冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶elisa检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶ELISA检测方法。本发明方法以抗MTG兔多抗为包被抗体，抗MTG鼠单抗为检测抗体，再结合HRP标记的抗IgG1二抗，构成双抗体夹心ELISA检测方法，对冷冻鱼糜中是否添加MTG进行定量检测。本发明方法检测限为20ng/mL，该检测方法在0.6mg/mL～10mg/mL范围内OD450值与MTG浓度的log值呈线性关系，冷冻鱼糜样品添加回收率为94％以上，板内变异系数为1.12％～4.02％，板间变异系数为5.43％～6.87％。本发明方法灵敏度高，样品前处理简便，适用于冷冻鱼糜中MTG的定量检测，防止冷冻鱼糜原料掺假。
【专利说明】冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶EL ISA检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶ELISA检测方法，属于食品安 全检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 随着生活水平不断提高，生活节奏日益加快，人们对既安全卫生又富含营养、方便 快捷的水产加工食品越发青睐，促使冷冻鱼糜及其制品加工工业的蓬勃发展。目前，生产冷 冻鱼糜的原料主要集中于阿拉斯加狭鳕、太平洋鳕等海水鱼。但由于以往过大的海洋捕捞 强度以及环境污染等原因，近年来主要海洋经济鱼类已严重枯竭，导致海水鱼糜的生产成 本上升。一些不良商贩在制作冷冻鱼糜的过程中通过添加微生物谷氨酰胺转胺酶（MTG)来 增强低等级冷冻鱼糜的凝胶强度将其当做高等级冷冻鱼糜进行贩卖，此种行为严重地损害 了鱼糜制品企业的利益，不利于冷冻鱼糜行业健康有序地发展。
[0003] MTG是微生物发酵产的谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase, TGase，EC 2.3.2. 13)，它通过催化酰基转移反应促进蛋白质之间产生交联反应生成网络状超大蛋白 质分子，从而提高蛋白质的凝胶强度，进而改善食品中蛋白质的质构、外观和风味。为了规 范鱼糜原料市场，预防掺伪原料导致鱼糜制品加工过程产生品质劣变，建立一种可靠的MTG 检测方法迫在眉睫。目前国内对MTG的检测研究仅限于MTG的酶活检测，对于含有内源性 TGase的鱼糜而言，酶活检测并不能确定冷冻鱼糜中是否添加了 MTG。ELISA (酶联免疫吸附 法）是一种把抗原抗体反应的特异性和酶的专一高效催化底物能力二者相结合而设计的 检测方法，该检测方法将具有灵敏度高、特异性强等特点，已经广泛应用于生物学、医学等 领域。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是通过建立双抗体夹心ELISA方法对冷冻鱼糜中的MTG进行定量检 测，为鱼糜加工企业检测冷冻鱼糜原料中是否添加了 MTG提供技术支持。
[0005] 本发明的技术方案为：
[0006] 一种冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶ELISA检测方法，包括以下步骤：
[0007] ①包被：抗MTG兔多抗用包被缓冲液进行稀释至l_3ug/mL，以每孔100uL的量加 入酶标板进行包被，4°C冰箱反应12h ;
[0008] ②洗涤：将酶标板甩干，每孔加入200uL洗涤液，振荡3min，甩干液体并拍干酶标 板，重复洗涤3次；
[0009] ③封闭：每孔100UL封闭液，37°C烘箱反应lh，反应结束后重复上述洗涤步骤；
[0010] ④加抗原：抗原样品与样品稀释液在乳化机作用下匀浆3min，得到的浆液磁力搅 拌12h，之后再6000rpm离心15min，取上清液再次离心（6000rpml5min)，离心得到的上清 液即为待测样品；每孔加入lOOuL待测样品，37°C烘箱反应lh，反应结束后重复上述洗涤步 骤；
[0011] ⑤加检测抗体：抗MTG鼠单抗用抗体稀释液进行稀释，每孔加入100uL，37°C烘箱 反应lh，反应结束后重复上述洗涤步骤；
[0012] ⑥加酶标二抗：酶标二抗用抗体稀释液进行稀释，每孔加入100uL，37°C烘箱反应 lh，反应结束后重复上述洗涤步骤；
[0013] ⑦加显色液：将显色A液、显色B液、30% H202以200:5000:1的比例混合，每孔加 入 100uL，37°C烘箱反应 15min ;
[0014] ⑧加终止液：每孔加入100uL终止液，用酶标仪测定0D45(I值；
[0015] ⑨按①-⑧的检测方法进行操作，绘制双抗体夹心ELISA法MTG浓度测定曲线，以 抗原浓度的log值为横坐标，各孔的〇D 45(l值为纵坐标；
[0016] ⑩掺假冷冻鱼糜按0· 6mg/mL?10mg/mL进行稀释处理，然后按照①-⑧的检测方 法进行操作，通过标准曲线计算测定浓度。
[0017] 所述的包被缓冲液为0· 05mol/LpH9. 6的碳酸盐缓冲液。
[0018] 所述的洗涤液为含0· 05% (v/V)Tween-20的0· 01mol/LpH7. 4的磷酸盐缓冲溶液。
[0019] 所述的封闭液/抗体稀释液为含0. 5% (m/v)BSA的洗涤液。
[0020] 所述的样品稀释液为0. 05mol/LpH8. OTris-HCl缓冲液。
[0021] 所述的显色液A液为5mg/mL的TMB二甲亚砜溶液。
[0022] 所述的显色液B液为pH5. 0柠檬酸缓冲液。
[0023] 所述的终止液为2mol/LH2S04溶液。
[0024] 所述的步骤⑤中，抗MTG鼠单抗用抗体稀释液进行稀释0. 05-0. 15ug/mL。
[0025] 所述的步骤⑥中，酶标二抗用抗体稀释液进行稀释至1:5000-1:6000。
[0026] 本发明的有益效果：本发明方法灵敏度高、回收率高、变异系数小，且易于操作，为 应用酶联免疫吸附法（ELISA)检测冷冻鱼糜中MTG提供了实验依据。目前市场上没有检测 MTG的商业化ELISA试剂盒，可以本发明为基础，进一步构建MTG检测的商业化ELISA试剂 盒。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1冷冻鱼糜MTG最小添加量的确定。
[0028] 图2多抗-抗原-单抗夹心ELISA结果。
[0029] 图3MTG含量标准曲线。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过实例进一步说明本发明的技术内容和效果。
[0031] 主要试剂
[0032] 抗MTG兔多抗，德国Zedira公司；抗MTG鼠单抗，法国Covalab公司；抗IgGl的 HRP-二抗，美国SouthernBiotech公司；微生物谷氨酰胺转胺酶，日本味之素公司；铜盆鱼 冷冻鱼糜，宁波锦海水产食品有限公司；其余试剂均购买自国药集团化学试剂有限公司。
[0033] 主要设备
[0034] 酶标仪MultiscanGo型，美国Thermo公司；酶标板，丹麦NUNC公司；离心机4K15 型，美国sigma公司；隔水式恒温培养箱GRP-9160型，上海森信实验仪器有限公司；电子天 平AB104-N型，美国Mettler. Toledo公司；高速乳化机FA25型，中国FLUKO公司；脱色摇床 TS-1000型，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
[0035] 冷冻鱼糜凝胶强度的测定
[0036] 冷冻鱼糜预解冻后在低温下斩拌，斩拌结束后立即用灌肠机将浆料灌入折径为 52mm的肠衣中，扎牢二端口。将鱼肠放入90°C ±1°C水浴锅中，保持温度加热30min后，立 即取出并投入冰水中，充分冷却15min?20min，取出置于4°C冰箱中，静置12h。将冷却后 的鱼肠剥去肠衣，切成25mm鱼糕段，用质构仪测定其凝胶强度，每个样品10个平行。
[0037] 双抗体夹心ELISA检测方法
[0038] 检测所需溶液：包被缓冲液：0. 05mol/LpH9. 6的碳酸盐缓冲液；洗涤液：含 0· 05% (v/V)Tween-20的0· 01m〇l/LpH7. 4的磷酸盐缓冲溶液；封闭液/抗体稀释液：含 0. 5% (m/v)BSA的洗涤液；样品稀释液：0. 05mol/L pH 8. OTris-HCl缓冲液；显色液A液： 5mg/mL的TMB二甲亚砜溶液；显色液B液：pH5. 0柠檬酸缓冲液；终止液：2mol/LH2S04溶液。
[0039] 检测方法：①包被：抗MTG兔多抗用包被缓冲液进行稀释，以每孔100uL的量加入 酶标板进行包被，4°C冰箱反应12h。②洗涤：将酶标板甩干，每孔加入200uL洗涤液，振荡 3min，甩干液体并拍干酶标板。按上述方法重复洗涤3次。③封闭：每孔lOOuL封闭液，37°C 烘箱反应lh，反应结束后重复上述洗涤步骤。④加抗原：抗原样品与样品稀释液在乳化机 作用下勻楽3min，得到的楽液磁力搅拌12h，之后再6000rpm离心15min，取上清液再次离心 (6000rpm 15min)，离心得到的上清液即为待测样品。每孔加入100uL待测样品，37°C烘箱 反应lh，反应结束后重复上述洗涤步骤。⑤加检测抗体：抗MTG鼠单抗用抗体稀释液进行稀 释，每孔加入lOOuL，37°C烘箱反应lh，反应结束后重复上述洗涤步骤。⑥加酶标二抗：酶标 二抗用抗体稀释液进行稀释，每孔加入100uL，37°C烘箱反应lh，反应结束后重复上述洗涤 步骤。⑦加显色液：将显色A液、显色B液、30% H202以200:5000:1的比例混合，每孔加入 100uL，37°C烘箱反应15min。⑧加终止液：每孔加入100uL终止液，用酶标仪测定0D 45Q值。
[0040] 抗体最佳工作浓度和稀释倍数的确定
[0041] 控制变量法：抗体优化顺序为首先优化包被抗体浓度，再优化检测抗体浓度，最后 优化酶标二抗浓度。优化的结果为选择ELISA显色0D值在1. 0左右的最小抗体浓度为抗体 最佳工作浓度。①包被抗体：用包被缓冲液将抗MTG兔多抗分别稀释至0. 10、1. 00、5. 00ug/ mL，按上述的检测方法进行操作。根据实验结果缩小抗体浓度范围，再次稀释抗MTG兔多抗 进行ELISA实验，最终确定包被抗体最佳工作浓度。②检测抗体：用抗体稀释液将抗MTG鼠 单抗分别稀释至〇. 〇l、〇. l〇、l. 〇〇ug/mL，按上述的检测方法进行操作。根据实验结果缩小抗 体浓度范围，再次稀释抗MTG鼠单抗进行ELISA实验，最终确定检测抗体最佳工作浓度。③ 酶标二抗：将酶标二抗按1:5000、1:6000、1:7000、1:8000进行稀释，按上述的检测方法进 行操作，确定酶标二抗最佳稀释倍数。
[0042] 抗原最佳稀释倍数及检测灵敏度的确定
[0043] 将 MTG 样品分别以 1:10、1:20、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000、1:1500、 1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:10000、1:50000的稀释倍数稀释，按上述的检测方法进 行操作，绘制双抗体夹心ELISA法MTG浓度测定曲线，以抗原浓度的log值为横坐标，各孔 的〇D45(l值为纵坐标。
[0044] 标准曲线的绘制
[0045] 根据双抗体夹心ELISA法MTG浓度测定曲线，在与0D45(I值有线性相关性的抗原 浓度范围内，以测定的抗体最佳工作浓度按上述的检测方法进行操作，绘制冷冻鱼糜中MTG 测定的标准曲线，以抗原浓度的log值为横坐标，各孔的〇D45(l值为纵坐标，作图得到MTG浓 度测定的标准曲线，如图1所示。〇D 45(l值与抗原浓度log值呈现明显的正相关，标准曲线的 回归方程为 Y = 〇· 7633X-L 6448, R2 = 0· 9928。
[0046] 冷冻鱼糜中MTG的回收实验
[0047] 根据冷冻鱼糜凝胶强度的测定的实验结果，向冷冻鱼糜中添加不同浓度MTG模拟 掺假冷冻鱼糜。按得到的最佳抗原稀释倍数对掺假样品进行稀释处理，然后按照本发明的 检测方法进行操作。根据标准曲线计算添加 MTG的回收率，以及板内、板间样品测定的变异 系数。
[0048] 回收率=测定浓度（mg/kg)/添加浓度（mg/kg) X 100%
[0049] 变异系数=测得浓度的标准差（mg/kg) /测得浓度的平均值（mg/kg) X 100%
[0050] 冷冻鱼糜中MTG的添加量
[0051] 要建立冷冻鱼糜中MTG的检测方法首先就要明确冷冻鱼糜中MTG的添加量。目前 鱼糜制品企业主要以冷冻鱼糜的凝胶强度来衡量冷冻鱼糜的品质，且冷冻鱼糜的凝胶强度 每增大100g*cm冷冻鱼糜的等级就上升一级，因此本试验以较空白样品增大冷冻鱼糜凝胶 强度l〇〇g*cm的MTG添加量视为冷冻鱼糜中MTG的最小添加量。添加不同浓度MTG后鱼糜 的凝胶强度如图2所示，考虑到凝胶强度测定过程中的实验误差，本试验选定0. 04%为掺 假冷冻鱼糜中MTG的最小添加量。
[0052] 抗体最佳工作浓度和稀释倍数的确定
[0053] 用控制变量法确定包被抗体、检测抗体、酶标二抗的最佳稀释倍数。实验过程中抗 体的浓度会影响检测反应的准确性和灵敏度，当抗体浓度过低时，孔板内抗体少，可供抗原 结合的抗原决定簇少，抗原不能被充分地特异性结合，检测结果偏低不准确。当抗体浓度过 高时基质效应可能比较明显，降低了反应的灵敏度。一般情况下，0D值在1.0左右时误差 相对较小，所以选择〇D 45(l值在1. 0左右，阴性对照小的抗体浓度作为最佳工作浓度，结果见 表1-3。由表1-3可知，本试验中包被抗体最佳工作浓度为2. 00ug/mL，检测抗体最佳工作 浓度为〇. l〇ug/mL，酶标二抗最佳稀释倍数为1:5000。
[0054] 表1包被抗体最佳工作浓度的确定
[0055]
【权利要求】
1. 一种冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步 骤： ① 包被：抗MTG兔多抗用包被缓冲液进行稀释至l-3ug/mL，以每孔lOOuL的量加入酶 标板进行包被，4°C冰箱反应12h ; ② 洗涤：将酶标板甩干，每孔加入200uL洗涤液，振荡3min，甩干液体并拍干酶标板，重 复洗涤3次； ③ 封闭：每孔lOOuL封闭液，37°C烘箱反应lh，反应结束后重复上述洗涤步骤；④加抗 原：抗原样品与样品稀释液在乳化机作用下匀浆3min，得到的浆液磁力搅拌12h，之后再 6000rpm离心15min，取上清液再次离心（6000rpm 15min)，离心得到的上清液即为待测样 品；每孔加入lOOuL待测样品，37°C烘箱反应lh，反应结束后重复上述洗涤步骤； ⑤ 加检测抗体：抗MTG鼠单抗用抗体稀释液进行稀释，每孔加入100uL，37°C烘箱反应 lh，反应结束后重复上述洗涤步骤； ⑥ 加酶标二抗：酶标二抗用抗体稀释液进行稀释，每孔加入lOOuL，37°C烘箱反应lh， 反应结束后重复上述洗涤步骤； ⑦ 加显色液：将显色A液、显色B液、30% H202以200:5000:1的比例混合，每孔加入 100uL，37°C烘箱反应 15min ; ⑧ 加终止液：每孔加入100uL终止液，用酶标仪测定0D45(I值； ⑨ 按①-⑧的检测方法进行操作，绘制双抗体夹心ELISA法MTG浓度测定曲线，以抗原 浓度的log值为横坐标，各孔的〇D 45(l值为纵坐标； ⑩ 掺假冷冻鱼糜按〇. 6mg/mL?10mg/mL进行稀释处理，然后按照①-⑧的检测方法进 行操作，通过标准曲线计算测定浓度。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包被缓冲液为0. 05mol/LpH9. 6的碳酸 盐缓冲液。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液为含0. 05% (v/v) Tween-20的 0· 01m〇l/LpH7. 4的磷酸盐缓冲溶液。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的封闭液和抗体稀释液均为含0. 5% (m/v)BSA的洗涤液。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品稀释液为0. 05mol/ LpH8. OTris-HCl 缓冲液。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的显色液A液为5mg/mL的TMB二甲亚 砜溶液。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的显色液B液为pH 5.0柠檬酸缓冲液。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的终止液为2mol/LH2S04溶液。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤⑤中，抗MTG鼠单抗用抗体稀释 液进行稀释〇. 05-0. 15ug/mL。
10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤⑥中，酶标二抗用抗体稀释液 进行稀释至1:5000-1:6000。
【文档编号】G01N33/573GK104090102SQ201410266137
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】张灏, 赵建新, 李轶, 黄建联, 范大明, 顾震南, 陈卫 申请人:江南大学