专利名称：一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中提取谷氨酰胺转胺酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中提取谷氨酰胺转胺酶的方法，特别是用有机溶剂沉析的方法，属于微生物发酵法制备谷氨酰胺转胺酶
背景技术：
谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-γ谷氨酰胺转移酶，Transglutaminase EC 2.3.2.13，TG)，又称转谷氨酰胺酶，谷氨酰胺酰-肽γ-谷氨酰胺酰基转移酶。它可以催化蛋白质分子内的交联、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺酰胺基的水解，从而进一步改善蛋白质功能性质，提高蛋白质的营养价值，生产出满足人们需求的新型蛋白食品，在食品加工中具有极其重要的作用。此外，该酶还可用于毛织物加工，用于酶的固定化或将不同分子之间进行联接，将抗体与药剂进行联接等，所以谷氨酰胺转胺酶在纺织工业、医药工业也有很好的应用前景。被誉为“21世纪超级粘合剂”。
国外对谷氨酰胺转胺酶的研究已较为深入。生产谷氨酰胺转胺酶的方法主要有①从动植物组织中提取(此法提取的谷氨酰胺转胺酶简写为TG)，②微生物发酵法生产(此法生产的谷氨酰胺转胺酶MicrobialTransglutaminaSe，简写为MTG)。
从动植物组织中提取谷氨酰胺转胺酶，见诸报道的如Brookhart等人1983年从豚鼠肝脏中提取；Yasueda等人1994年从鱼组织中提取；Falcone等人1993年从植物组织中提取。通过离心、过滤、层析等分离纯化过程得到纯化了230倍的TG。上世纪六十年代以来，对来自动物体，主要是豚鼠肝脏的谷氨酰胺转胺酶的纯化方法、性质以及应用进行了广泛的研究[Folk and Cole1965，1966；Connellan et al.1971；Folk 1980；Brookhart et al.1983；Matheis and Whitaker 1987；Ikura 1988；Miwa 1989；Singh 1991；Larre etal.1992，1993]。豚鼠肝脏是近三十年来商用谷氨酰胺转胺酶的唯一来源，这种稀有的来源、复杂的分离纯化工艺，导致了这种酶的售价较高。来自植物体(豌豆种子、羽扇豆种子)的TG的分离纯化工艺还不成熟。由此可见，来自动物、植物中的TG很难应用于食品工业。
微生物发酵法生产MTG已受到了国内外学者的广泛关注，尤其日本、丹麦、荷兰等国家投入了大量的人力、财力研究与开发。国内本校江南大学环境生物技术研究室从1997年就开展了微生物发酵法生产MTG的研究工作。目前已取得实验室试验中，酶活达到3.0u/ml；在10L发酵罐中，酶活达到3.2u/ml；300L发酵罐中，酶活达到3.15u/ml的成果。
MTG是一种胞外酶，分泌在发酵液中，因此，分离、提取处理过程与其它酶制剂相似。发酵结束后，先对发酵液进行离心分离，除去菌体，然后对上清液进行处理，可得到酶制剂产品。应用其它酶处理过程相似的技术，如离子交换、色谱、纸层析、超滤等也可用于MTG的纯化处理。据报道将这些方法有机结合使用，可提高酶的纯度和分离效率。某些方法在提取时还需向酶中加入酶稳定剂，如各种盐、蛋白质、类脂及表面活性剂等。
Ando和Motoki等人1989年提出了从MTG发酵液中提取MTG的方法。发酵液经离心分离得到上清液，经超滤浓缩得浓缩液，通过CG-50离子交换树脂得到活性酶，再次通过CG-50离子交换树脂得到活性酶，通过稀释，通过蓝琼脂糖柱得到MTG酶产品，酶被纯化了174倍，酶活的总回收率为42％。
Geber等人1994年对提取MTG方法进行改进，发酵液被离心和过滤后，通过强酸性(Fractogel EMDS03-)离子交换树脂，得到纯化了128倍的MTG，酶活的平均回收率达60％。离子交换的方法虽然分离效果好，酶活收率较高，酶较为稳定，但由于其操作复杂、成本高昂，只适用于实验室小规模的应用，却不能满足大规模的工业提取及应用。
发明内容
(1)所要解决的技术问题本发明提供一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中提取MTG的方法。发酵液不需经过离子交换处理，操作简便，高效，费用低，成品纯度高，节约能耗，对环境污染小，易于工业化生产。
(2)技术方案将谷氨酰胺转胺酶发酵液经压滤、超滤浓缩、溶剂沉析、离心分离、真空干燥、成品包装而制得成品谷氨酰胺转胺酶，在溶剂沉析、真空干燥、成品包装前可加入辅料参与工艺进行。
本发明的具体操作步骤如下压滤将谷氨酰胺转胺酶发酵液直接进行板框压滤，去除菌体，压滤得到的滤液进行超滤等下道工序。对于滤渣菌体，进行收集菌体，机械破碎，释放胞内酶，加入适量清水得到酶液。按照与滤液相同的方法，单独重复进行提取MTG，以提高酶的提取率。
超滤浓缩将压滤得到的滤液通过超滤膜进行超滤浓缩。滤液通过截留分子量为10,000的超滤膜超滤浓缩，用冰块或循环水控制酶液温度在10℃以下。至此，酶活收率平均在86.5％左右，较好的批次收率可达90％以上。
溶剂沉析将得到的超滤浓缩液添加一种辅料，在低温下加入一种有机溶剂进行沉析操作。将超滤浓缩得到的浓缩液预冷至10℃以下，置于贮罐中按浓缩液重量的1％(w/w)加入辅料，充分搅拌，缓慢加入1.5～2倍(v/v)于浓缩液体积的有机溶剂乙醇进行沉析。辅料采用大豆蛋白或酪蛋白。
离心分离将得到的酶乙醇沉析液于10℃以下，3000r/min离心8分钟。上清液含有约60％的乙醇，可回收利用，沉淀物即为酶泥。
真空干燥适当分散酶泥以增大其比表面积，按酶泥的8～9倍(w/w)加入辅料，然后进行真空干燥，真空干燥温度为35℃以下，真空度为-700mmHg～-760mmHg。辅料采用大豆蛋白或酪蛋白和复合磷酸盐。
成品包装将粗酶粉碎，按需要添加辅料至成品酶制剂活力为50～100u/g，抽真空包装得到成品，10℃以下保存。辅料采用大豆蛋白或酪蛋白和复合磷酸盐。
(3)有益效果本发明不仅可以在实验室中方便的实施，而且极易在工业生产中运用。本发明中各工序采用的添加辅料，可以降低酶活的损失，保持酶活，从而提高酶的提取收率和纯度，提高质量，降低成本。辅料主要包括大豆蛋白或酪蛋白和复合磷酸盐。其中大豆蛋白或酪蛋白本身可以作为酶的底物，保持酶的活性；而复合磷酸盐的存在有助于谷氨酰胺转胺酶的催化反应。添加辅料进行真空干燥，与直接真空干燥相比，可以缩短干燥的时间，减少能耗，减少干燥过程中酶活的损失。成品添加辅料还有利于保护谷氨酰胺转胺酶的活性，延长酶的保存期。同时真空干燥所采用的设备简单，占地面积小，操作方便，成本低廉，效率突出，易于实现从实验室到工业生产的放大。
具体实施例方式
实施例1发酵得到的谷氨酰胺转胺酶发酵液，发酵酶活3.0u/ml。经过板框压滤、超滤、添加1％的辅料(w/w)充分搅拌后，缓慢加入1.5倍(v/v)于浓缩液体积的乙醇进行沉析，离心，酶泥进行真空干燥，温度35℃，真空度-740mmHg。粗酶粉碎后按需加入大豆蛋白和复合磷酸盐。酶活收率63.8％。
实施例2改变为用乙醇进行沉析时不添加辅料，其它操作同实施例1。结果酶活收率57.9％。
实施例3真空干燥前加入0.2％的淀粉，其它操作同实施例1。结果酶活收率40.4％。
实施例4真空干燥前按酶泥的8～9倍(w/w)加入大豆蛋白和复合磷酸盐辅料，其它操作同实施例1。结果酶活收率70.4％。
以实施例4和前3例相比较，显然真空干燥前添加一定量的蛋白辅料可以获得较高的酶活收率。
权利要求
1.一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中提取谷氨酰胺转胺酶的方法，其特征是发酵液经压滤、超滤浓缩、溶剂沉析、离心分离、真空干燥、成品包装而制得成品谷氨酰胺转胺酶，在溶剂沉析、真空干燥、成品包装前加入辅料参与工艺进行；压滤将谷氨酰胺转胺酶发酵液进行板框压滤；超滤浓缩将压滤得到的滤液通过超滤膜进行超滤浓缩，膜截留分子量为10,000，控制酶液温度在10℃以下；溶剂沉析将得到的超滤浓缩液加1％(w/w)辅料，充分搅拌，缓慢加入1.5～2倍(v/v)于浓缩液体积的溶剂进行沉析，温度10℃以下；离心分离对上清液回收再利用有机溶剂，沉淀物即为酶泥；真空干燥按酶泥的8～9倍(w/w)加入辅料，然后进行真空干燥；成品包装将粗酶粉碎，按需要添加辅料至成品酶制剂活力为50～100u/g，抽真空包装得到成品，10℃以下保存。
2.根据权利要求1所述的一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中提取谷氨酰胺转胺酶的方法，其特征是板框压滤后的滤渣菌体，进行收集菌体，机械破碎，释放胞内酶，加入清水得到酶液，单独重复进行提取谷氨酰胺转胺酶。
3.根据权利要求1所述的一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中提取谷氨酰胺转胺酶的方法，其特征是溶剂沉析所用溶剂为乙醇。
4.根据权利要求1所述的一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中提取谷氨酰胺转胺酶的方法，其特征是在溶剂沉析之前所加辅料为大豆蛋白或酪蛋白；在真空干燥和成品包装前所加辅料为大豆蛋白或酪蛋白和复合磷酸盐。
5.根据权利要求1所述的一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中提取谷氨酰胺转胺酶的方法，其特征是离心分离温度控制在10℃以下，3000r/min离心8分钟。
6.根据权利要求1所述的一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中提取谷氨酰胺转胺酶的方法，其特征是真空干燥温度为35℃以下，真空度-700mmHg～-760mmHg。
全文摘要
一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中提取谷氨酰胺转胺酶的方法，特别是用有机溶剂沉析的方法，属于微生物发酵法制备谷氨酰胺转胺酶技术领域。本发明解决了发酵液不需经过离子交换处理，易于工业化生产的技术问题。本发明中，发酵液经压滤、超滤浓缩、溶剂沉析、离心分离、真空干燥、成品包装而制得成品谷氨酰胺转胺酶，在溶剂沉析、真空干燥、成品包装前加入辅料参与工艺进行。添加辅料对于提高酶活收率有显著效果。压滤后收集滤渣菌体，机械破碎，加适量清水配成酶液后，以相同的方法单独重复进行提取，以提高酶的提取率。本发明的优点是工艺合理、设备简单、操作方便、成本低廉，易于实现工业化生产。
文档编号C07K1/00GK1417327SQ0214852
公开日2003年5月14日 申请日期2002年12月10日 优先权日2002年12月10日
发明者陈坚, 堵国成, 燕国梁, 伦世仪 申请人:江南大学