的连接端切换到试料液供给部702，向培养器700供给试样溶液，在培养器700内被试样溶液置换的时刻(timing)，暂时停止吸引泵707。此时， 在试样溶液中包含表示抗体层11的抗体和抗原抗体反应的芽胞细菌等腐败菌的情况下，
10该腐败菌向抗体层11吸附，如在图13 (a)、图13(b)的记载为“腐败菌吸附”的期间所示那样，第一振动区域20a的振荡频率下降。另一方面，在设置有阻挡层12的第二振动区域20b —侧，由于几乎没有发生腐败菌的吸附，因此没有观察到上述期间中的振荡频率的变化。这里为了简便，在图13(a)、图 13(b)所示的各例子中，从培养基溶液供给部701供给的培养基溶液和从试样溶液供给部 702供给的试样溶液，被预先调整为与在恒温腔室706进行了温度调整的培养器700内的温度大致相同的温度。另外，培养基溶液、试样溶液的粘度也大致一致，不发生以培养基溶液一试样溶液的切换为起因的振荡频率的变化。这样经过预先决定的时间，如果经过了在抗体层11能够吸附足够量的微生物的时间后，则再次将供给液切换部703的连接端切换到培养基溶液供给部701，使吸引泵707 动作，用培养基溶液置换培养器700内。这样，如果培养器700内成为充满了培养基溶液的状态，则再次停止吸引泵707，使培养器700内成为静置状态。这里，在生成了吸附于抗体层 10的腐败菌的情况下，从培养基溶液吸收养分，腐败菌增殖。这时，腐败菌的增殖由于在吸附有该腐败菌的抗体层11的表面附近发生，因此在培养器700内成为静置状态的情况下， 已增殖的腐败菌在培养基溶液内扩散，其一部分吸附于抗体层U。结果，如在图13(a)中记载为“腐败菌增殖”的期间所示那样，以已增殖的腐败菌的吸附为起因，随着时间的经过，第一振动区域20a —侧的振荡频率下降。另一方面，在设置有阻挡层12的第二振动区域20b —侧，依然几乎没有观察到振荡频率的下降。而且，在这些图13(a)中的记载为“腐败菌吸附”和“腐败菌增殖”的期间中，在存在温度变化或粘度变化等培养器700内的环境变化的情况下，在载置于共同的温度下、共同的培养基溶液气氛内的第一、第二振动区域20a、20b中，伴随这些环境变化的振荡频率的变化，以大致相同程度的幅度发生。从而，例如通过取得(取)从第一、第二振动区域20a、20b得到的振荡频率的差值的绝对值，能够抵消伴随环境变化产生的振荡频率的变化，能够取出仅以腐败菌的吸附为起因的振荡频率的变化。而且，与第一实施方式同样，使用表示预先求出的腐败菌的重量与振荡频率的下降量的关系的检量线等，确定腐败菌的吸附量。另外，也可能存在以环境变化为起因的第一、第二振动区域20a、20b的振荡频率的变化量并非严格等量的情况。这种情况下，将预先求出的比例常数乘以各振荡频率，使温度或粘度等的每单位变化下的振荡频率的变化量相互一致后，取2个振荡频率的差值，由此能够将伴随这些温度变化产生的振动频率的变化正确地抵消。另外，如果腐败菌的增殖按指数函数发展下去，则培养基溶液内的腐败菌的浓度升高，使得腐败菌在阻挡层12上沉积等，并且沉积在第二振动区域20b的腐败菌也开始增殖。其结果，如图13(a)中的记载为“第二振动区域20b也增殖”的期间所示那样，存在第二振动区域20b —侧的振荡频率也开始下降的情况。但是，如已述那样，第二振动区域20b 一侧的振荡频率，直到在该区域20b中观察到腐败菌的增殖为止的期间中(相当于图13(a) 中的“腐败菌吸附”和“腐败菌增殖”的期间)几乎没有变化。从而，如果利用在这些期间内得到的数据，则能够正确地进行腐败菌的有无和增殖速度的计测。另外，在试样溶液中包含的腐败菌死亡的情况下，如图13(b)所示的记载为“腐败菌吸咐”的期间中，虽然第一振动区域20a的振荡频率下降，但是由于该腐败菌不增殖，因此该第一振动区域20a的振荡频率没有进一步变化。另外，伴随几乎不吸附腐败菌的情况，第二振动区域2b的振荡频率也保持一定的值。在这样的情况下，以环境变化为起因的振荡频率的变化，通过取从第一、第二振动区域20a、20b得到的振荡频率的差值的绝对值，也能够抵消。依据第二实施方式的微生物检测装置70，在培养器700内配置设置有抗体层11 的石英振子2a，向该培养器700供给试样溶液，根据设置有抗体层11的石英振子2的振荡频率的变化，检测作为检测对象物的微生物的有无或微生物的增殖速度。在以往进行的用光学显微镜等观察在琼脂培养基上增殖的菌体等微生物的方法中，为了确定微生物的有无或增殖速度，需要例如3天 1周左右的试验期间。与此相对，使用石英振子加等压电振子的微生物检测法的灵敏度高，例如，能够检测纳克(nanogram)这样的非常微量的质量变化。从而，不需要等待到对微生物的增殖能够进行光学观察，例如，在10小时 2天这样比以往短很多的时间内，就能够检测出检测对象物的有无或增殖速度。另外，在使用灵敏度高的石英振子加的本方法中，石英振子加周围的温度变化、 与石英振子加接触的液体(试样溶液或培养基溶液)的温度变化、粘度变化等环境变化对石英振子加的振荡频率产生的影响变大。这里，在第二实施方式的微生物检测装置70中， 由于使用包括设置有用于吸附微生物的抗体层11的微生物检测用第一振动区域20a、和不吸附微生物的参照用第二振动区域20b的石英振子2a，因此通过取从2个振动区域20a、 20b得到的振荡频率的差值，能够抵消环境变化的影响，正确地把握以微生物的吸附为起因的振荡频率的变化。这里，在第一实施方式中所示的培养装置和在第二实施方式中所示的微生物检测装置70的各结构，能够根据需要适当地替换。例如，也可以将在第一实施方式中使用的加热器60设置在第二实施方式的微生物检测装置70中，反之，也可以将第一实施方式的培养器7配置在恒温腔室706内。另外，也可以使所谓的流动注射(flow injection)方式的第二实施方式的微生物检测装置70像第一实施方式的培养器7那样构成为分批式(batch type，间歇式)。这种情况下，例如，在没有设置供给口 704、排出口 705的培养器700内，配置在抗体层11预先涂敷有试样溶液的石英振子加，然后，对培养器700内供给培养基溶液后，用盖体81盖住支承体71，将该培养器700内调整为预先设定的温度，由此进行微生物的检测。除此以外，也可以在第一实施方式的培养装置中使用采用了包括微生物检测用第一振动区域20a和参照用第二振动区域20b的石英振子加的压电传感器(以下，称为双传感器(twin sensor))。与此相反，在环境变化的影响不成为问题的情况下，也可以在第二实施方式的微生物检测装置70中，代替双传感器，使用没有设置参照用振动区域20b的图2中记载的石英振子2。
权利要求
1.一种微生物的检测方法，其特征在于，包括使用在两面形成有电极的压电振子，对在该压电振子的一面侧的电极形成的作为吸附层的培养基层，供给可能混入有作为检测对象的微生物的试样溶液的工序；和通过振荡电路使该压电振子振荡、并测定压电振子的振荡频率的工序，其中， 基于所述振荡频率的经时变化，求得微生物的有无和微生物的增殖速度中的至少一者ο
2.根据权利要求1所述的微生物的检测方法，其特征在于 所述培养基层是层厚为0. 1 μ m 1 μ m的灭菌琼脂培养基。
3.—种微生物的检测方法，其特征在于，包括使用在两面形成有电极的压电振子，对在该压电振子的一面侧的电极形成的作为吸附层的抗体层，供给可能混入有具有通过抗原抗体反应而吸附于所述抗体层的抗原的作为检测对象的微生物的试样溶液的工序；对所述抗体膜供给液体培养基的工序；和通过振荡电路使该压电振子振荡、并测定压电振子的振荡频率的工序，其中， 基于所述振荡频率的经时变化，求得微生物的有无和微生物的增殖速度中的至少一者ο
4.根据权利要求1或3所述的微生物的检测方法，其特征在于 所述压电振子包括在两面形成电极而构成的微生物检测用第一振动区域；和隔着弹性的边界层设置在与所述第一振动区域不同的区域、且在所述压电振子的两面形成电极而构成的参照用第二振动区域，在所述第一振动区域的一面侧的电极形成有所述吸附层，在所述第二振动区域的任意电极均不形成吸附层。
5.根据权利要求1或3所述的微生物的检测方法，其特征在于包括将所述振荡频率的测定值作为时间序列数据显示在显示部的工序。
6.根据权利要求1或3所述的微生物的检测方法，其特征在于测定所述振荡频率的经时变化的工序，在将压电振子放入到具备温度调节部的恒温的培养容器内的状态下进行。
7.根据权利要求1或3所述的微生物的检测方法，其特征在于 所述微生物是菌体。
8.—种检测装置，其使用在两面形成有电极的压电振子，使作为检测对象的微生物吸附于在该压电振子的一面侧的电极形成的抗体层，基于从该压电振子得到的振荡频率的经时变化，求得微生物的有无和微生物的增殖速度中的至少一者，由此对检测对象物进行检测，该检测装置的特征在于，包括培养容器，其具有被供给试样溶液的培养空间，用于在该培养空间中以朝向形成有所述抗体层的面的方式保持压电振子；试样溶液供给部，其对该培养容器供给试样溶液，该试样溶液可能混入有具有通过抗原抗体反应而吸附于所述抗体层的抗原的作为检测对象的微生物； 对所述培养容器供给液体培养基的培养基供给部；和用于使所述压电振子振荡的振荡电路。
9.根据权利要求8所述的检测装置，其特征在于压电振子包括在两面形成电极而构成、并在其中一面侧的电极形成有所述吸附层的微生物检测用第一振动区域；和参照用第二振动区域，其隔着弹性的边界层设置在与所述第一振动区域不同的区域，在所述压电振子的两面形成电极而构成，并且在该两面的电极中的任意电极均不形成吸附层，该检测装置包括使所述第一振动区域振荡的第一振荡电路；和使所述第二振动区域振荡的第二振荡电路。
10.根据权利要求8所述的检测装置，其特征在于所述培养容器具备用于将培养空间内保持为恒温的温度调节部。
11.根据权利要求8所述的检测装置，其特征在于 所述微生物是菌体。
全文摘要
本发明的目的在于提供微生物的检测方法和微生物检测装置，能够不改变现有的培养方法，而在更短的期间内判别试样溶液中有无菌体。利用形成在石英振子(2)的电极上的例如厚度为0.1μm～1μm的灭菌琼脂培养基层(10)来培养试样溶液中的菌体，并计测振荡频率。如果菌体增殖，则石英振子(2)整体的质量增加，振荡频率降低。从而，通过监视是否有这样的经时变化，能够迅速地进行试样溶液中有无菌体的判别。
文档编号G01N5/02GK102192860SQ20111006202
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月10日 优先权日2010年3月10日
发明者小山光明, 忍和歌子, 若松俊一 申请人:日本电波工业株式会社