根据细胞尺寸来培养间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种根据细胞尺寸来培养间充质干细胞的方法。尤其设及一种用于尺 寸小于等于祉m的间充质干细胞的分离，W及将它们在特定条件下培养的方法。
【背景技术】
[0002] 术语"干细胞"是在胚胎、胎儿和成人的组织中发现的一种未分化类型的体细胞的 通称，它具有分化成多种特定细胞类型的潜能。
[0003] 干细胞根据其潜能可W分类为：多潜能干细胞(pluripotent stem cells)，多能 干细胞(multipotent stem cells)和专能干细胞(unipotent stem cells),多潜能干细胞 具有分化成任意类型细胞的多潜能性。胚胎干细胞和诱导性多潜能干细胞（induced pluripotent stem，iPS)是多潜能干细胞的代表。成体干细胞表现出多能性和/或单能性。 其中包括造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞等。
[0004] 尽管在细胞治疗中利用人胚胎干细胞的多潜能性进行了许多尝试，但是仍然保持 着肿瘤发生和免疫排斥反应的高可能性，并且运是难W克服的障碍。
[0005] 至于iPS细胞，它们是通过重编程特意由已分化的成年体细胞回归到它们最初的 胚胎干细胞阶段的一类干细胞。由于其是自体细胞，因此细胞可避免免疫排斥反应的风 险，但细胞的肿瘤发生风险仍然是需要解决的问题。
[0006] 间充质干细胞已被提作解决运些问题的一种替代选择，因为它们表现出免疫调节 作用且没有表现出肿瘤发生风险。间充质干细胞是可W分化成多种细胞类型的多能干细 胞，并且被熟知具有调节免疫应答的功能，所述多种细胞类型包括脂肪细胞、成骨细胞、软 骨细胞、成肌细胞、成神经细胞、成屯、肌细胞、肝细胞、膜岛0细胞、血管细胞等。
[0007] 间充质干细胞可分离自多种组织(例如骨髓、厮带血、脂肪组织等），但可能不能对 其进行充分定义，运是因为根据间充质干细胞衍生的来源，彼此的细胞表面标记物具有一 些差异。一般来说，如果它们可W分化成成骨细胞、软骨细胞和成肌细胞，具有纺键体形态， 并且表达表面标记物〔073( + )、〔0105( + )、〔034(-)和〔045(-)，则可将运种干细胞定位为间 充质干细胞。在运种情况下，不同遗传来源和/或背景的间充质干细胞在标准定义下彼此不 具有显著差异，但是彼此在体内活性方面具有显著差异。另外，当使用间充质干细胞作为外 源细胞治疗剂时，有限的间充质干细胞的池(pool)并不允许进行其他可用选择，甚至不管 低的体内活性。
[000引此外，为了将间充质干细胞应用到临床实践，考虑到从组织中所获得的间充质干 细胞的数量有限，在初始阶段获得大量细胞W及将细胞传代培养是非常重要的。然而，间充 质干细胞会在传代中形成一个异质群体，运将影响到细胞的增殖、分化和老化，运使得间充 质干细胞很难被发展为治疗试剂。
[0009]为了努力克服 W 上问题，Li J 等，Cell Research，2008;Majore I 等，Cell Communication and Signaling,2009，Rataiczak MZ等，Aging,2012等公开了许多用于培 养间充质干细胞的方法。然而，运些方法具有一些缺点：异质细胞是通过运些方法获得，运 使得很难获得用于大量生产的必要数目的细胞，而且细胞的增殖能力在每次传代之后降 低，细胞的老化进展加快。此外，上述文献中所使用的设备并不适用于良好操作规范(GMP)， 运使得将其应用于实际生产过程很困难。因此，需要一种低成本提取均匀细胞群和使细胞 有效地大量增殖的方法。
【发明内容】
[0010] 有鉴于此，本发明因此，本发明的一个目的是提供一种有效培养间充质干细胞的 方法。
[0011] 本发明的另一个目的是提供采用所述方法制得的间充质干细胞，所述间充质干细 胞在增殖能力和分化潜能有改善。
[0012] 本发明的另一个目的是提供包含所述间充质干细胞的细胞治疗剂。
[0013] 根据本发明的一个方面，提供了一种培养间充质干细胞的方法，所述方法包括W 下步骤：（1)分离间充质干细胞，所述间充质干细胞的尺寸小于等于8μπι; (2)将所述间充质 干细胞在2-5 %的氧气条件下于含有2.1-3.8mM的巧和1.0-3. OmM的儀的培养基中培养。
[0014] 根据本发明的另一个方面，提供了通过上述方法制得的间充质干细胞，所述间充 质干细胞在增殖能力和分化潜能有改善。
[0015] 根据本发明的进一步方面，提供了包含所述间充质干细胞的一种细胞治疗剂。
[0016] 本发明的一方法可W显著提高间充质干细胞的增殖能力和分化潜能，该方法是通 过分离尺寸小于等于如m的间充质干细胞，并将它们在含巧、儀的条件下W及在低氧条件 (low oxygen)下进行培养，运允许获得的间充质干细胞用作细胞治疗剂。
【附图说明】
[0017] 图1展示了在膜蛋白酶处理前的贴壁形式（图la)和膜蛋白酶处理后的单细胞形式 的间充质干细胞的图表。也展示了通过细胞计数器(Cellometer)测得的细胞尺寸分布的示 意图（图1C)。
[0018] 图2A和2B是展示在将间充质干细胞(MSCs#l至#4)培养后通过细胞计数器测得的 细胞的尺寸分布的图表。
[0019] 图3是展示了在将细胞传代培养后，具有小尺寸(MSCs#l和#2)的细胞组I和具有大 尺寸（MSCs#3和#4)的细胞组II的累积群体倍增数（cumulative population doubling (CPD))的图表。
[0020] 图4为依照本发明的一方法获得的尺寸少于等于8wii的间充质干细胞(小）的显微 照片。
[0021] 图5a提供了未分离的细胞组(原始的，左）、细胞尺寸超过祉m的细胞组(大，中）和 细胞尺寸小于等于祉m的细胞组（小，右）的显微照片。图化和5c为分别展示运3组的增殖能 力和累积群体倍增数(cumulative population doubling(CPD))的图表。
[0022] 图6为根据尺寸小于等于祉m的间充质干细胞的比值所示出的细胞增殖能力的图 表，1-5组分别指的是W下组成的间充质干细胞(MSCs):超过祉m( 100% )的MSCs ;超过祉m (75 % )的MSCs+小于等于祉m(25 % )的MSCs;超过祉m(50 % )的MSCs+小于等于祉m(50 % )的 MSCs;超过祉m( 25 % )的MSCS+小于等于祉m( 75 % )的MSCs;小于等于（100 % )的MSCs。相对于 组1而言，每组的增殖能力呈现出成倍增加。
[0023] 图7示出了尺寸小于等于祉m的细胞组(小）和未分离的细胞组(原始的）在常规培 养条件(对照）、添加巧(包括儀）的条件(Ca 2+(Mg2+))、低氧条件和CMH条件下培养后的细胞 形状(a, b)和细胞增殖能力（C)的检测结果，其中，CMH条件指的是添加巧(包括儀)条件/低 氧条件。
[0024] 图8提供了展示未分离的细胞组(原始的）和从厮带血(MSCs#l至#4)的传代培养衍 生出的4种类型的间充质干细胞的小细胞组，在常规培养条件和CMH条件下培养后的增殖能 力(8A)和累计群体倍增数(8B)的测试结果的图表。
[0025] 图9为一种厮带血衍生间充质干细胞(MSC#1)在含有浓度为1.8-4.4mM的巧的介质 中培养6天后的细胞数目的结果。
[00%]图10为一种厮带血衍生间充质干细胞(MSC#1)在标准氧（常氧，normoxia)、3%氧 和5%氧的条件下培养后的细胞数目的结果。
[0027]图11提供了在原始细胞组和小细胞组于常规培养条件和CMH条件下培养之后的蛋 白质印迹(Western blot)的结果和展示p53和p21(增殖抑制标记物）的表达水平的一个定 量图表。
[00%]图12A和12B提供了原始细胞组和小细胞组在常规培养条件和CMH培养条件下经几 次传代培养和细胞衰老诱导之后，染色的老化细胞的图表W及展示染色的细胞数目与总细 胞数目比值的图表。
[0029] 图13提供了展示在原始细胞组和小细胞组于常规培养条件和CMH培养条件下培养 之后的成骨诱导(a)和成脂诱导(b)的图表。
【具体实施方式】
[0030] 本发明提供了一种培养间充质干细胞的方法，所述方法包括W下步骤：（1)分离间 充质干细胞，所述间充质干细胞的尺寸小于等于祉m; (2)将所述间充质干细胞在2-5%氧气 的条件下于含有2.1-3.8mM的巧和1.0-3. OmM的儀的培养基中培养。
[0031] 本发明是基于发现尺寸小于等于祉m的间充质干细胞比其他尺寸的间充质干细胞 具有更好的增殖能力，W及间充质干细胞的增殖能力和分化潜能可W通过将它们在低氧条 件下于含有特定浓度的巧和儀的培养基中进行培养而进一步提高。
[0032] 本发明的一种培养间充质干细胞的方法中，