一种基于ssr标记的京红4号萝卜杂交种纯度鉴定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种京红4号萝卜杂交种纯度鉴定的引物序列及检测方法，属于生物
技术领域。
【背景技术】
[0002] 萝卜在中国栽培历史悠久，分布广泛，品种类型十分丰富，在我国蔬菜生产供应中 占有重要地位。但是，目前萝卜种子经营单位越来越多，种子质量参差不齐，严重干扰了萝 卜种业的健康发展。在萝卜Fl代杂交种制种过程中由于生物学混杂和机械混杂等原因造 成杂交种纯度降低现象时有发生，给种子生产者和经营者造成巨大经济损失。传统的种子 纯度鉴定方法都是在田间进行，观察主要发育阶段品种的特征特性及一致性，存在周期长、 工作量大等缺陷。此外由于田间纯度检测周期长，造成当年生产的杂交种往往要等到次年 才能销售，不但会造成库存压力，还会错失商机。
[0003] 近年来随着分子生物学的发展，基于DNA多态性的分子标记正逐渐成为分析生物 遗传多样性的有力工具，因其具有不受环境影响、测试周期短、供选择的标记数量多、可以 进行高通量测试分析的优势，已经大规模用于种子纯度鉴定及品种真伪性的检测。尤其是 微卫星（SSR)标记技术具有共显性、多态性好、重复性好、实验操作简单等优点被广泛应 用。
[0004] "京红4号"是北京市农林科学院蔬菜研宄中心育成的红皮系列萝卜品种之一， 具有肉质根皮色粉红、根形圆正、抗病性强、熟食品质佳等优点，适于华北、东北地区秋季种 植。该品种种植面积不断扩大，种子需求量和制种面积也相应增加，快速鉴定杂交种纯度将 有利于该品种的进一步推广应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于检测京红4号萝卜杂交种纯度的引物序列。
[0006] 本发明的再一目的在于提供一种利用上述引物进行京红4号萝卜杂交种纯度鉴 定的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -对用于检测京红4号萝卜杂交种纯度的引物序列，包括核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 1?2所示序列。
[0009] 利用上述引物进行京红4号萝卜杂交种纯度鉴定，方法包括如下步骤：
[0010] (1)提取待测样品京红4号杂交种基因组DNA ;
[0011] (2)采用序列表SEQ ID No. 1?2所示引物进行PCR扩增；
[0012] (3)将步骤（2)中的扩增产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相 并统计结果；
[0013] (4)利用步骤（3)的统计结果计算京红4号萝卜杂交种的纯度。
[0014] 所述步骤（1)是采用碱裂解法快速提取待测京红4号萝卜杂交种基因组DNA :取 种子下胚轴（发芽72小时）置于2. OmL离心管中；加入0· 4mol T1NaOH溶液100 μ 1，钢珠 2个；在48孔研磨器上研磨Imin ;轻甩离心后，放于沸水中温浴Imin ; IOOOOrmp离心Imin ; 取上清液10 μ 1放入96孔PCR板中，加200 μ I Tris缓冲液（PH = 8. 0)，混匀备用。
[0015] 所述步骤（2)为PCR扩增：采用如序列表SEQ ID No. 1?2所示引物，反应体系为： Ιμ? 10 X Buffer (含 Mg2+)，0.8 μ? 2. 5mM dNTP，IU Taq DNA聚合酶，10 μ M SSR 上下游引 物各加0. 5 μ 1，模板DNA 2 μ 1，CldH2O补足10 μ I ;PCR反应程序为94°C预变性5min ;35个 扩增循环，94°C 30sec，60°C 30sec，72°C Imin ;72°C延伸 7min，4°C保存。
[0016] 所述步骤（3)扩增产物的检测：在步骤⑵的扩增产物中加入2 μ I上样缓冲 液，经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为1XTBE，每个点样孔加2 μ 1样 品，120V恒压下电泳60分钟。电泳结束后利用银染法染色。先将凝胶放入固定液（450mL H20+50mL无水乙醇+2. 5mL冰醋酸），在摇床上轻摇12min，回收固定液待用；加入银染液 (500ml H2CHlg硝酸银），轻摇12min ;倒掉银染液，用500ml蒸馏水洗30s，清洗两次；清洗 后，倒掉蒸馏水加入显色液（500ml H20+7. 5gNa0H+1500 μ 1甲醛），轻摇至DNA条带显出为 止；当条带清晰时，倒掉显影液，加入固定液，固定2分钟；倒掉固定液，用蒸馏水漂洗5分 钟；照相并统计带型。比较京红4号杂交种及其双亲的特征谱带，表现共显性互补带型的京 红4号杂交种，只有亲本带型的为非杂交种，出现其他第三种带型的为外来杂种；
[0017] (4)利用步骤（3)的统计结果计算供试京红4号萝卜杂交种纯度：送检测京红4 号杂交种纯度（％) =(总检测种子粒数-非杂交种数-外来杂交种数）/总检测种子粒 数 Χ100%〇
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 本发明筛选获得了一对能够用于京红4号萝卜杂交种纯度鉴定的引物，并提供了 京红4号杂交种纯度鉴定的方法。该检测方法快捷、简便、稳定、可靠、成本低，可在3-4h之 内完成京红4号种子纯度鉴定工作，有利于京红4号种子高效准确的质量控制。
【附图说明】
[0020] 图1、SSR2202在京红4号杂交种及其双亲中的扩增图。
[0021] 图2、SSR2202在京红4号杂交种中的扩增图（1?36个单株）。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对
【发明内容】
有整 体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。【具体实施方式】如下：
[0023] -、材料和方法
[0024] I. 1 材料
[0025] 引物筛选所用材料包括京红4号杂交种、母本、父本各8个单株。
[0026] 京红4号杂交种纯度鉴定所用材料为，制种基地10家农户生产的京红4号萝卜杂 交种，每户随机取100粒种子。
[0027] L 2研宄方法
[0028] L 2. 1基因组DNA的提取
[0029] 种子发芽72小时后，取下胚轴置于2. OmL离心管中；加入0. 4mol T1NaOH溶 液100 μ 1，钢珠2个；在48孔研磨器上研磨Imin ;轻甩离心后，放于沸水中温浴Imin ; IOOOOrmp离心Imin ;取上清液10 μ 1放入96孔PCR板中，加200 μ I Tris缓冲液（PH = 8.0)，混匀备用。
[0030] L 2. 2 PCR扩增与检测
[0031] 筛选获得一对能够用于京红4号杂交种纯度鉴定的特异引物。
[0032] 表1可用于京红4号杂交种纯度检测的引物序列
[0033]
【主权项】
1. 一种用于京红4号萝卜杂交种纯度鉴定的引物序列，其特征在于，所述引物核苷酸 序列如序列表SEQ ID No. 1?2所示引物。
2. 利用权利要求1中所述引物，检测京红4号萝卜杂交种纯度的方法，其特征包括以下 步骤： ⑴快速提取京红4号萝卜杂交种基因组DNA :取种子下胚轴（种子发芽72小时）置于 2. OmL离心管中；加入0. 4mol L4NaOH溶液100 μ 1，钢珠2个；在48孔研磨器上研磨Imin ; 轻甩离心后，放于沸水中温浴Imin ; IOOOOrmp离心Imin ;取上清液10 μ 1放入96孔PCR板 中，加200 μ I Tris缓冲液（PH = 8. 0)，混匀备用。 (2) 采用如序列表SEQ ID No. 1?2所示引物进行PCR扩增：反应体系为：1 μ 1 10父81^€61'(含]\%2+)，0.84 12.51111(1阶13，川了39〇嫩聚合酶，1(^]\1551?上下游引物各加 〇. 5 μ 1，模板DNA 2 μ 1，CldH2O补足至10 μ I ;PCR反应程序为94°C预变性5min ;35个扩增 循环，94°C 30sec，6(TC 30sec，72°C Imin ;72°C延伸 7min，4°C保存； (3) 将步骤（2)的扩增产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统 计结果，比较京红4号杂交种及其双亲的特征谱带，表现共显性互补带型的为京红4号杂交 种，只有亲本之一带型的为非杂交种，出现其他第三种带型的为外来杂种； (4) 利用步骤（3)的统计结果计算供试京红4号萝卜杂交种纯度：送检测京红4号杂交 种纯度（％) =(总检测种子粒数-非杂交种数-外来杂种数）/总检测种子粒数X 100%。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测京红4号萝卜杂交种纯度的引物序列及方法。该引物序列是序列表SEQ？ID1～2所述的核苷酸序列，该引物在杂交种中的扩增带型为双亲的互补带型，经过对制种基地10家农户随机抽样检测发现，SSR标记检测与田间结果相吻合。本发明具有快捷、简便、稳定、可靠、成本低等优点，可在3-4h之内可完成对京红4号萝卜杂交种纯度鉴定工作，有很大的应用价值。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104561319
【申请号】CN201510012415
【发明人】张丽, 王庆彪
【申请人】北京市农林科学院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月4日