养基（描述于Journal of General Microbiology (1971), 63:211-220)所支持的生长产量。运可W通过用博德特氏菌菌株的第一样品接种包含Stainer Scholte培养基的摇瓶或发酵罐并用博德特氏菌菌株的第二样品接种包含要测试的化学成 分确定的培养基的摇瓶或发酵罐(使用与选择用于Stainer Scholte培养基的体积相同的 体积），接种博德特氏菌菌株来确定。对于两种样品应在多个两个时间点取〇〇65〇?，运些时 间点必须包括刚好在接种后的时间点（称为时间点A)和在生长结束时的时间点（称为时间 点B)。需要注意的是，当两个连续时间点之间（间隔至少24小时）的细胞浓度增加没有超过 10%时，则认为生长已停止。如果在时间点B和时间点A之间的ODssonm差异对于第二样品高于 Stainer Scholte培养基中接种的第一样品，则待测试的化学成分确定的培养基支持博德 特氏菌属物种比由Stainer Scho 1 te培养基所支持的更高的生长产量。
[0029] 化学成分确定的培养基优选支持少于15h、少于12h、少于lOh或少于化的博德特氏 菌属物种的平均世代时间。运可W使用第[02引段中所述的类似方法测试，但是通过用时间 点A和时间点B之间的时间除W运些两个时间点之间世代数目来获得平均世代时间。通过计 算在第二时间点的006日日皿与在第一时间点的的0D6日血m比率，转化成L0g2，获得时间点A和时间 点B之间的世代数目。
[0030] 所述化学成分确定的培养基优选地支持比Stainer Scholte培养基所支持的更高 水平的百日咳毒素生产。运可通过如下确定：用百日咳博德特氏菌菌株的第一样品接种含 有Stainer Scholte培养基的摇瓶或发酵罐并用百日咳博德特氏菌菌株的第二样品接种含 有待测试的化学成分确定的培养基的摇瓶或发酵罐(与对于Stainer Scholte培养基所选 体积相同的体积），解育两个样品直到增长已经停止，并计算每个样品中的百日咳毒素产生 水平。一种用于确定百日咳毒素产生水平的方法描述于实施例1中。如果对于第二样品的百 日咳毒素产生水平高于对于第一样品的水平，则化学成分确定的培养基支持比由Stainer Scholte培养基支持的更高水平的百日咳毒素的产生。
[0031] 在一个优选的实施方案中，本发明的化学成分确定培养基支持博德特氏菌属物种 产生百日咳毒素，具有大于lOmg/L，或大于1510mg/L的产量，更优选产量为大于20mg/L。是 否化学成分确定的培养基支持博德特氏菌属物种W产生具有特定产量的百日咳毒素可通 过用博德特氏菌属物种的样品接种化学成分确定的培养基并解育细胞直至生长停止来确 定。在生长结束时，可W使用实施例1中描述的方法来计算百日咳毒素的产量。
[0032] 在一个实施方案中，化学成分确定的培养基是基本上平衡的培养基。基本上平衡 的培养基运样的培养基，其中在发酵结束时，没有任何特定营养物的显著过量。是否化学成 分确定的培养基是基本平衡的培养基可W通过在培养基中解育博德特氏菌属物种直至生 长停止并在生长停止后检查培养基上清液进行测试。如果代谢源（即氮、憐和硫的来源）W 基本上类似的速率(彼此的10%之内）使用，则该化学上确定的培养基是平衡的。在优选实 施方案中，所有代谢来源的最终浓度将是在OmM左右。
[0033] 通常化学成分确定的培养基必须包含至少碳源、憐源、氮源、硫源和缓冲剂。氮源 可W是有机的或无机的。氮源可W是氨基酸或肤，或者氮源可W是非氨基酸或肤的氮源，在 运样的化学成分确定的培养基中，所述化学成分确定的培养基不包含氨基酸。在一个实施 方案中，氮源是无机的。在一个实施方案中，氮源包含选自氨基酸、尿素、多胺、锭(诸如氯化 锭、硫酸锭或硝酸锭）、核碱基、核巧和核巧酸的化合物或由其组成。在进一步的实施方案 中，氮源包含氯化锭或由其组成。碳源可W包含氨基酸或肤或由其组成，或可W包含非氨基 酸或肤的碳源或由其组成;在运样的化学成分确定的培养基中，所述化学成分确定的培养 基不包含氨基酸。如本文所用术语"不包含氨基酸"是指培养基也"不包含"肤或蛋白质，因 为肤或蛋白质是氨基酸的来源。在一个实施方案中，碳源包含选自单糖、二糖、多糖、多元醇 (糖醇）、有机酸和氨基酸的化合物或由其组成。在进一步的实施方案中，碳源包含选自葡萄 糖、果糖、山梨糖、半乳糖胺、甘露糖、薦糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇、巧樣酸、乳酸、乙酸、丙 酬酸、富马酸、班巧酸、脯氨酸和谷氨酸的化合物或由其组成。在进一步的实施方案中，碳源 包含谷氨酸或脯氨酸。在进一步的实施方案中，碳源包含选自巧樣酸、乳酸、乙酸、丙酬酸、 富马酸和班巧酸的有机酸或由其组成。
[0034]本发明的化学成分确定的培养基是用于博德特氏菌属物种的工业规模培养。在一 个实施方案中，培养基包含博德特氏菌属物种。在一个实施方案中，博德特氏菌属物种是选 自 Bordetella petrii、鸟博德特氏菌（Bordetella avium)、Bordetella hinzii、 Bordetella trematum、霍氏博德特氏菌（Bordetella holmesii)、副百日咳博德特氏菌 (Bordetella parapertussis)、支气管炎博德特氏菌（Bordetella bronchis邱tica)和百 日咳博德特氏菌(也称为百日咳嗜血杆菌）的物。优选地，博德特氏菌属物种选自副百日咳 博德特氏菌、支气管炎博德特氏菌和百日咳博德特氏菌。更优选博德特氏菌属物种是百日 咳博德特氏菌。
[00对硫源 在第一实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含少于0.035mM、少于0.030mM、少于 0.020mM、少于0 . OlOmM硫酸盐，少于0.005mM、少于0.000 ImM、少于0.00005mM、少于 0.0000 ImM，0.035mM-0mM、0.005mM-0mM或0.0000 ImM-OmM。本发明人已经惊奇地发现当在用 于博德特氏菌的化学成分确定的培养基中使用时，从化学成分确定的培养基去除硫酸盐显 著地增加毒力因子诸如PT的产量。W00178462和Lacey (1960; J.Hyg. 58:57-93)公开了如 下想法，硫酸盐可W是毒力因子生产的抑制剂，但是W00178462中公开的低硫酸盐培养基包 含O.OOlg/L添加的FeS化。因此，清楚的是，W00178462中的发明人认为需要存在至少某些量 的FeS04，W便产生化学成分确定的培养基W允许百日咳菌生长。值得注意的是，为了获得 高水平的毒力因子，培养基必须同时支持毒力因子产生和博德特氏菌生长到合适的生物 质，因此尽管已知硫酸盐抑制毒力因子表达，但是不知道博德特氏菌可W在不存在硫酸盐 的情况下生长到合理的生物质。还应当注意的是Je化和Tomlinson (J.Gen.Microbiol. 17, 59-68)公开了硫酸盐不足W提供硫源，运与其它继续向他们的培养基添加硫酸盐的现有技 术和引用Jet)b和Tomlinson的后来的文献（诸如LicaiT, Siber and Swartz Journal of Biotechnology 1 20 (1991) 117-130)矛盾。此结论被其它关于用于博德特氏菌的培养基 的公开物所支持，通常运些公开物都似乎需要存在硫酸盐(例如，如上述Stainer Scholte 培养基包含硫酸盐）。但是，本发明人已经惊奇地发现，FeS化可W用巧樣酸铁（III)替换W 去除硫酸盐(因此减少了毒力因子表达的抑制），并仍然提供支持博德特氏菌生长的有效的 培养基，并且降低硫酸盐的浓度甚至低于W00178462中所公开的浓度提供了毒力因子诸如 PT产量的显著增加。在进一步的实施方案中，化学成分确定的培养基不包含硫酸盐。
[0036]短语"不包含"特定物质诸如硫酸盐指其中培养基的制造者未添加显著量的该物 质的培养基。因此，如果培养基包含小量的特定物质，则可W认为培养基"不包含"该物质， 所述物质是例如污染物。或者，如果培养基的制造者已添加了非常小量的不足W改变毒力 因子诸如百日咳毒素的产量的特定物质，则该培养基可W被认为"不包含"该物质。运可W 通过在小量该物质的存在下和不存在小量该物质的情况下培养博德特氏菌属物种并使用 ELISA测量该毒力因子在运两种培养物中的产量来确定。合适的化ISA描述于第[122]段。
[0037] 在一个实施方案中，本发明提供了包含选自半脫氨酸和脫氨酸的半脫氨酸来源的 化学成分确定的培养基，其中半脫氨酸的来源W下列浓度:少于0.50mM、少于0.30mM、少于 0.25111]\1、少于0.201111、少于0.151111、少于0.10111]\1、少于0.05111]\1、少于0.031111、少于0.011111、少于 0.005mM、少于 0.0 OlmM、少于0.0005mM、少于 0.0 OOlmM、少于0.00005mM 或少于 0.0 OOOlmM。
[0038] 半脫氨酸通常用于通过博德特氏菌的生物质合成，但是，当半脫氨酸W更高浓度 存在时，它将被代谢为硫酸盐(Bogdan等（（2001); Infect. Immun. 69:6823-6830))。此硫 酸盐不能被同化，因为硫酸盐同化途径无功能(Par化ill等（（2003);化t.Genet. 35:32-40))。因此，在培养基中使用高浓度的半脫氨酸可W提供硫酸盐离子，其如上述抑制毒力因 子表达。但是，Bogdan等认为生长需要半脫氨酸，因此，Bogdan等公开的培养基(甚至包含假 设减少的量的半脫氨酸的那些）包含相对高浓度的半脫氨酸。类似地，Jebb和Tomlinson (J.Gen.Microbiol. 17, 59-68)描述了半脫氨酸的存在对于生长是必需的。但是本发明人 已经首次证明，博德特氏菌可W在不存在半脫氨酸的情况下生长并因此可W使用比Bogdan 等公开的那些甚至更低浓度的半脫氨酸。
[0039] 脫氨酸是半脫氨酸的二聚体，其可W被博德特氏菌W与半脫氨酸类似的方式代 谢，但是对博德特氏菌提供两倍量的半脫氨酸。
[0040] 在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基不包含半脫氨酸或脫氨酸。 在优选的实施方案中，所述化学成分确定的培养基不包含硫酸盐、半脫氨酸或脫氨酸。
[0041] 在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含选自硫代硫酸盐、连Ξ 硫酸盐、连四硫酸盐、过氧二硫酸盐、硫化物和亚硫酸盐的无机硫源。在进一步的实施方案 中，所述化学成分确定的培养基不包含有机硫源。
[0042] 本发明人已经首次证明，可W使用无机硫作为硫源(而非半脫氨酸）用于生长博德 特氏菌。
[0043] 从现有技术，例如Je化和Tomlinson (J.Gen.Microbiol. 17，59-68)，表现出，对 于博德特氏菌的生长需要有机硫源。运是因为，已知用于从硫酸盐和硫代硫酸盐合成半脫 氨酸的途径在博德特氏菌属的成员中不发挥功能(Par化ill等（（2003); Nat.Genet. 35: 32-40))。但是，发明人已经首次证明博德特氏菌可W在不存在有机硫源的情况下生长（只 要存在无机硫源诸如硫代硫酸盐）。
[0044] 在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含硫代硫酸盐。在进一步的实 施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于0. 〇〇5mM、大于0.006mM、大于0.007mM、大于 0.008mM、大于 0.0 lOmM、大于0.050mM、大于 0.100mM、0.005mM-0.100mM、0.005mM-0.050mM、 0.005mM-0.025mM、约0.120mM或约0.OllmM硫代硫酸盐。在进一步的实施方案中，所述化学 成分确定的培养基包含连Ξ硫酸盐。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基 包含大于0.003mM、大于0.004mM、大于0.005mM、大于 O.OOSmM、大于 O.OlOmM、大于 0.020mM、 大于0.050mM、0.003mM-0.500mM、0.003mM-0.100mM、0.005mM-0 . OlOmM、约0.007mM或约 O.OSOmM连Ξ硫酸盐。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含连四硫酸盐。在 进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于〇.〇〇2mM、大于0.003mM、大于 0.004mM、大于0.005mM、大于0.025mM、大于0.050mM、0.002mM-l. 000mM、0.002mM-l. OOOmM、 0.0 lOmM-0. lOOmM、约0.060mM或约0.0006mM连四硫酸盐。在一个实施方案中，所述化学成分 确定的培养基包含过氧二硫酸盐。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包 含大于 0.005mM、大于 0.006mM、大于 0.007mM、大于 0.008ml、大于 O.OlOmM、大于 0.050mM、大 于0.100111]\1、0.005111]\1-1.000111]\1、0.005111]\1-0.200111]\1、0.005111]\1-0.015111]\1、约0.1201111或约 O.OllmM过氧二硫酸盐。在一个实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含硫化物。在进 一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于0 . OlOmM、大于0.012mM、大于 0.014111]\1、大于0.016111]\1、大于0.020111]\1、大于0.100111]\1、大于0.200111]\1、0.010111]\1-1.000111]\1、 0.0 lOmM-0.300mM、0.0 lOmM-0. lOOmM、约0.240mM或约0.022mM硫化物。在一个实施方案中， 所述化学成分确定的培养基包含亚硫酸盐。在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的 培养基包含大于0 . OlOmM、大于0.012mM、大于0.014mM、大于0.016mM、大于0.020mM、大于 0. lOOmM、大于0.200mM、约0.240mM或约0.022mM亚硫酸盐。
[004引在一个实施方案中，化学成分确定的培养基包含硫代硫酸盐和连Ξ硫酸盐、硫代 硫酸盐和连四硫酸盐、硫代硫酸盐和过氧二硫酸盐、硫代硫酸盐和硫化物、硫代硫酸盐和亚 硫酸盐、连Ξ硫酸盐和连四硫酸盐、连Ξ硫酸盐和过氧二硫酸盐、连Ξ硫酸盐和硫化物、连 Ξ硫酸盐和亚硫酸盐、连四硫酸盐和过氧二硫酸盐、连四硫酸盐和硫化物、连四硫酸盐和亚 硫酸盐、过氧二硫酸盐和硫化物、过氧二硫酸盐和亚硫酸盐或硫化物和亚硫酸盐。在进一步 的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含选自硫代硫酸盐、连Ξ硫酸盐、连四硫酸 盐、过氧二硫酸盐、硫化物和亚硫酸盐的2、3、4、5、6或更多种无机硫源。
[0046]在优选的实施方案中，所述化学成分确定的培养基不包含硫酸盐、半脫氨酸或脫 氨酸，并且不包含大于0. 〇〇5mM、大于0.006mM、大于0.007mM、大于0.008mM、大于0.0 lOmM、大 于0.050mM、大于0.100mM、0.005mM-0.100mM、0.005mM-0.050mM、0.005mM-0.025mM、约 0.120mM或约0.01 ImM硫代硫酸盐。
[0047]缓冲剂 在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含选自M0PS、MES、HEPES和 PIPES的缓冲剂。
[0048] 本发明人已经惊奇地发现包含除化is和β-甘油憐酸盐之外的缓冲剂，特别是MOPS 缓冲剂的化学成分确定的培养基展示相比其它培养基改善的百日咳博德特氏菌的生长速 率。在用于百日咳博德特氏菌的化学成分确定的培养基中使用的可替换的缓冲剂由Lothe 等（Journal of Biological Sl:andardisation (1985) 13, 129-134)探索，但是，他们的 结论是0-甘油憐酸盐是优异的缓冲剂。但是，本发明人已经发现不仅其它缓冲剂可W是有 效的，而且MOPS也展示相对于β-甘油憐酸盐的改进。由于此原因，本发明提供了包含MOPS缓 冲剂的化学成分确定的培养基。在一个实施方案中，所述缓冲剂是W下列浓度的MOPS:大于 2mM、大于 5mM、大于 7mM、大于 9mM、大于 lOmM、大于 111111、2111]\1-10〇1111、2111]\1-5〇111]\1、51111-2〇1111或约 12mM〇
[0049] 高浓度的铜 据证实，在用于博德特氏菌的培养基中不需要铜（Stainer和Scholte Journal of General Microbiology (1971)，63:211-220)，但本发明人惊奇地发现，向用于博德特氏 菌的化学成分确定的培养基中添加相对高浓度的铜导致由博德特氏菌产生的毒素的量显 著增加(例如从百日咳博德特氏菌表达百日咳毒素）。
[0050] 因此，在进一步的实施方案中，所述化学成分确定的培养基包含大于2μΜ、大于化 Μ、大于4μΜ、大于扣m、大于6μΜ、大于7μΜ、大于祉Μ、小于200μΜ、小于150μΜ、小于100μΜ、4μΜ-ΙΟμΜ、2μΜ-200μΜ、3μΜ-150μΜ或扣Μ-100μΜ铜。在一个实施方案中，铜源选自氯化铜、硫酸铜、 乙酸铜、氯酸铜和碳酸铜。在进一步的实施方案中，铜是W氯化铜的形式。
[0051] 高浓度的儀 已知高浓度的儀调节博德特氏菌，并且诱导博德特氏菌转化为它们不大可能表达毒力 因子诸如百日咳毒素和FHA的状态（Idigbe等J.MED.MICROBIOL (1981) 409-418) and Lacey等（（1960) J.Hyg. 58:57-93))。如上文所解释的，在诱导高的毒素表达水平的环 境中生长博德特氏菌是有利的，已知添加儀减少毒力因子表达并因此为了博德特氏菌疫苗 生产，从培养基中去除儀。但是，本发明人已经惊奇地发现，添加高浓度儀可W在化学成分 确定的培养基中使用，并具有高水平的毒力因子诸如PT的表达。
[0052] 由于运些原因，在一个实施方案中，化学成分确定的培养基包含大于2μΜ、大于扣 ]\1、大于1〇4]\1、大于254]\1、大于5〇4]\1、大于754]\1、大于10〇4]\1、大于20〇4]\1、大于30〇4]\1、大于40化 Μ、2μΜ-6000μΜ、1000μΜ-6000μΜ 或约 5000μΜ 儀。
[0053] 氨基酸来源 通常已知培养基必须包括氮源和碳源;在很多情况下，对于生长需要特定氨基酸(必需 氨基酉《）。Stainer和Scholte (Stainer和Scholte Journal of General Microbiology (1971)，63:211-220)尝试创造简化的化学成分确定的培养基，但是，他们的结论是需要至 少两种氨基酸，即谷氨酸、脯氨酸和脫氨酸。
[0054] 但是，本发明人已经惊奇地发现博德特氏菌可W在仅包含一种类型氨基酸的培养 基中生长。特别是，发明人已经证明，博德特氏菌可W在包含仅单一氨基酸并且不包含半脫 氨酸的培养基上生长，运特别令人惊奇，因为，如上述，先前认为需要半脫氨酸作为硫源。运 是有利的，因为如上述，用于商业用途的培养基应当尽可能简单W便减少制造培养基的困 难、降低培养基成本和减少潜在的批次到批次的变异的来源。
[0055] 由于此原因，在一个实