用于博德特氏菌属物种的工业规模培养的化学成分确定的培养基的制作方法
【专利说明】用于博德特氏菌属物种的工业规模培养的化学成分确定的培 养基
[0001] 背景 博德特氏菌属(Bordetella)是许多细菌性疾病的致病因子，例如百日咳博德特氏菌 (Bordetella pertussis)(也称为百日咳嗜血杆菌（化emophilus pertussis))导致百日 咳，一种可W在婴幼儿中严重的呼吸系统疾病。该疾病的临床过程的特征在于阵发性快速 咳嗽随后是吸气费力，经常伴随特征性"咳咳"的声音。在严重的情况下，缺氧可导致脑损 伤;然而最常见的并发症是继发性肺炎。
[0002] 百日咳通常被认为是由百日咳博德特氏菌引起的，但偶尔从具有典型的百日咳表 征和症状的患者中分离出副百日咳博德特氏菌(B. parapertussis)。副百日咳博德特氏菌 感染比百日咳博德特氏菌较不常见，其中5-10%的百日咳与副百日咳博德特氏菌相关 (Mertsola (1985) Eur J Clin Microbiol 4; 123; Lautrop (1971) Lancet 1(7711) 1195-1198)。副百日咳博德特氏菌伴随轻微的临床症状，所述临床症状加上副百日咳博德 特氏菌与百日咳博德特氏菌的血清学交叉反应性，使得副百日咳博德特氏菌难W诊断。
[0003] 针对百日咳博德特氏菌的第一代疫苗是全细胞疫苗，由完整的杀死的细菌构成。 运些在许多国家中在20世纪50年代和60年代引进并成功减少百日咳的发病率。全细胞百日 咳博德特氏菌疫苗的一个问题是与之相关的高水平的反应原性。包含纯化的百日咳博德特 氏菌蛋白的无细胞疫苗具有较少的反应原性并已经改造用于很多国家的免疫接种计划。通 常包含百日咳毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)W及非常经常的百日咳杆菌粘附素(PRN) 的无细胞疫苗，被广泛使用，并提供有效保护免于百日咳的严重程度。
[0004] 在运些疫苗中使用的博德特氏菌毒素通过发酵博德特氏菌并分离产生的毒力因 子而生成，但是博德特氏菌属物种是需复杂营养的（fastidious)生物，其难W在高浓度下 生长(Doern Clin, infect.dis. 2000，30 166-173)，此外，其难W高水平表达博德特氏菌 毒力因子，诸如FHA(丝状血细胞凝集素）、百日咳杆菌粘附素(PRN)和来自百日咳博德特氏 菌的百日咳毒素(PT)。
[000引博德特氏菌在化学成分确定的培养基中生长。例如，S化iner和Scholte (Journal of General Microbiology (1971)，63，211-220)公开了用于生产百日咳菌 (pedussis)的简单的化学成分确定的培养基。在化学成分确定的培养基中生长提供优势， 因为不确定的培养基可W在其营养含量中变化导致生长和表达的不可预测性。
[0006] 但是化学成分确定的培养基可W是昂贵的并且难W制造大量，此外难W设计支持 高水平的毒素生产的平衡的化学确定的培养基。本发明人已惊奇地发现，可W对用于百日 咳博德特氏菌物种的化学成分确定的培养基进行很多修饰W形成支持高水平的毒力因子 生产的简单的培养基。
[0007] 发明简述 在本发明的第一方面，提供了用于博德特氏菌属物种的化学成分确定的培养基，其中 所述化学成分确定的培养基包含一种或多种下列修饰： (i )所述化学成分确定的培养基包含少于0. 〇35mM、少于0.030mM、少于0.020mM或少于 O.OlOmM硫酸盐； (i i )所述化学成分确定的培养基包含选自半脫氨酸和脫氨酸的半脫氨酸来源，其中所 述半脫氨酸来源浓度少于0.50mM、少于0.30mM、少于0.25mM、少于0.20mM、少于0.15mM、少于 0. lOmM、少于0.05mM或少于0.03mM; (iii) 所述化学成分确定的培养基包含选自硫代硫酸盐、连Ξ硫酸盐、连四硫酸盐、过 氧二硫酸盐、硫化物和亚硫酸盐的无机硫源； (iv) 所述化学成分确定的培养基不包含有机硫源； (V)所述化学成分确定的培养基包含选自M0PS(3-(N-吗嘟代)丙横酸）、MES(2-(N-吗嘟 代）乙横酸）、皿阳5(4-(2-?基乙基)-1-赃嗦乙横酸)和PI阳S(赃嗦-N，N'-双(2-乙横酸）） 的缓冲剂； (vi)所述化学成分确定的培养基包含大于2μΜ、大于3μΜ、大于4μΜ、大于扣Μ大于6μΜ铜； (>;[0所述化学成分确定的培养基包含大于241、大于扣1、大于1041、大于5041、大于 100μΜ或大于400μΜ的儀； (viii) 所述化学成分确定的培养基包含单一氨基酸来源； (ix) 所述化学成分确定的培养基不包含多种氨基酸来源（a source of amino acids)； (X)所述化学成分确定的培养基包含选自锋、钻、硫胺素、核黄素和泛酸盐的添加剂； (Xi)所述化学成分确定的培养基包含选自大于0.4μΜ生物素、大于50μΜ巧、大于15μΜ烟 酸和大于25μΜ抗坏血酸的添加剂;或 (xii)所述化学成分确定的培养基包含选自浓度大于ΙΟΟΟμΜ的天冬氨酸、浓度大于 ΙΟΟΟμΜ的甘氨酸、浓度大于500μΜ的甲硫氨酸和浓度大于1500μΜ的亮氨酸的氨基酸。
[0008]在本发明的第二方面，提供了用于博德特氏菌属物种的化学成分确定的培养基， 其中所述化学成分确定的培养基包含至少两种组分并且其中所述至少两种组分选自： a) 大于100:1、大于125:1、大于150:1、大于175:1或大于200:1(碳:憐Xmol/mol)的比 例的碳和憐； b) 大于20:1、大于22:1、大于24:1或大于25:1(谷氨酸:憐）(mol/mol)的比例的谷氨酸 和憐； C)小于600:1、小于500:1、小于400:1或小于300:1(碳:儀）(mol/mol)的比例的碳和儀； d) 小于115:1、小于110:1、小于105:1或小于100:1 (谷氨酸:儀）(mol/mol)的比例的谷 氨酸和儀； e) 大于3000:1、大于3500:1或大于4000:1(碳:铜）(mol/mol)的比例的碳和铜； f )大于170:1、大于180:1、大于200:1或大于250:1 (谷氨酸:铜）(mol/mol)的比例的谷 氨酸和铜； g) 大于9500:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1(碳:铁）(mol/mol)的比例的碳 和铁； h) 大于1600:1、大于1800:1、大于2000:1或大于2500:1(谷氨酸:铁）(mol/mol)的比例 的谷氨酸和铁； i) 小于500:1、小于400:1、小于300:1或小于250:1(碳:甘氨酸）(mol/mol)的比例的碳 和甘氨酸； j) 小于100:1、小于80:1、小于75:1或小于60:1(谷氨酸:甘氨酸）(mol/mol)的比例的谷 氨酸和甘氨酸； k) 小于440:1、小于400:1、小于350:1或小于300:1(碳:亮氨酸）(mol/mol)的比例的碳 和亮氨酸； l) 小于75:1、小于70:1、小于60:1或小于50:1(谷氨酸:亮氨酸）(mol/mol)的比例的谷 氨酸和亮氨酸； m) 小于1200:1、小于1000:1、小于800:1或小于750:1(碳：甲硫氨酸）(mol/mol)的比例 的碳和甲硫氨酸； η)小于200:1、小于175:1、小于150:1或小于120:1 (谷氨酸：甲硫氨酸）(mol/mol)的比 例的谷氨酸和甲硫氨酸； O) 大于3750:1、大于4000:1、大于4500:1或大于5000:1(碳:巧）(mol/mol)的比例的碳 和巧； P) 大于620:1、大于650:1、大于675:1或大于750:1(谷氨酸:巧）(mol/mol)的比例的谷 氨酸和巧； q) 大于3000:1、大于3500:1、大于4750:1或大于5000:1(碳:钻）(mol/mol)的比例的碳 和钻； r) 大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1(谷氨酸:钻）(mol/mol)的比例的 谷氨酸和钻； S)大于3000:1、大于3500:1、大于4000:1或大于5000:1(碳:锋）(mol/mol)的比例的碳 和锋； t)大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1(谷氨酸:锋）(mol/mol)的比例的 谷氨酸和锋； U) 大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1(碳:硫酸盐等价物）(mol/mol)的 比例的碳和硫酸盐等价物;和 V) 大于130:1、大于150:1、大于175:1或大于200:1(谷氨酸:硫酸盐等价物）(mol/mol) 的比例的谷氨酸和硫酸盐等价物。
[0009] 在本发明的第Ξ方面，提供了用于在化学成分确定的培养基(CDM)中生长博德特 氏菌属物种的发酵方法，所述方法包括： (a) 用博德特氏菌属物种接种本发明的化学成分确定的培养基； (b) 在化学成分确定的培养基中维持博德特氏菌属物种持续足W允许生物质积累的一 段时间。
[0010] 在本发明的第四方面，提供可通过本发明的发酵方法获得的毒力因子。
[0011] 在本发明的第五方面，提供通过本发明的发酵方法获得的毒力因子。
[0012] 在本发明的第六方面，提供包含本发明的毒力因子的免疫原性组合物。
[0013] 在本发明的第屯方面，提供包含本发明免疫原性组合物的疫苗。
[0014] 在本发明的第八方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在预防或 治疗疾病中的用途。
[0015] 在本发明的第九方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在制备用 于治疗或预防细菌性疾病的药物中的用途。
[0016] 在本发明的第十方面，提供了预防或治疗疾病的方法，所述方法包括向患者施用 疫苗的免疫原性组合物。
[0017] 发明详述 化学成分确定的培养基 化学成分确定的培养基(CDM)经常被认为是有益的，因为不像化学成分不确定的培养 基，化学成分确定的培养基包含精确浓度的每种营养物，因此减少培养基的变化和改善发 酵产物的质量。但是产生平衡的最优的化学成分确定的培养基是困难的，因为难W预测不 同细菌所需的营养物/培养基组分。理想的是，化学成分确定的培养基应该是基本平衡的， 即，在发酵结束时对于细菌代谢不应该有过量的任何特定培养基组分(其由于存在过多的 该培养基组分），因为平衡的培养基支持更有效的生长而且更经济。GoldnerO. Gen. Microbiol. (1966)，44, 439-444)已设计了用于百日咳博德特氏菌的半合成培养基，然 而，运太复杂并且在工业规模使用是昂贵的。Stainer Scholte试图设计将是更适合于工 业规模的发酵的更简单的培养基，然而，运对于毒力因子的生产不是最优的（Journal of General Microbiology (1971), 63, 211-220)。本发明人已经发现，可W对运些化学成分 确定的培养基进行某些修饰W简化培养基或显著增加从在运种培养基中生长的博德特氏 菌获得的毒力因子产量。
[001引运些修饰包括： (i )所述化学成分确定的培养基包含少于0. 035mM、少于0.030mM、少于0.020mM或少于 O.OlOmM硫酸盐； (i i )所述化学成分确定的培养基包含选自半脫氨酸和脫氨酸的半脫氨酸来源，其中所 述半脫氨酸来源浓度少于0.50mM、少于0.30mM、少于0.25mM、少于0.20mM、少于0.15mM、少于 0. lOmM、少于0.05mM或少于0.03mM; (iii) 所述化学成分确定的培养基包含选自硫代硫酸盐、连Ξ硫酸盐、连四硫酸盐、过 氧二硫酸盐、硫化物和亚硫酸盐的无机硫源； (iv) 所述化学成分确定的培养基不包含有机硫源； (V)所述化学成分确定的培养基包含选自M0PS、MES、肥阳S和PIPES的缓冲剂； (Vi)所述化学成分确定的培养基包含大于2μΜ、大于3μΜ、大于4μΜ、大于扣Μ或大于6μΜ 的铜； (>;[0所述化学成分确定的培养基包含大于241、大于扣1、大于1041、大于5041、大于 100μΜ或大于400μΜ的儀； (viii) 所述化学成分确定的培养基包含单一氨基酸来源； (ix) 所述化学成分确定的培养基不包含多种氨基酸来源； (X)所述化学成分确定的培养基包含选自锋、钻、硫胺素、核黄素和泛酸盐的添加剂； (Xi)所述化学成分确定的培养基包含选自大于0.4μΜ生物素、大于50μΜ巧、大于15μΜ烟 酸和大于25μΜ抗坏血酸的添加剂;或 (xii)所述化学成分确定的培养基包含选自浓度大于ΙΟΟΟμΜ的天冬氨酸、浓度大于 ΙΟΟΟμΜ的甘氨酸、浓度大于500μΜ的甲硫氨酸和浓度大于1500μΜ的亮氨酸的氨基酸。
[0019]因此，在本发明的第一方面，提供了用于博德特氏菌属物种的化学成分确定的培 养基，其中所述化学成分确定的培养基包含一种或多种上述修饰。
[0020] 此外，在尝试配制新的化学成分确定的培养基时经常设及取复合培养基并用等价 量的个别化学成分确定的组分替换复合培养基组分(诸如，casmino酪蛋白水解物）。但是， 本发明人已经惊奇地发现，培养基组分间的比例可W对于保证化学成分确定的培养基是平 衡的并且支持高产量的毒力因子生产而言是非常重要的。
[0021] 因此，在本发明的第二方面，提供了用于博德特氏菌属物种的化学成分确定的培 养基，其中所述化学成分确定的培养基包含至少两种组分并且其中所述至少两种组分选 自： a) 大于100:1、大于125:1、大于150:1、大于175:1或大于200:1(碳:憐Xmol/mol)的比 例的碳和憐； b) 大于20:1、大于22:1、大于24:1或大于25:1(谷氨酸:憐）(mol/mol)的比例的谷氨酸 和憐； C)小于600:1、小于500:1、小于400:1或小于300:1(碳:儀）(mol/mol)的比例的碳和儀； d) 小于115:1、小于110:1、小于105:1或小于100:1 (谷氨酸:儀）(mol/mol)的比例的谷 氨酸和儀； e) 大于3000:1、大于3500:1或大于4000:1(碳:铜）(mol/mol)的比例的碳和铜； f )大于170:1、大于180:1、大于200:1或大于250:1 (谷氨酸:铜）(mol/mol)的比例的谷 氨酸和铜； g) 大于9500:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1(碳:铁）(mol/mol)的比例的碳 和铁； h) 大于1600:1、大于1800:1、大于2000:1或大于2500:1(谷氨酸:铁）(mol/mol)的比例 的谷氨酸和铁； i) 小于500:1、小于400:1、小于300:1或小于250:1(碳:甘氨酸）(mol/mol)的比例的碳 和甘氨酸； j) 小于100:1、小于80:1、小于75:1或小于60:1(谷氨酸:甘氨酸）(mol/mol)的比例的谷 氨酸和甘氨酸； k) 小于440:1、小于400:1、小于350:1或小于300:1(碳:亮氨酸）(mol/mol)的比例的碳 和亮氨酸； l) 小于75:1、小于70:1、小于60:1或小于50:1(谷氨酸:亮氨酸）(mol/mol)的比例的谷 氨酸和亮氨酸； m) 小于1200:1、小于1000:1、小于800:1或小于750:1(碳：甲硫氨酸）(mol/mol)的比例 的碳和甲硫氨酸； η)小于200:1、小于175:1、小于150:1或小于120:1 (谷氨酸：甲硫氨酸）(mol/mol)的比 例的谷氨酸和甲硫氨酸； O) 大于3750:1、大于4000:1、大于4500:1或大于5000:1(碳:巧）(mol/mol)的比例的碳 和巧； P) 大于620:1、大于650:1、大于675:1或大于750:1(谷氨酸:巧）(mol/mol)的比例的谷 氨酸和巧； q)大于3000:1、大于3500:1、大于4750:1或大于5000:1(碳:钻）(mol/mol)的比例的碳 和钻； r)大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1(谷氨酸:钻）(mol/mol)的比例的 谷氨酸和钻； S)大于3000:1、大于3500:1、大于4000:1或大于5000:1(碳:锋）(mol/mol)的比例的碳 和锋； t)大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1(谷氨酸:锋）(mol/mol)的比例的 谷氨酸和锋； U) 大于750:1、大于1000:1、大于1250:1或大于1500:1(碳:硫酸盐等价物）(mol/mol)的 比例的碳和硫酸盐等价物;和 V) 大于130:1、大于150:1、大于175:1或大于200:1(谷氨酸:硫酸盐等价物）(mol/mol) 的比例的谷氨酸和硫酸盐等价物。
[0022] 术语"化学成分确定的培养基"指基本上不含复合材料诸如酵母、酪蛋白氨基酸、 蛋白腺、膜蛋白腺、酵母提取物的培养基。参见，例如Jayme和Smith，切totechnology 33 (1-3):27-36 (2000)。特别是，如本文所用，化学成分确定的培养基不包括酪蛋白氨基酸 (CAA)作为培养基中氨基酸的来源。如本文所用，酪蛋白氨基酸指通过水解酪蛋白获得的氨 基酸的混合物。
[0023] 本发明的CDM在正项(培养基中包括的成分或组分)和负项(培养基中排除的成分 或组分)进行描述。
[0024] "来源"是为培养基提供至少一种特定成分的培养基组分。例如，脫氨酸是半脫氨 酸的来源，因为其提供半脫氨酸用于被培养基中生长的生物所利用。如本文所用，成分本身 被认为是"来源"，例如，硫酸盐是硫酸盐的来源，并且半脫氨酸是半脫氨酸的来源等。"来 源"可W提供多于一种成分，例如，氨基酸可W是碳源和氮源，W及氨基酸来源。
[0025] 术语"培养基"指足W允许博德特氏菌生长成相当高密度(例如达到超过l.Og/L、 超过1.5g/L，超过2. Og/L或超过2.5g/L干细胞重量的生物质）的营养物的来源。
[0026] 本发明的化学成分确定的培养基用于博德特氏菌属物种的工业规模的培养，术语 "工业规模培养"指在发酵罐中的培养，在一个实施方案中，工业规模的培养是在具有如下 工作体积的发酵罐中的培养:5-10000升、10-5000升、20-2000升、50升-1000升、大于或等于 5升、大于或等于10升、大于或等于15升、大于或等于20升、大于或等于25升、大于或等于50 升、大于或等于100升、小于或等于10000升、小于或等于5000升或小于或等于2500升。在进 一步的实施方案中，"工业规模培养"是适合用于大于lOmg/L、大于15mg/L或大于20mg/L百 日咳毒素的生产的培养。
[0027] 在发酵方法过程中，在方法的开始，将本发明的化学成分确定的培养基添加到发 酵罐，尽管，任选地培养基的其它部分可W在发酵方法过程中添加（例如在分批补料发酵 中）；可选地，具有不同组成的培养基可W在发酵中晚一点添加。运样的培养基也可W连续 添加到培养基中，用于在诸如恒化器或retentos化ts的系统中使用。优选地，发酵是分批补 料发酵。
[0028] 本发明的化学成分确定的培养基优选地支持博德特氏菌属物种的生长产量高于 Seiner Scholte 培