一种水中磺胺嘧啶生物毒性的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水环境中有机污染物风险评价领域，具体涉及一种检测水中磺胺嘧啶 生物毒性的方法。
【背景技术】
[0002] 环境pH对可电离有机化合物的毒性和富集效应具有非常显著的影响，相同浓度的 化合物在不同pH条件下毒性和生物富集显著不同，从而影响这些化合物的风险评价。然而 目前针对不同pH条件下毒性不同只能通过生物测定来确定或者部分根据pH和电离常数进 行估算，生物测定耗时费力，估算准确性差而且不实用。直接根据化学方法测定浓度评价毒 性具有快速，准确的优势，但因为毒性随pH变化，目前还没有一种评价可电离的有机化合物 的生物有效性的化学方法。因此，开发一种能直接测定对水生生物有效浓度的化学方法，建 立能获得对不同pH条件下的可电离化合物生物毒性评价方法，对可电离化合物生态风险评 价和控制水污染具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0003] (一)要解决的技术问题
[0004] 针对现有技术中存在的无法在不同的pH环境中根据添加浓度准确地评价磺胺嘧 啶的生物毒性的缺陷，本发明提供一种检测水中磺胺嘧啶的生物毒性的方法。
[0005] (二)技术方案
[0006] 本发明所述的磺胺嘧啶生物毒性的检测方法，包括如下步骤：
[0007] 1)浓度效应方程的建立
[0008] A、将磺胺嘧啶配制成不同浓度的标准溶液，在其中培养评价水体毒性的模式生 物，并测试模式生物的受抑制率；
[0009] B、通过三相中空纤维液相微萃取技术收集提取标准溶液中的磺胺嘧啶，并对其浓 度进行测定，得到培养模式生物的标准溶液中磺胺嘧啶的浓度；
[0010] C、根据所述模式生物的受抑制率和所述磺胺嘧啶的浓度建立浓度效应方程；
[0011] 2)磺胺嘧啶的生物毒性的检测
[0012] D、采用三相中空纤维液相微萃取技术收集提取样品中的磺胺嘧啶，并对其浓度进 行测定；
[0013] E、根据所述浓度效应方程计算所述样品中磺胺嘧啶对所述模式生物的抑制率。
[0014] 本发明中，所述三相中空纤维液相微萃取过程中选择聚丙烯中空纤维；
[0015] 具体的，本发明选择Q3/2聚丙烯中空纤维（内径600μL?，壁厚200μL?，孔径0·2μL?，孔 率 75%)。
[0016]本发明中，所述三相中空纤维液相微萃取中接受相为pH 8~12的碱性溶液。
[0017]本发明中，所述三相中空纤维液相微萃取中有机溶剂为正辛醇或甲苯。
[0018]本发明中，所述三相中空纤维萃取的过程中选择静态模式，将所述中空纤维在溶 液中静置5~8h。
[0019] 本发明中，所述磺胺嘧啶浓度的检测采用高效液相色谱法，其检测条件为:色谱柱 4 · 6mm X 150mm，ZORBAX SB-C18，粒径5μπι;流动相甲醇：水=30 : 70，所述水中含有0 · 2~ 0.4%乙酸;流速:0.7~0.9mL/min;检测波长266nm;进样量10yL;柱温28~32°C。
[0020] 本发明中，所述模式生物可选择任何用于测试水体毒性的小型水生生物。
[0021] 本发明中优选为大型潘，大型潘具有生活周期短、繁殖快、经济、方便易得、对毒物 敏感和易于在实验室培养等优点，应用于本实验中，可方便快捷地得到结果。
[0022] 优选的，本发明所述的方法，包括如下步骤：
[0023] 1)浓度效应方程的建立
[0024] A、将磺胺嘧啶配制成不同浓度的标准溶液，在其中培养大型潘，并测试大型潘的 受抑制率；
[0025] B、在聚丙烯中空纤维表面形成正辛醇有机液膜，在聚丙烯中空纤维内腔注入pH 10~12的碱性溶液作为接受相，将所述聚丙烯中空纤维浸于培养大型潘的磺胺嘧啶标准液 中6~7h，收集提取磺胺嘧啶;采用高效液相色谱法对所提取的磺胺嘧啶的浓度进行测定， 高效液相色谱的检测条件为:色谱柱4.6mm X 150mm，ZORBAX SB-C18，粒径5μπι;流动相甲醇： 水=30:70，所述水中含有0.2~0.4 % ;流速:0.7~0.9mL/min;检测波长266nm;进样量10μ 1^柱温28~32°(：;
[0026] C、根据所述模式生物的受抑制率和所述磺胺嘧啶的浓度建立浓度效应方程；
[0027] 2)磺胺嘧啶的生物毒性评价
[0028] D、对聚丙烯中空纤维进行如步骤1)所述的处理后，收集提取样品中的磺胺嘧啶， 并采用步骤1)中所述的方法对其浓度进行测定；
[0029] Ε、根据所述浓度效应方程计算所述样品中磺胺嘧啶对大型潘的抑制率。
[0030](三)有益效果
[0031] 本发明所述的方法，具有如下有益效果：
[0032] 1)采用三相中空纤维液相微技术对水中的可电离化合物萃取富集，富集过程中， 分析物穿过中空纤维微孔中的有机液膜，进入纤维内腔的接受相，这与有机化合物进入细 胞的过程类似。同传统的直接计算溶液中可电离化合物的浓度相比，这种方法结果准确，操 作方便。
[0033] 2)以实验溶液的中空纤维液相微萃取提取浓度为基准建立适用于不同pH水中磺 胺嘧啶对大型潘的毒性评价方法，本发明可通过测定磺胺嘧啶在不同环境下的浓度，根据 磺胺嘧啶的浓度效应曲线，
[0034] 计算其生物毒性。
[0035] 说明书附图
[0036]图1:本发明所述方法磺胺嘧啶对大型潘24h抑制率预测值和实测值；
[0037]图2:本发明所述方法磺胺嘧啶对大型潘48h抑制率预测值和实测值；
[0038]图3:对比例所述方法磺胺嘧啶对大型潘24h抑制率预测值和实测值；
[0039]图4:对比例所述方法磺胺嘧啶对大型潘24h抑制率预测值和实测值；
【具体实施方式】
[0040]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0041 ] 实施例1
[0042]本实施例涉及一种水中磺胺嘧啶对大型潘毒性的检测方法，包括如下步骤：
[0043] 1)浓度效应方程的建立
[0044] A、配置缓冲液MES(9.2mM)，然后用0. lmol/L的盐酸和NaOH溶液将其pH调节到6.0， 调节所述缓冲液中磺胺嘧啶的浓度分别为〇，5，10，20，40，80mg/L;把配好的不同浓度的缓 冲液转移到l〇〇mL烧杯中，每一个浓度设置3个重复，每个烧杯中加入50mL磺胺嘧啶缓冲液； 将10只大小、活动能力都相同的出生24h以内的大型潘加入每个烧杯中，将所有烧杯放入同 一个人工气候培养箱中培养，培养条件为温度(20 ± 2) °C，光周期14h: 1 Oh (光照：黑暗），湿 度70%，不喂食培养两天，分别在培养24h和48h时测定潘的受抑制率；
[0045] B、分别取不同浓度的缓冲液各25mL，置于25mL棕色小瓶，用中空纤维液相微萃取 富集，重复三次，具体为:将长12cm的中空纤维用丙酮超声清洗10min，晾干备用；用水注满 中空纤维内腔，将其浸入正辛醇中5min，以形成有机液膜，取出中空纤维，用水将其内、外表 面冲洗5次以洗去残留在表面的有机溶液，通过注射器将接受相(pH为12的氢氧化钠溶液） 注入内腔直至充满，然后弯曲纤维为环状，将纤维两端用热镊子封口后直接浸没于待测缓 冲液中静置萃取，萃取时间为7个小时，萃取完后取出纤维，将两端剪开，一端置于洁净的衬 管中，用充满空气的注射器从另一端将接受相吹入衬管中待测；用高效液相色谱法对所述 衬管中的样品进行检测：
[0046] 色谱检测条件为：
[0047] 色谱柱：4.6mm(id) X150mm，Z0RBAX SB-C18,粒径5μπι
[0048] 流动相：甲醇：水(0 · 2%乙酸）=30:70
[0049] 流速:〇.8mL/min
[0050] 检测波长：266nm
[0051] 进样量：10yL
[0052] 柱温：30 Γ [0053] 标样:磺胺嘧啶。
[0054] C、浓度效应方程的建立
[0055]根据高效液相色谱检测的结果和抑制率分别拟合在24h和48h的回归方程，Y表示 几率值，X表示浓度对数，
[0058] 2)待测样品的生物毒性的计算：
[0059] 配置缓冲液Tris(3.3mM)，然后用0 . lmol/L的盐酸和NaOH溶液分别调节pH到7.5; 根据生物测定预备试验，调节磺胺嘧啶的浓度为0，50，100，200，400，800mg/L，作为待测样 品；
[0060] D、采用同步骤B中相同的方法对样品中磺胺嘧啶的浓度进行测定；
[0061] E、根据步骤C中的浓度效应方程，分别计算样品中磺胺嘧啶对大型潘的抑制率，所 得结果见表1。
[0062] 实施例2
[0063] 同实施例1相比，其区别在于，所述步骤2)中，配置缓冲液Tris(2.0mM)，然后用 0 · lmol/L的盐酸和NaOH溶液调节pH到8 · 5，将其配制成浓度为0，100，200，400，800，1600mg/ L的磺胺嘧啶待测溶液，所得结果见表1。
[0064] 实施例3
[0065] 同实施例1相比，共区别在于，在所述浓度效应方程建立的过程中，聚丙烯中空纤 维的接受相为pH=8的缓冲液。所得到的浓度效应方程为:Y表示几率值，X表示浓度对数，本 实施例所计算得到的抑制率结果见表1。
[0067] 实施例4
[0068] 同实施例3相比，其区别在于，所述步骤2)中，配置缓冲液Tris(2.0mM)，然后用 0 · lmol/L的盐酸和NaOH溶液调节pH到8 · 5，将其配制成浓度为0，100，200，400，80