专利名称：一种谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的分离纯化方法
一种谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的分离纯化方法技术领域一种谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的分离纯化方法，属于生物制品 的分离纯化技术领域。本发明涉及一种以阳离子交换色谱和疏水色谱为主要技 术手段的谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的分离纯化方法。
技术背景谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase,简称TGase)是一种催化酰基转移反 应的转移酶，能催化蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的 连接以及蛋白'质分子内谷氨酰胺基的水解反应，从而直接改变蛋白质本身以及 蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性，提高蛋白质的营养价 值，生产出满足人们需求的新型蛋白食品。现在己经广泛应用在许多方面在 食品加工过程中，可以保护食品蛋白质中的赖氨酸避免发生化学反应，从而保 护限制性氨基酸，提高食品的营养价值；在肉制品加工中，谷氮酸胺转胺酶的 交联作用将一些低价值的碎肉进行重组，从而改善其外观、结构、风味，以提 高其营养价值和市场价值；在水产品保鲜中，可通过形成可食性的薄膜，包埋 脂类物质；在乳制品加工中，提高蛋白质的营养性；在医药工业中，谷氨酸胺 转胺酶包埋脂类或脂溶性物质，形成耐热耐水性的膜；在非肉类的豆类食品中， 提高食品的弹性和持水能力；在纺织行业，还被用来提高蚕丝织物以及羊毛织 物的品质。 'Tgase发酵过程中以酶原(Pro-TGase)的形式分泌，Pro-TGase须经过谷氨酰 胺转氨酶激活蛋白酶(TGase-activatingprotease)的切割活化，获得成熟的具有 活性的TGase.而这一激活过程受一种分子量12kDa的蛋白质抑制，即谷氨酰胺 转胺酶激活蛋白酶抑制因子。这一抑制因子对TGase活化过程起调控作用，但 具体的调控机制目前还不清楚。对谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子调控机 制的研究将极大的促进发酵生产TGase水平。谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制 因子的分离纯化是对其调控机制研究的基础，因此，采用简单有效的方法对谷 氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子进行分离纯化成为研究的热点。 发明内容本发明的目的是提供一种谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的分离纯化 方法，采用阳离子交换色谱和疏水色谱为主要技术手段，有效简便的分离纯化 吸水链霉菌所产谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子，使之达到电泳纯，为进
行进一步的调控机制研究奠定基础。本发明的技术方案 一种谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的分离纯化 方法，工艺步骤为(1) 乙醇沉淀将吸水链霉菌(&re/ towyca /^groscc^cw) WSH03 — 13的发酵液离心去除 菌体后，加入乙醇至终浓度为70 %，缓慢搅拌使之完全溶解，并于fC静置10-20 min， 10000 rpm冷冻离心15-30 min，收集蛋白沉淀，将沉淀复溶于适量pH 5.0 的HAc-NaAc缓冲液中，制成上样液。发酵所用菌种吸水链霉菌(5^eptomyces/^gra"opz'c^) WSH03 — 13巳在中 国专利ZL03152956.9公开，授权公告号CN 1208452 C，授权公告日2005年6 月29日。(2) 阳离子交换色谱采用Fractogel EMD S03—阳离子交换柱以pH 5.0的HAc-NaAc缓冲液平衡， 将1个柱体积的上样液以0.5-1 mL/min的速度加入阳离子交换色谱中，用pH 5.0 的含0-1M NaCl梯度的HAc-NaAc缓冲液以同样的速度洗脱至280 nm紫外吸收 峰为0，谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的活性部分在梯度洗脱时的第一个 出峰，收集活性峰；(3) 疏水色谱阳离子交换柱上获得的活性部分用pH 7.0的Tris-HCl缓冲液平衡过夜， Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱以10个柱体积含有10 %NaCl的pH 7.0的 Tris-HCl缓冲液平衡，将1个柱体积的上样液以0.5-1 mL/min,的速度加入疏水色 谱中，用pH7.0的Tris-HCl缓冲液以同样的速度洗脱至280 nm紫外吸收峰为0， 再以1个柱体积的去离子水洗脱，收集活性峰，即为所需要的电泳纯谷氨酰胺 转胺酶激活蛋白酶抑制因子溶液。本发明的有益效果(1) 分离工艺简单，周期短。本分离纯化工艺由酒精沉淀、阳离子交换色 谱和疏水色谱三部分组成，硫酸铵沉淀约为1 h，阳离子交换色谱约为3 h，疏 水色谱约为3h。(2) 作用条件温和，见效快。谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子疏水性 很强，必须用没有离子强度的去离子水才能将其洗脱，因此不用经过高盐洗脱、 梯度洗脱等步骤，可以直接用pH 7.0的Tris-HCl缓冲液将所有杂蛋白去除，随 后用去离子水洗脱，以减少操作时间。
图1经乙醇沉淀初步分离的样品使用阳离子交换柱的分离效果。 图2经阳离子交换柱初步分离的样品使用疏水柱的分离效果。
具体实施方式
以疏水色谱为主要手段对角质酶进行分离纯化，其具体步骤如下 (1 )吸水链霉菌发酵生产含谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的发酵液以吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus) WSH03 — 13为出发菌株，将培养 至对数生长期的种子接入发酵培养基中，32。C培养30 h，得到含谷氨酰胺转胺 酶激活蛋白酶抑制因子的发酵液。(2) 乙醇沉淀将发酵液离心去除菌体后，加入乙醇至终浓度为70%，并缓慢搅拌使之完 全溶解，并于4。C静置10-20 min， 10000 rpm冷冻离心15-30 min，收集蛋白沉 淀，将沉淀复溶于适量pH5.0的HAc-NaAc缓冲液中，制成上样液。(3) 阳离子交换色谱采用Fmctogel EMD SOr阳离子交换柱以pH 5.0的HAc-NaAc缓冲液平衡， 将1个柱体积的上样液以0.5-1 mL/min的速度加入阳离子交换色谱中，用pH 5.0 的含0-1M NaCi梯度的HAc-NaAc缓冲液以同样的速度洗脱至280 nm紫外吸收 峰为0，谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的活性部分存在于梯度洗脱时的第 一个出峰，收集活性峰，分离效果如图l。(4) 疏水色谱阳离子柱获得的活性部分用pH 7.0的Tris-HCl缓冲液平衡过夜。Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱以10个柱体积含有10 %NaCl的pH 7.0的Tris-HCl 缓冲液平衡，将1个柱体积的上样液以0.5-1 mL/min的速度加入疏水色谱中， 用pH7.0的Tris-HCl缓冲液以同样的速度洗脱至280nm紫外吸收峰为0，再以 1个柱体积的去离子水洗脱，收集活性峰，即为所制备的电泳纯谷氨酰胺转胺酶 激活蛋白酶抑制因子溶液，分离效果如图2。
权利要求
1、 一种谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的分离纯化方法，其特征是工 艺歩骤为(1) 乙醇沉淀将吸水链霉菌(5^印tomycw /zygmycopz'cM) WSH03 — 13的发酵液离心去除 菌体后，加入乙醇至终浓度为70 %，缓慢搅拌使之完全溶解，并于fC静置10-20 min， 10000rpm冷冻离心15-30min，收集蛋白沉淀，将沉淀复溶于适量pH 5.0 的HAc-NaAc缓冲液中，制成上样液；(2) 阳离子交换色谱采用Fractogel EMD S03—阳离子交换柱以pH 5.0的HAc-NaAc缓冲液平衡， 将1个柱体积的上样液以0.5-1 mL/min的速度加入阳离子交换色谱中，用pH 5.0 的含0-1M NaCl梯度的HAc-NaAc缓冲液以同样的速度洗脱至280 nm紫外吸收 峰为0，谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的活性部分在梯度洗脱时的第一个 出峰，收集活性峰；(3) 疏水色谱阳离子交换柱上获得的活性部分用pH 7.0的Tris-HCl缓冲液平衡过夜， Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱以10个柱体积含有10 %NaCl的pH 7.0的 Tris-HCl缓冲液平衡，将1个柱体积的上样液以0.5-1 mL/min的速度加入疏水色 谱中，用pH 7.0的Tris-HCl缓冲液以同样的速度洗脱至280 nm紫外吸收峰为0， 再以1个柱体积的去离子水洗脱，收集活性峰，即为所制备,的电泳纯谷氨酰胺 转胺酶激活蛋白酶抑制因子溶液。 '
全文摘要
一种谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的分离纯化方法，属于生物制品的分离纯化技术领域。本发明采用吸水链霉菌为出发菌株，经液体深层发酵制备的谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子，在经过乙醇沉淀、阳离子交换色谱和疏水色谱之后，得到了电泳纯的谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子溶液，可用于后续的蛋白质测序和性质研究。该方法步骤简单，酶纯度高，是一种简便有效的酶分离纯化方法。
文档编号C07K1/36GK101121747SQ20071002372
公开日2008年2月13日 申请日期2007年7月6日 优先权日2007年7月6日
发明者敬 吴, 堵国成, 张东旭, 坚 陈 申请人:江南大学