肝脏感染的制作方法

肝脏感染的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及用于研究体外肝脏组织的感染的方法，用于潜在治疗性或预防性候选 药物的筛选方法，肝脏感染模型，用于生产感染剂（infectious agent)W及其后代的方法。
【背景技术】
[0002] 感染性肝病是全球范围内的主要关注的问题。例如，估计肝炎B病毒化BV)慢性感 染3.5亿个体，其是主要的全球医疗保健挑战。病毒感染的研究对于理解发病机制W及确定 和开发用来对抗感染的新疗法是必不可少的。然而，肝的病毒感染的研究是困难的，运是由 于有限可用性的适宜的病毒感染和复制模型。例如，肝炎B病毒的体外研究往往限于肝细胞 癌细胞系的感染，如Η邱aRG或Η址7，其中病毒颗粒摄取是较差的W及嗜肝病毒的感染和增 殖需要特定的宿主因子，其主要表达在宿主物种或非常有限数目的其它物种的高度分化的 细胞中。在细胞培养中，运些高度分化的细胞快速失去它们的分化的方面，从而导致从低病 毒滴度到在细胞培养中未能感染细胞的问题。因此，嗜肝病毒的研究一直依赖于高度修饰 的细胞或病毒系统：例如诱导的多能干细胞用于丙型肝炎的研究（Schwartz et al，PNAS, Januaiy 20l2ht1:p://www.pnas .o;rg/content/ea;rly/2012/01/27/l 121400109)。经常通过 质粒DM递送进入细胞来绕开病毒摄取效率低下。运样的方法并不允许病毒进入的研究。此 夕h癌细胞系不是理想的研究模型，因为它们具有异常分化、失调的基因表达、异常的细胞 信号传导和内吞功能。然而，用肝炎B病毒的自然宿主，即原代人肝细胞，进行的研究是困难 的，因为在细胞培养中的短时间W后，它们可能快速去分化和失去它们的肝炎B病毒感染和 复制的能力。在丙型肝炎病毒化CV)的情况下，仅可W对有限子集的病毒菌株进行体外研 究，并限于重组2a基因组，JFH1。此外，在此基因组已进行的突变，在细胞培养，中其允许复 审ij，已被证明会干扰感染性病毒的生产(Pietschmann et al:PLoS F*a1:hogens 5(6)2009)。 在细胞培养中主要HCV分离物并不很好地复制并且在HCV生物学中的主要挑战仍然是体外 增殖另外的基因型或野生型病毒（Steinmann and Pietschmann:Cu;rrent Topics in Microbiology and Immunology Volume 369,2013,pp 17-48)〇Ploss等（2010,PNAS'Vol 107(7)pp.3141-3145)讨论了用于丙型肝炎感染模型的策略，其包括细胞外基质操作，限定 的培养基，利用生物反应器的流体流动，或细胞-细胞相互作用的变化，其中通过形成3D球 形集合体或与非实质细胞类型一起的共培养。Ploss等进一步描述了，虽然一些运些模型提 供必要的细胞外基质线索，但它们缺少关键的异型细胞-细胞相互作用或对组织架构的控 审IJ，已知其会影响肝特异性功能。重要地，由Ploss等研究的模型是较差的:细胞不能提供有 效的摄取，产生低滴度，W及病毒感染到新细胞的扩散是有限的。假设，肝细胞的正确极化 和分化的保持可能是重要的因素。在Ploss等中使用的模型还不代表人系统，其中利用人和 鼠细胞的异源组合。细胞间相互作用和潜在传染已经参与嗜肝病毒再生和扩散（总结于 Steinmann),从而表明需要同源系统用于运些研究。此外，Wu等（2008.化oS Pathogens Vol 8(4)，pp. 1-14)讨论了分化的重要性，其中干细胞衍生的肝细胞的生产性丙型肝炎病毒感 染掲示了在分化过程中到病毒许可的临界转变。

【发明内容】

[0003] 本发明的目的是提供用于模仿体外肝脏感染过程的改善的方法。
[0004] 根据本发明的第一方面，提供了用于研究体外肝脏组织中的感染过程的方法，上 述方法包括：
[000引-将肝实质细胞化epatoc^e cell)接种到在生物反应器中的支架上W形成肝脏 组织模型；
[0006] -将感染剂递送到肝脏组织模型，或提供用感染剂预感染的肝脏组织模型；W及
[0007] -监测感染过程。
[0008] 将感染剂递送到肝脏组织可W包括在接种肝实质细胞W后将感染剂加入肝脏组 织模型。将感染剂递送到肝脏组织可W包括在接种W前将感染剂加入肝实质细胞。将感染 剂递送到肝脏组织可W包括将感染剂加入非实质细胞(non-parenchymal cell)并随后将 非实质细胞接种到支架上。提供用感染剂预感染的肝脏组织模型可W包括在接种它们在支 架上W前将感染剂加入肝实质细胞和/或非实质细胞。
[0009] 上述方法可W用于研究体外肝脏组织中的病毒感染和/或病毒复制。可替换地，上 述方法可W用于研究体外肝脏组织中的追疾感染(malarial infection)。
[0010] 有利地，本发明的方法允许肝实质细胞在长期研究期间维持它们的分化，如超过 14天并且甚至达到并超出28天。另外，本发明的方法允许细胞产生更为极化的表型，其已被 证明设及感染，如病毒感染。本发明的方法提供了理想的环境，其模拟自然宿主环境并导致 用于研究感染过程的体外模型。
[0011] 上述方法可W进一步包括将活性剂递送到肝脏组织模型。可W同时或顺序地使用 活性剂的组合。活性剂可W包括候选药物、标记物、或细胞信号分子（cel 1 signal ing molecule),如细胞因子。候选药物可W包括抗体、或其片段或变体;小分子;肤;或核酸，如 siRNA。候选药物可W包括低聚物。候选药物可W包括核巧酸类似物。候选药物可W包括抗 病毒药物。候选药物可W包括抗生素。
[0012] 小分子可W包括化合物(化学化合物，chemical compound)。小分子可能不是生物 分子。小分子可能不是聚合物核酸、蛋白质、或抗体的任何一种。小分子可W包括<900道尔 顿的低分子量的有机化合物，其可W作为生物过程的酶底物或调节物，其尺寸约为l(T 9m。生 物聚合物如核酸、蛋白质、和多糖(如淀粉或纤维素)不可能被视为小分子。生物聚合物的构 成单体，如核糖核巧酸或脱氧核糖核巧酸、氨基酸、和单糖可被认为是小分子。小低聚物可 被视为小分子，如二核巧酸，肤如抗氧化谷脫甘肤，W及二糖如薦糖。
[0013] 递送活性剂到肝脏组织模型有利地允许体外筛选和研究用于肝病毒感染的潜在 疗法。
[0014] 可W在递送病毒或编码病毒的核酸W前、同时（simultaneous ly)、并行 (concurrent ly)或W后，将活性剂递送到肝脏组织模型。
[0015]肝实质细胞可W是人或非人肝实质细胞。肝实质细胞可W是人肝实质细胞。肝实 质细胞可W包括原代肝实质细胞。肝实质细胞可W包括非原代肝实质细胞，如干细胞源性 肝实质细胞或祖细胞源性肝实质细胞。肝实质细胞可W新鲜分离自供体，或来自冷冻保存 源。肝实质细胞可W来自冷冻保存源。肝实质细胞可W来自相同供体或合并自多个供体。肝 实质细胞可w包括雌性来源的肝实质细胞或由雌性来源的肝实质细胞组成。肝实质细胞可 W包括雄性来源的肝实质细胞或由雄性来源的肝实质细胞组成。肝实质细胞可W包括胚胎 来源的肝实质细胞或由胚胎来源的肝实质细胞组成。肝实质细胞可W包括成年体来源的肝 实质细胞或由成年体来源的肝实质细胞组成。肝实质细胞可W包括未成年体来源的肝实质 细胞或由未成年体来源的肝实质细胞组成。可替换地，肝实质细胞可W不包括胚胎来源的 肝实质细胞或不由胚胎来源的肝实质细胞组成。
[0016] 上述方法可W进一步包括与肝实质细胞一起接种另外的细胞。另外的细胞可W包 括非实质肝细胞。
[0017] 非实质肝细胞可W选自包括巨隧细胞(枯否细胞）、星形细胞(伊藤细胞）、胆管细 胞、肝窦内皮细胞、肝前体细胞、和其它次要的非肝实质细胞的肝细胞(non-hepatocyte liver cell)、或它们的组合的组的任何一种。非实质肝细胞可W是人或非人非实质肝细 胞。非实质肝细胞可W是人非实质肝细胞。非实质肝细胞可W新鲜分离自供体，或来自冷冻 保存源。非实质肝细胞可W来自相同供体或合并自多个供体。非实质肝细胞可W包括雌性 来源的非实质肝细胞或由雌性来源的非实质肝细胞组成。非实质肝细胞可W包括雄性来源 的非实质肝细胞或由雄性来源的非实质肝细胞组成。非实质肝细胞可W包括胚胎来源的非 实质肝细胞或由胚胎来源的非实质肝细胞组成。非实质肝细胞可W包括成年体来源的非实 质肝细胞或由成年体来源的非实质肝细胞组成。非实质肝细胞可W包括未成年体来源的非 实质肝细胞或由未成年体来源的非实质肝细胞组成。可替换地，非实质肝细胞可W不包括 胚胎来源的非实质肝细胞或由胚胎来源的非实质肝细胞组成。
[0018] 可W在肝实质细胞W前、同时、并行或W后，将非实质细胞接种到支架上。在接种 到支架上W前，可W混合非实质细胞与肝实质细胞。可W与肝实质细胞同时或并行，将非实 质细胞接种到支架上。
[0019] 根据需要，肝实质细胞和非实质细胞的比率可W是可调节的。可W调节肝实质细 胞和非实质细胞的比率W模仿在肝脏组织中通常发现的比率。可W通过FACS分选来分选肝 实质细胞和非实质细胞。肝实质细胞与非实质细胞的比率可W反映健康或患病肝脏。肝实 质细胞与枯否细胞的比率可W是约10:1，例如在健康肝脏的模型中。肝实质细胞与枯否细 胞的比率可W是约3:1，例如在发炎肝脏的模型中。肝实质细胞与非实质细胞的比率可W是 约2:1至约20:1、或约3:1至约15:1。肝实质细胞与非实质细胞的比率可W是约3:1至约10: 1。肝实质细胞与非实质细胞的比率可W是约3: 2。
[0020] 肝实质细胞和非实质细胞可W是相同物种的。肝实质细胞和非实质细胞可W是处 于相同的发育或分化阶段。肝实质细胞和非实质细胞可能不是不同物种的异源组合。肝实 质细胞和非实质细胞可W包括几乎所有的人类细胞、或基本上所有人类细胞。非实质细胞 可W包括几乎所有的人类细胞、或基本上所有人类细胞。肝实质细胞可W包括几乎所有的 人类细胞、或基本上所有人类细胞。
[0021] 接种的细胞可W基本上是非聚集奇异细胞。可球状体的形式来提供运些细 胞。在接种W前、或期间，细胞不可W提供一段时期的聚集。
[0022] 可约0.2X106至约2xl06个细胞/支架的密度，将肝实质细胞和/或另外的细胞 接种至肝脏组织模型中。可约0.3X106至约2xl06个细胞/支架的密度，将肝实质细胞和/ 或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可约〇.4xl0 6至约2xl06个细胞/支架的密度将肝 实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可WW约〇.5xl06至约2xl06个细胞/支 架的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可约0.6X106至约 1.5x1ο 6个细胞/支架的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可W W约0.6χ106至约1.2x1ο 6个细胞/支架的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组 织模型中。可约0.4χ106至约O.SxlO 6个细胞/支架的密度将肝实质细胞和/或另外的细 胞接种至肝脏组织模型中。可约0.5x1ο6至约O.SxlO 6个细胞/支架的密度将肝实质细胞 和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可约0.5x1ο6至约0.7X10 6个细胞/支架的密 度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可约0.6x1ο6个细胞/支架 的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可约10,000至约5， 000,000个细胞的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可约 50，000至约2，000,000个细胞的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型 中。上述方法可W进一步包括将另外的肝实质细胞加入肝脏组织模型。可W在细胞培养期 间，或在介质转换/置换期间，添加另外的肝实质细胞。
[0023] 在接种到支架上W前，非实质细胞可W感染有感染剂。在接种到支架上W前，非实 质细胞可W感染有病毒、或编码病毒的核酸。
[0024] 可W在活性剂W前的约1秒至约27天递送感染剂。可W在活性剂W前的约1分钟至 约20天，递送感染剂。可W在活性剂W前的至少1天，递送感染剂。可W在活性剂W前的至少 1小时、或至少3小时、或至少8小时、或至少12小时，递送感染剂。
[002引可W与活性剂同时或并行递送感染剂。可W在活性剂W后的约1秒至约27天，递送 感染剂。可W在活性剂W后的约1分钟至约20天，递送感染剂。可W在活性剂W后的至少1 天，递送感染剂。可W在活性剂W后的至少1小时、或至少3小时、或至少8小时、或至少12小 时，递送感染剂。
[0026] 在接种W前对细胞(如肝实质细胞和/或非实质细胞)进行预感染的情况下，可W 在接种W前至多达6小时，将感染剂递送到细胞。可W在接种W前至多达3小时，将感染剂递 送到细胞。可W在接种W前至多达1小时，将感染剂递送到细胞。
[0027] 上述方法可W进一步包括递送另外的感染剂。另外的感染剂可W是与第一感染剂 不同的物种、生物体(0巧anism)或菌株(strain)，或感染剂的突变体。
[0028] 上述方法可W进一步包括诱导肝脏组织模型中的一种或多种细胞的细胞修饰。细 胞修饰的诱导可W是在感染剂递送W前、并行、同时、或W后。细胞修饰的诱导可W是在活 性剂递送W前、并行、同时、或W后。细胞修饰可W是生理变化、或遗传修饰、修饰基因表达 或调控。
[0029] 感染过程可W生产感染剂的后代。可W收获后代。可W再循环后代W递送回到肝 脏组织模型的细胞。
[0030] 可W减弱后代。后代可W无法复制，或可W能够仅复制一次。可W减弱后代W致它 们是比未减弱的等效野生型感染剂较少致病的。感染剂可W包括病毒、或编码病毒的核酸。 感染剂可W包括寄生生物。寄生生物可W包括追原虫(malarial perasite)。感染剂可W是 追原虫属的。感染剂可W包括原生生物。感染剂可W包括子抱子、裂殖子、配子体或合子/动 合子。感染剂可W是细菌、真菌或原虫。感染剂可W包括任何生物体、病毒、核酸、或航病毒， 航病毒能够影响肝脏组织中的细胞，感染在肝脏组织中的细胞，在肝脏组织中的细胞中复 审IJ，和/或在肝脏组织中的细胞中进行至少部分的它的生命周期。感染剂可W包括病毒载 体。病毒载体可W包括皿V载体，例如源自在化pG2细胞中的质粒转染。
[0031] 感染剂可W能够感染肝脏的细胞，如肝实质细胞。感染剂可W包括任何肝营养感 染剂。
[0032] 病毒可W包括来自病毒家族的肝影响病毒，上述病毒家族选自包括肝DNA病毒家 族、小核糖核酸病毒家族、黄病毒家族、S病毒家族、和肝炎病毒家族组成的组的任何一种。
[0033] 病毒可W包括肝DNA病毒家族的成员。病毒可W包括肝炎病毒。肝炎病毒可W是选 自由肝炎A(微小RNA病毒）、B(嗜肝DNA病毒）、C(丙型肝炎病毒）、0(δ病毒）、E(肝炎病毒）、F (目前假设的）和GB病毒C组成的组的任何一种。病毒可W包括肝炎B、D或C病毒。病毒可W包 括肝炎B病毒。病毒可W包括肝炎D病毒。可W将不同病毒的组合或混合物递送到肝脏组织 模型。例如，可W将选自肝炎4、8、(：、0、6少或6的两种或更多种病毒递送到肝脏组织模型。病 毒可W包括皿eAg阴性皿V和/或皿eAg阳性皿V。病毒可W包括肥V基因型1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、或11。病毒可^包括肥￥，其选自由1曰、化、1。、2曰、26、2。、3曰、313、4曰、413、4。、4(1、46、5曰、 6曰、7曰、76、8曰、86、9曰、10曰、和11曰、或它们的组合组成的组的任何一种。病毒可^包括肥￥基 因型2a。病毒可W包括HCV基因型la或化。病毒可W包括HCV 2JFH1菌株。
[0034] 病毒可W包括肝相关病毒。肝相关病毒可被认为是能够感染肝脏或在肝脏组织中 有影响的病毒，但肝脏组织可能不是它的主要嗜性（向性，tropism)。肝相关病毒可W是选 自包括巨细胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、风疹病毒、黄热病毒、沙粒病毒、马堡病 毒、埃博拉病毒、裂谷热病毒、和克里米亚-刚果出血热相关病毒的组的任何一种。
[0035] 感染剂可W包括耐药性感染剂。感染剂可W包括耐药性病毒。耐药性病毒可W包 括耐抗病毒药物病毒，如耐DAA(直接作用的抗病毒药物）。感染剂可W包括耐拉米夫定、替 拉瑞韦、或波西普韦的病毒。感染剂可W包括NS5A、NS5B、或NS3HCV菌株。
[0036] 感染剂可W包括修饰物(modification)，其中，除了感染剂蛋白W外或通过替代 感染剂蛋白，将报告蛋白/标记蛋白整合在感染剂中。感染剂可W包括修饰物，其中，除了感 染剂遗传密码W外或通过替代感染剂遗传密码，将报告蛋白/标记蛋白编码在感染剂核酸 内。病毒可W包括修饰，其中，除了病毒蛋白W外或通过替代病毒蛋白，将报告蛋白/标记蛋 白整合在病毒颗粒中。病毒可W包括修饰，其中，除了病毒遗传密码W外或通过替代病毒遗 传密码，将报告蛋白/标记蛋白编码在病毒核酸内。报告蛋白/标记蛋白可W包括巧光素酶。
[0037] 感染剂可W来源自人血液产品。血液产品可W来自感染有感染剂的患者。血液产 品可W来自感染有感染剂的转基因动物。病毒可W来源自产生人感染感染剂的转基因动物 模型。
[0038] 可W在递送W前浓缩感染剂。可W通过沉淀来浓缩感染剂。可W在递送W前完全、 基本上或部分纯化感染剂。
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