一种交通性脑积水的基因检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测方法，特别是交通性脑积水的基因检测方法。
【背景技术】
[0002]脑积水分为交通性脑积水和非交通性脑积水，正常人的脑脊液的形成和吸收是一个动态的平衡过程。脑脊液的形成是由侧脑室的脉络丛产生的，脉络丛产生的脑脊液经过其他脑室，经过小脑与脑桥的间隙流到蛛网膜下腔，经过蛛网膜下腔的血管重新吸收，以达到平衡。如果脉络丛产生的脑脊液过多或者蛛网膜下腔发生纤维化，就会导致交通性脑积水，先天性的交通性脑积水患儿起初没有明显的临床表现，随着脑脊液的增多，患儿表现为明显的头围增大，语言认知能力受到影响，肢体瘫痪；患儿需要做脑脊液分流手术，即从侧脑室分流过多的脑脊液经导管到腹腔中进行治疗；因此对患儿的早期诊断非常重要，可以实现早诊断早治疗；当前的诊断主要是核磁共振扫描技术，通过对病人脑部扫描，确定Evan比例，即侧脑室最宽的部分与脑部最宽的部分的比例，如果大于0.3即为脑积水，但核磁共振扫描所需费用高，对病人体动敏感，易产生伪影，扫描时间长，部分病人会有幽闭恐惧症；而且当用核磁共振技术扫描后判断的脑积水是要等到病人发病甚至病重后才能被确诊，这样很不利于病情的控制，而脑积水病人如果早诊断早治疗的话会有效控制病情，因此，重点研发新的简单迅速费用低廉灵敏度高，特异性强，可早期诊断的交通性脑积水的体外基因检测方法，对于交通性脑积水患者提前预警及采取有效的治疗手段意义重大。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种可以取样方便，灵敏度高，特异性强，可早期诊断的基因检测方法。
[0004]一种交通性脑积水的基因检测方法，以TGF-β I的特异性核酸定量标准品为对照，即 TGF- β I 的部分序歹I」:5' -gagcagcggaccgaggaccagacgcggatctccgtagaacaggaggaaatggagtacttcgccaaggtgccgcacaagttcaacatgagtataaacagtacagcaatcatggggaacaaaaatgtcgcagttcccttcaacatatctgagatacgacaaagtgtcgggaaataccaccagctaaccagcgcagagttgcggattcacatcaagaaacctatgatactcgaagaccaacgggtggaactctactacggtctggacccctcagctcgatacctcactactcgcttaatcaataacaagatgaaagacaaatggatttcctttgatgtgacagaacctctacggaaatggctt-3’，直接用待测病人的静脉血为样本，其特征在于，包含以下方法步骤:
(1)提取RNA
采取待测病人一定量的标本经前处理，按照常规方法提取RNA，气干后加入lOulDEPC水溶液溶解RNA ；
(2)荧光PCR扩增
取定量荧光扩增试剂，加入适量DNA聚合酶与防污的尿嘧啶糖基酶，逆转录酶于薄壁试管中，混匀，3000rpm离心数秒，取上述混合液于薄壁管中，同时至少预备两份装有上述混合液的管，一份加入步骤一制备的RNA溶液，另一份加入已经标定的标准品作为对照，立即进行聚合酶链式扩增反应；
(3)荧光扩增
样品反应管及对照标准品反应管置于定量荧光PCR仪检测，设置循环条件，进行荧光检测；
(4)结果分析
选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整6-16个循环的荧光信号；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，判断为阳性。
[0005]所述的步骤(2)荧光PCR扩增中，荧光扩增检测试剂包括一步法RT-PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、特异扩增引物及特异性探针；所述的特异扩增引物是:
引物 S1:引物序列为 5’ -atgaggctgactctcttgac- 3’
引物 S2:引物序列为 5’ -agctacacttgcaatacttc-3’
所述的特异性探针是
探针 S3:探针序列为 5’ -R-agtcagatcctcagcaagct-Q-3’
其中R为报告基因，Q为淬灭荧光基因。
[0006]所述的检测方法，其特征在于所述的荧光扩增检测试剂为由下列组分以双蒸水为溶剂混合而成:
一步法RT-PCR缓冲液:
500mM 氯化钾、10mM Tris_Cl、15mM 氯化镁、0.lmg/ml 聚乙二醇 6000、0.1% 1，4_ 二巯基苏糖醇、l%g/ml牛血清白蛋白，
脱氧三磷酸核苷dNTP混合物含量100-400uM，
特异性扩增引物SI含量0.06-1.3 uM，
特异性扩增引物S2含量0.06-1.3uM，
特异性探针S3含量0.06-0.8 uM，
余量为双蒸水。
[0007]所述的检测方法，其特征在于所述的检测方法步骤(2)荧光PCR扩增为:
取35ul荧光扩增检测试剂，加入0.4ulDNA聚合酶与防污的尿嘧啶糖基酶，Iul逆转录酶于薄壁试管中，混匀，3000rpm离心数秒，取上述混合液于管中，同时预备两份装有上述混合液的管中，一份加入步骤一制备的RNA溶液4ul，另一份加入已标定好的标准品作对照，立即进行聚合酶链扩增反应:
所述的检测方法步骤(3)荧光检测为:
样品反应管与对照标准品管置于定量荧光PCR仪检测，在仪器推荐循环条件设置:45°C持续30min ;升温95°C持续5min ;再94°C持续1sec ;降温55°C持续12sec ;升温72°C持续lOsec，循环10次；再按93°C持续1sec ;降温至58°C持续45sec，循环40次；单点荧光检测在60°C;推荐循环条件设置:45°C持续20min ;升温94°C持续2min ;按93°C持续2sec ；降温55°C持续15sec ;升温72°C持续12sec，循环50次；单点荧光检测在55°C。
[0008]本发明的基因检测方法，采用逆转录聚合酶链式反应技术，对特异性核酸片段进行荧光定量检测，该方法适用于对血液中的特异性片段进行荧光的检测，该检测方法的核心是荧光扩增检测试剂中针对TGF-β I的特异性RNA核酸片段进行荧光的检测，该检测方法的核心是荧光扩增检测试剂中针对TGF-β I的特异性引物和探针，特异性引物S1，S2，特异性探针S3，TGF-13 I特异性核酸定量标准品核心是一段TGF-β I特异性核酸序列，特异性探针S3是TaqMan聚合酶链反应技术的核心,该探针5’端标记一报告突光基团(R), 3’端标记一淬灭荧光基团(Q)，报告荧光R基团由FAM (羧基荧光黄)，HEX (6-氯荧光黄)，TAMARA(四甲-6索罗丹明)，淬灭基团Q有=TAMARA (四甲-6羧罗丹明)，报告荧光基团R及淬灭基团Q可以根据方便选用。其中R为报告基因，Q为淬灭荧光基因。
[0009]本发明的原理为，在交通性脑积水病人中，血小板的颗粒细胞会释放TGF-β 1，TGF-β I会和细胞膜上的受体结合，使得受体发生磷酸化，磷酸化受体，激活Smad2 andSmad3 ,使其磷酸化,磷酸化的Smad2 and Smad3和Smad4结合,进入到细胞核中，促进转革巴基因转录，蛛网膜的成纤维细胞合成胶原和纤粘连蛋白FN、层粘连蛋白LAMINA等细胞外基质的合成，导致蛛网膜下腔发生纤维化，重新吸收脑脊液受阻，因此对有出现头痛、恶心、呕吐、视力障碍等智力发育障碍，运动功能障碍等脑积水症状的患者中的外周血中的TGF- β I检测，如果TGF- β I增高，则为交通性的脑积水。
[0010]本发明用的荧光PCR的技术原理是，在PCR反应体系中除了常规一对弓I物外，另有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针，该探针的5’端与3’端分别标记上不同的荧光基因，探针5’端标记一报告荧光基因R，3’端标记一淬灭荧光基因Q，当探针保持完整时，5’端荧光基团R吸收光能后会将能量转移给临近3’端荧光淬灭基团Q，其Q基团抑制了 R基团的荧光信号，但在PCR延伸反应过程中，DNA聚合酶的外切酶把5’端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了 3’端淬灭基团的屏蔽，既能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，因而根据荧光PCR反应中的荧光Ct值，就能算出原始的模板量。因此对于在临床上有脑积水症状的患者，如出现头痛、恶心、呕吐、视力障碍等智力发育障碍，运动功能障碍，用本发明的检测方法对其外周血进行检测，为早期诊断提供依据。
[0011 ] 本发明的优点体现在:
1、本发明可以应用于交通性脑积水的检测，目前对交通性的脑积水的检测主要是通过核磁共振的方式，而这种方法不能实现早期诊断。
[0012]2、早期诊断，免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多的免疫学检测存在较长的“窗口期”，不利于对疾病的早期诊断，PCR方法可直接检测RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测虽然也有利于疾病的早期诊断。而交通性脑积水的病人如果在严重的症状出现之前进行检测，就可以实现早诊断早治疗。
[0013]3、取样简单方便，可以通过病人的血液标本中检出特异基因，本发明首次提出用血液等标本对交通性脑积水进行检测。
[0014]4、与传统的基因扩增技术相比，本发明提供的检测方法省时，灵敏度高，特异性强。
【具体实施方式】
[0015]本【具体实施方式】提供了一种交通性脑积水的基因检测方法，以TGF-β I的特异性核酸定量标准品为对