接触表面微生物采样方法及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种接触表面微生物采样方法，同时还涉及一种接触表面微生物检测 方法，尤其是针对台面类接触表面微生物的采样和检测，属于微生物检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 在食品加工环境中食品表面上附着有各类微生物，其中食源性致病菌是引发公共 卫生安全问题的重要生物危害。食品加工过程中人与食品、食品与食品、食品与设备等之间 的接触会使得这些微生物相互交叉感染，而致病菌对食品尤其是已经过杀菌处理的食品的 感染，会引发食品质量问题，威胁公共健康。因此，食品加工环境中食品接触表面上微生物 的检测不仅是有关部门进行食品及公共卫生安全监测和防控的重要部分，同时也是生产企 业实现对食品加工过程中微生物监控的重要手段。通过该监控手段企业可以验证或评估目 标微生物控制程序的有效性，确保食品质量，推进安全体系的持续改进。
[0003]目前，环境接触表面微生物检测分析方法主要包括平板培养基直接接触培养法、 ATP生物荧光法、蛋白质检测试剂盒法、荧光显微镜检法以及稀释平板计数法。其中平板培 养基直接接触培养法采用直接接触取样的方法，其操作简单，不需要中间处理过程，但是采 样效能低、漏检率大。ATP生物荧光法和蛋白检测试剂盒法是对接触表面存在的ATP或蛋 白质物质信号进行检测的方法，但是接触表面残渣物质中存在的ATP或蛋白质会对检测结 果产生干扰，特异性较差。荧光显微镜检法检测迅速，检测灵敏度和准确度高，但是对检测 设备和检测人员的要求较高，推广有局限性。稀释平板计数法是当前食品加工场所应用最 广泛的表面微生物检测方法，该方法包括表面微生物采样、样品检测前的转运或储藏、样品 处理、样品检测等步骤，其中表面微生物样品的采集是检测的基础，也是检测方法的关键步 骤。采样过程吸附获得表面微生物的效能、微生物采集工具释放微生物至检测体系的效能 以及样品检测前转运或储藏条件对保持微生物数目和活性的效能等决定了检测方法的总 效能。
[0004] 稀释平板计数法常用的采样方法包括涂抹法和贴纸法。涂抹法是指用棉签等拭 子类采集工具在规格板界定范围内左右上下涂抹取样的方法，但是就表面微生物实际采样 状况而言，棉签拭子体积小，在大面积样本采样时操作费时费力，且采样操作过程难以标准 化，结果精密度差。贴纸法是将一定面积的滤纸充分粘贴于待测表面并停留一定时间取样 的方法，该方法较涂抹法操作简单，但是采样过程吸附获得表面微生物的效能较低，检测结 果准确度低。因此，为提高检测过程标准化程度及检测方法的精密度、准确度和检测效率， 实现食品加工过程中环境微生物的有效监测，有必要对接触表面微生物的采样方法作进一 步改进。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种接触表面微生物采样方法，该方法操作简便，采样效能 高（采样量大、损失小）。
[0006]同时，本发明还提供一种接触表面微生物检测方法，该方法操作简便，检测精密 度、准确度和检测效率高。
[0007] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0008] 接触表面微生物采样方法，包括以下步骤：
[0009] 1)将无菌滤纸置于含蛋白胨、表面活性剂和氯化钠的无菌润湿液中浸润；
[0010] 2)将润湿后的滤纸覆盖在待检测表面，停留采样即可。
[0011] 步骤1)中所述润湿液由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨〇. 05~0. 15%，表 面活性剂〇. 05~0. 15%，氯化钠0. 8~0. 9%，余量为水。优选的，由以下质量百分数的组 分组成：蛋白胨0. 1 %，表面活性剂0. 1 %，氯化钠0. 85%，余量为水。
[0012] 步骤1)中所述表面活性剂优选吐温系列，可采用任意一种型号（如吐温-20、吐 温-40、吐温-60、吐温-80,优选吐温-80)或者多种型号的混合物。
[0013] 步骤2)中所述停留采样的时间为10~60s，优选为30s。
[0014] 接触表面微生物检测方法，包括以下步骤：
[0015] 1)将无菌滤纸置于含蛋白胨、表面活性剂和氯化钠的无菌润湿液中浸润；
[0016] 2)将润湿后的滤纸覆盖在待检测表面，停留采样；
[0017]3)将采样后的滤纸置于磷酸盐缓冲液中混勾，取样、计数，计算得到单位检测表面 的微生物数量。
[0018] 步骤1)中所述润湿液由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0. 05~0. 15%，表 面活性剂〇. 05~0. 15%，氯化钠0. 8~0. 9%，余量为水。优选的，由以下质量百分数的组 分组成：蛋白胨0. 1 %，表面活性剂0. 1 %，氯化钠0. 85%，余量为水。
[0019] 步骤1)中所述表面活性剂优选吐温系列，可采用任意一种型号（如吐温-20、吐 温-40、吐温-60、吐温-80,优选吐温-80)或者多种型号的混合物。
[0020] 步骤2)中所述停留采样的时间为10~60s，优选为30s。
[0021] 步骤3)中所述磷酸盐缓冲液优选pH7. 2的PBS缓冲液。
[0022] 步骤3)中所述混匀优选漩涡振荡处理。
[0023] 步骤3)中所述计数优选稀释平板计数法，如10倍稀释后于TSA-0. 6%YE平板培 养并计数。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] 本发明中采样方法操作简便、采样效能高（采样量大、损失小），对接触表面微生 物的机械损伤小，特别适用于大批量台面类接触表面的微生物采样，可显著提高采样效率。 本发明采用含蛋白胨、表面活性剂和氯化钠的润湿液浸润滤纸，可解决干燥状态下微生物 粘附于待测表面而不易被移除的难题，提高滤纸覆盖获取接触表面微生物的采样效能。其 中表面活性剂优选吐温80,可促进微生物从吸附表面分离；同时，蛋白胨能保护接触表面 已受损的微生物细胞再造破坏，减弱采样过程对微生物可能造成的机械损伤。
[0026]本发明中检测方法操作简便，检测精密度和准确度高，适用于大批量台面类接触 表面的微生物检测，可显著提高检测效率。其中采用磷酸盐缓冲液保存采样滤纸，有利于维 持待检测微生物所处环境的稳定性。
【附图说明】
[0027] 图1为试验例中滤纸覆盖法和棉签拭子涂抹法对不同致病菌的检测结果；
[0028] 图2为滤纸覆盖法对接触表面不同致病菌系列浓度污染水平的检测结果。
【具体实施方式】
[0029] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0030] 实施例1
[0031 ] 本实施例中接触表面微生物采样方法，步骤如下：
[0032] 1)将无菌干燥滤纸（5cmX5cm)置于无菌润湿液中润湿，润湿液由以下质量百分 数的组分组成：蛋白胨0. 1 %，表面活性剂0. 1 %，氯化钠0. 85%，余量为水；
[0033] 2)用无菌镊子将润湿后的滤纸取出并平铺覆盖在待检测表面，停留30s采样即 可。
[0034] 接触表面微生物检测方法，步骤如下：
[0035] 1)用无菌镊子将上述采样后的滤纸取下并置于IOmLpH7. 2的PBS缓冲液中，漩涡 振荡混匀30s，使滤纸上的微生物充分释放洗脱至缓冲液中，得处理液备用；
[0036] 2)取少量处理液进行10倍稀释，于TSA-0. 6% YE平板上培养并计数（即稀释平 板计数法），再计算得到单位检测表面的微生物数量，计算公式如下：
[0037]a=Log(4N/m)+n+1
[0038] 式中：a表示每IOOcm2面积接触表面上致病菌对数值，单位为Log(CFU/100cm2);n 表示处理液10倍稀释次数;m表示取液量，单位为mL;N表示n次10倍稀释液取样量m时 对应的平板菌落数CFU。
[0039] 实施例2
[0040] 本实施例中接触表面微生物采样方法，步骤如下：
[0041] 1)将无菌干燥滤纸（5cmX5cm)置于无菌润湿液中润湿，润湿液由以下质量百分 数的组分组成：蛋白胨0. 05%，表面活性剂0. 05%，氯化钠0. 9%，余量为水；
[0042] 2)用无菌镊子将润湿后的滤纸取出并平铺覆盖在待检测表面，停留IOs采样即 可。