专利名称：用于干细胞培养的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本公开涉及细胞培养技术。具体而言，本公开涉及可用于基本未分化状态的干细胞长期培养而同时维持高生存力的培养基和培养条件。
背景技术：
干细胞是可再生器官、修复组织、制备或递送生物因子以及治疗疾病或病症的潜在来源。
发明内容
在单细胞条件下，人多能干细胞(hPQ例如人胚胎干细胞(hES)和诱导的多能干细胞(hiPS)极其脆弱，这妨碍了实际应用。本公开表明，用非肌肉肌球蛋白II (匪II)的高效抑制剂(例如肌球蛋白II马达活性抑制剂(blelAistatin))处理相当大地增强了克隆密度和悬浮条件下hES和hiPS细胞的存活，并且与合成的基质一起支持用于自我更新的确定环境。本公开通过消除培养过程中动物或人来源的细胞外基质(ECM)提供用于人诱导的多能干细胞(hiPS)和人胚胎干细胞(hES)增殖的基本上无病原体的培养环境。本公开证明了抑制肌球蛋白II增加细胞-基质粘附和细胞存活，这有效支持了 hiPS和hES细胞在完全限定培养基中的化学合成的培养物质聚D-赖氨酸包被上的自我更新。因为人多能干细胞的诱导利用了与细胞维持和扩大相同的培养环境，所以该方法还可用于对于基于细胞的治疗方法所必需的完全无异源材料的新hiPS和hES细胞系的诱导。当前的无饲养层hESC培养方法需要特定的包被，例如Matrigel (基质胶)，血清成分和人细胞来源的ECM，hESC需要粘附到其上以增殖。本公开提供促进在缺乏此类包被和饲养层下的干细胞生长的培养组合物和条件。本公开至少因为下列原因影响hESC培养技术首先，因为Matrigel 或人细胞来源的ECM是多种细胞外基质例如层粘连蛋白、纤连蛋白、和IV型胶原的混合物，其成分可随批次而不同，通过消除使用细胞来源的材料，可以使当前取决于包衣材料的质量和条件而高度变化的hESC繁殖过程进一步标准化；第二，由于细胞来源的生物材料从来不能够完全避免生物污染，包括病毒和抗原，不需要细胞来源的包衣将导致对GMP级hESC的生长相当有利；第三，虽然人重组ECM可以绕开潜在的污染问题，但是它们与简单地使用塑料组织培养板在制备时间、工作量和成本方面没有竞争性； 以及第四，由于合成的小分子相对简单并具有稳定结构，所以对于它们转移至临床环境中认为是有利的。实际上，例如Rock抑制剂Y27632已经成功地用于临床研究。在本文中描述了用于本公开的方法和组合物中的另外的化学抑制剂。
本公开提供了包含基础培养基和肌球蛋白I I抑制剂的组合物。肌球蛋白II抑制剂可以是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。基础培养基可包含完全确定成分培养基。在一些实施方案中，组合物中还可以包括ROCK抑制剂。在某些实施方案中，组合物中可包括血清，包括与细胞类型同种异体的或者自体的血清。在又一实施方案中，组合物还可进一步包括氨基酸，例如非必需氨基酸。在另一实施方案中，在组合物中可以包括还原剂 (例如β巯基乙醇)。在组合物中可以包括抗微生物剂和/或抗真菌剂。本公开还提供包含补加有非必需氨基酸、抗氧化剂、还原剂、生长因子、丙酮酸盐和肌球蛋白II抑制剂的基础培养基的组合物。肌球蛋白II抑制剂可以是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。本公开还提供包含聚-D-赖氨酸或者以聚-D-赖氨酸包被的组织培养板、瓶或生长基底，确定成分培养基和肌球蛋白II抑制剂的试剂盒。应当认识到，试剂盒可以如此区室化，以致于本公开的组合物可以在使用前混合。肌球蛋白II抑制剂可以是肌球蛋白II 马达活性抑制剂或其类似物。本公开还提供培养干细胞(包括hiPS和ESC)的方法，包括将干细胞悬浮于包含肌球蛋白II抑制剂的培养基中；和在聚-D-赖氨酸包被的组织培养基底存在下培养干细胞。在一个实施方案中，培养基是确定成分培养基。在另一实施方案中，培养基无动物产物。本公开还提供干细胞培养物，包含在包含确定成分培养基和肌球蛋白II抑制剂的组合物中的干细胞，其中无干细胞和Neu5Gc并且其中干细胞没有在任何动物产物材料存在下培养(例如培养至少1、2、5、10、20、30、40或50或更多代)。在一个实施方案中，在聚-D-赖氨酸存在下培养干细胞。在一个实施方案中，肌球蛋白II抑制剂是肌球蛋白II 马达活性抑制剂或其类似物。
图IA-D显示肌球蛋白II是调节ES细胞的细胞-细胞接触中的Rock下游的典型效应物。㈧以混杂的(scrambled)) siRNA转染的mES(CJ7)细胞的形态学，显示对细胞-细胞粘附没有影响，而以靶向肌球蛋白IIA和IIB两者的siRNA转染的细胞表现出细胞-细胞接触的显著破坏。细胞接触指数支持形态学观察。数据是平均值士30，** <0.001，11 = 5。(B)免疫荧光分析将MYPTl蛋白质定位在未分化ES细胞的细胞-细胞间连接部位。插图显示同一集落的相差图像。(C)描述Rock通过MYPTl的抑制而调节肌球蛋白II功能的分子途径。虚线表示直接磷酸化和活化MRLC的替代的Rock功能。(D)在通过siRNA的保护性实验中，mES细胞以MYPTl siRNA转染，并且M小时后，以Y27632处理M小时。细胞能够对抗抑制剂的强破坏细胞接触作用而维持它们的细胞-细胞完整性。在挽救实验中， 以Y27632处理M小时的mES细胞，随后以靶向MYPTl的siRNA转染。M小时后，将细胞拍照。相当大比例的细胞能够恢复它们的细胞-细胞接触并且形成了前集落样结构。通过表现形态学观察的CCI定量细胞-细胞接触状态。数据是平均值士SD，**p < 0. 005,η = 5。 标尺，25 μ m。图2显示ES细胞中的siRNA介导的基因沉默。为了确定mES细胞中的siRNA转染效率，使用Lipofectamine 2000以40nM的绿色荧光团(FAM)标记的siRNA转染细胞，并且M小时后，在荧光倒置显微镜上评价细胞。实际上几乎所有的细胞掺入了荧光团标记的
5SiRNA0插图表示相差图像。为了评价内源基因被siRNA处理敲低的水平，当将两种不同的 siRNA混合时，以40nM或25nM的靶向特定基因的每一 siRNA转染mES细胞。24小时后，收获细胞，并进System分析和QPCR分析。对于Wfestern分析，使用β-肌动蛋白作为加样对照。虽然似乎Rock I siRNA具有同种型特异性的作用，但是Rock II siRNA以相似方式影响两种同种型。因此，仅当通过共转染Rock I和Rock II siRNA使Rock I和RockII 同时耗竭时，才能评价Rock siRNA对细胞-细胞接触的影响。对于QPCR分析，将数据针对 β-肌动蛋白的表达水平标准化。mES细胞中肌球蛋白IIC的内源mRNA水平比其它肌球蛋白低两个数量级。虽然肌球蛋白IIC特异性siRNA处理进一步降低表达水平至对照的40%， 但是没有观察到对细胞-细胞接触的实质影响。标尺，25 μ m。图3A-D显示调节细胞-细胞通讯的liho-Rock-肌球蛋白II信号轴在hES细胞中是保守的。(A)未分化hES细胞(H9)的形态学，显示紧密连接的集落。通过投射电子显微镜的超微结构分析表明在细胞-细胞接触部位存在特化的连接复合体(箭头)。(B)以C3 胞外酶(20yg/ml)处理M小时的hES细胞表现出紧密的细胞-细胞连接被破坏。超微结构分析显示，C3处理的细胞偶尔会通过细胞边缘的小区域与毗邻细胞接触(插图)。(C) Y27632以比对于mES细胞(10 μ M)的浓度更高的浓度(20 μ Μ)分解生长在基质胶上的hES 细胞中的细胞-细胞连接。细胞接触指数概述了抑制剂对hES细胞的影响。数据是平均值士SD，**p < 0. 001，η = 5。(D)在对照条件下生长的hES细胞的免疫荧光分析显示，肌球蛋白IIA专一性定位于细胞-细胞接触部位，其与E-钙黏着蛋白的亚细胞分布重叠。肌球蛋白II特异性的合成的抑制剂肌球蛋白II马达活性抑制剂(10 μ M)以与在C3或Υ27632 处理的细胞中所看到的相似的方式破坏hES细胞中的细胞-细胞连接。标尺，25 μ m。图4A-E显示肌球蛋白II选择性抑制剂肌球蛋白II马达活性抑制剂增强在确定条件下的人诱导的多能干细胞(iPS)的细胞-基质相互作用、细胞存活和自我更新。(A)以不同浓度肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y27632处理的PDL包被上的hiPS细胞的形态学。 在抑制剂缺乏下hiPS细胞没有粘附到PDL包被上(数据未显示)。(B)以不同浓度肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y27632处理的悬浮培养的hiPS细胞的胚状体形成。在显微镜下计数5个不同视野内的胚状体数量。数据是平均值士SD，n = 5。在三个独立的实验中观察到类似的结果。(C)在2. 5μ M的肌球蛋白II马达活性抑制剂或Υ27632存在下在基质胶或 PDL上生长的hiPS细胞的细胞生长。(D)如通过QPCR所测定的在2. 5 μ M肌球蛋白II马达活性抑制剂或Υ27632存在下在基质胶或PDL上生长的hiPS细胞中0ct3/4的表达。(E) 在2. 5 μ M肌球蛋白II马达活性抑制剂存在下在PDL包被上生长传代15次hiPS细胞的形态学(顶图)。中图显示图通过免疫细胞化学评价的在同样条件下生长的hiPS细胞中的 0ct3/4表达。在基质胶上生长的hiPS细胞表现出未分化集落和分化成纤维细胞的混合物 (底图)。标尺，除(E)底图外为50 μ m，100 μ m。图5显示总结调节ES细胞中基础细胞-细胞相互作用的Mio-Rock-肌球蛋白信号传导途径的模型。在研究中使用的化学物和siRNA分别以红色和星号突出显示。虚线表示细胞完整性和自我更新途径之内或之间潜在的机械相互作用。箭头表示活化并且横线表示移植。图6A-L显示通过肌球蛋白II马达活性抑制剂抑制匪II增强在克隆和悬浮培养条件下hPS细胞的存活。(a)如通过Western和免疫细胞化学分析所测定的hES细胞中NMHCIIA和IIB的表达。β -肌动蛋白用作加样对照。(b)通过ALP测定评价的hiPS细胞的克隆测定。hiPS细胞以每孔一个细胞铺于存在或缺乏5μ M肌球蛋白II马达活性抑制剂的96孔板中7天，随后通过ALP测定评价。(c)通过ALP阳性集落孔的数量与所接种孔的数量的比率测定克隆效率。数据是平均值士30，*邮<0.01，11 = 3。从hES细胞得到相似结果。(d-g)在粘附条件下hiPS细胞的细胞生存力测定。细胞以IXlO5个细胞/孔一式三份铺于PDL包被的12孔板中。M小时后，将细胞拍照(d)，并且通过台盼兰排染法计数有活力细胞的数量(e)。铺于含肌球蛋白II马达活性抑制剂的细胞显示存活率相当大地高于对照。数据是平均值士SD，*p < 0. 05，< 0. 01，< 0. 001，η = 3。相同的实验每一细胞系重复至少3次并且显示代表性的数据。对于每一单独的细胞系观察到对不同浓度肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y-27632具有相同的反应模式。从hES细胞得到相似的结果。(f)hiPS细胞凋亡的评价。对用于(e)中细胞生存力测定的细胞进行TUNEL分析。数据是平均值士30，邮<0.05，*邮<0.01，11 = 3。(g)通过使用抗裂解型胱天蛋白酶-3抗体的Western分析评价与(e)中所示相同条件下铺板的细胞。β-肌动蛋白用作加样对照。(h-Ι)肌球蛋白II马达活性抑制剂处理增加了悬浮培养中的hPS细胞的存活。 hiPS(FS)或hES (BGNOl)细胞于肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y-27632存在或缺乏下在悬浮培养液中培养2天，随后拍照(显示hiPS细胞)(h)，并且进行活细胞计数(i，j)。还开展TUNEL测定(k)和检测裂解型胱天蛋白酶-3的Western分析⑴(显示来自hiPS细胞的数据)。数据是平均值士SD，*p < 0. 05，< 0. 01，η = 3。β -肌动蛋白用作加样对照。标尺,25 μ m。图7A-H显示增强的NMHCIIA7A mES细胞存活率。(a)通过^festern分析评价亲本野生型(RW4)和NMHCIIA7A.突变体mES细胞中NMHCIIA和NMHCIIB表达。β -肌动蛋白用作加样对照。(b)生长于明胶包被板上的RW4和NMHCIIA7A-突变体细胞的形态学。突变体细胞显示松散的细胞-细胞接触，而RW4细胞表现出紧密的细胞-细胞粘附。(c-e) NMHCIIAVAmES细胞存活率高于RW4。将细胞以1 X IO5个细胞/孔的密度一式三份铺于明胶包被的12-孔板中。M小时后，将细胞拍照(c)，并通过活细胞计数(d)以及TUNEL测定 (e)评价。图是三次独立实验的代表性数据。数据是平均值士SD，*p < 0. 05，η = 3。(f) NMHCIIB7BmES细胞的相差图像。细胞保持细胞-细胞粘附。(c，d)NMHCIIB7B mES细胞如上所述铺板并且开展细胞生存力(g)和TUNEL(h)测定。数据是平均值士SD，n = 3。标尺，25 μ m。图8A-G显示对匪II的抑制增强人和小鼠多能干细胞中自我更新调节物的表达。 (a-d)hES细胞以IX IO5个细胞/孔铺于基质胶包被的6-孔板中不含肌球蛋白II马达活性抑制剂的mTeSR中。对小时后，将培养基换成新鲜的mTeSR或者含不同浓度肌球蛋白II 马达活性抑制剂或不含肌球蛋白II马达活性抑制剂的hESm中。在更换培养基后48小时时，收获细胞提取RNA或蛋白质。通过QPCR检测mTeSR(a)或hESm(b)中生长的细胞中的 0ct3/4和Nanog表达，或者通过Western分析检测hESm中生长的细胞中的0ct3/4和Nanog 表(c，d)。生长在不含肌球蛋白II马达活性抑制剂的mTeSR中的细胞的条件指示为“对照”。从hiPS细胞得到相似结果(数据未显示)。对于QPCR，将数据针对β-肌动蛋白表达水平进行标准化。在Y轴上的表达水平以任意单位显示(对照设置为1.0)。对于Western 分析，β-肌动蛋白用作加样对照。(e)还对在相同条件下(含5μ M或不含肌球蛋白II马达活性抑制剂的hESm)生长的细胞开展免疫细胞化学以检测0ct3/4表达。在每一条件之间使用完全相同的参数，包括对于每一滤光片的曝光时间捕获图像。相差图像显示生长于hESm中的细胞表现出大而扁的形态，而生长于mTeSR(对照)中的细胞保持紧凑且致密的形态。标尺，25 μ m。(f)通过QPCR分析在LIF存在下生长的野生型(RW4)和NMHCIIA7 AmES细胞中的0ct3/4和Nanog的表达。数据针对β -肌动蛋白表达水平标准化。对照设置为1. O。(g)通过Western分析评价在LIF存在或缺乏下生长2天的相同组的mES细胞系。β-肌动蛋白用作加样对照。图9Α-Η显示肌球蛋白II马达活性抑制剂处理支持完全确定条件下的hPS细胞的自我更新。(a-d)hiPS细胞于肌球蛋白II马达活性抑制剂存在下在PDL上生长20代。显示了在肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL条件(a)或标准无饲养层条件(Matr igel ) (b) 下的hiPS细胞的形态血。通过使用共焦显微镜的免疫荧光评价在肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL条件下生长的细胞0ct3/4表达的高倍图像或相差图像(c)。(d)通过Western分析评价在标准无饲养层(基质胶)、肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL或Y-27632/PDL条件下生长的细胞中的0ct3/4和Nanog表达。β -肌动蛋白用作加样对照。(e)通过计数活细胞数量确定在肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL、Y-27632/PDL或标准无饲养层(基质胶) 条件下培养的hiPS细胞的细胞生长曲线。每一数据点显示为平均值士SD，n = 3。在肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL、Y-27632/PDL或标准无饲养层条件下生长的细胞的群体倍增时间分别为约32. 1小时、32. 2小时或31. 8小时。WhES细胞得到相似的结果。(f)将在肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL条件下生长20代的细胞收获，并将大约2X IO6个细胞皮下注射入SCID/beige小鼠内。4至8周后，收集畸胎瘤，并进行组织学评价。证实每一畸胎瘤样品中存在3胚层衍生的组织。(g)通过免疫荧光分析检查石蜡包埋的畸胎瘤切片。在畸胎瘤来源的组织中检测到组织特异性标记物，例如巢蛋白、甲胎蛋白和α-平滑肌肌动蛋白。(h)通过标准的G-显带对在确定条件(肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL)下生长20代的hiPS(R5)细胞进行核型分析，并证实保持染色体完整性。标尺，25 μ m。图IOA-D显示肌球蛋白II马达活性抑制剂处理增强粘附条件下的hPS细胞的存活。(a)hiPS细胞以IXlO5个细胞/孔接种于基质胶包被的12-孔板中。M小时后，通过台盼兰排染测定法计数活细胞的数量。数据是平均值士SD，*p < 0. 05，**p < 0. 01，
<0. 001,η = 3。(b)hiPS细胞的凋亡测定。在荧光显微镜下检测TUNEL-FITC-阳性细胞， 并且计算TUNEL-阳性细胞数与PI-阳性细胞数的比率。数据是平均值士SD，*p < 0. 05，
< 0. 01，η = 3。(c)在PDL包被的皿中的含不同浓度肌球蛋白II马达活性抑制剂培养基中生长M小时的hiPS细胞的高倍相差图像。注意用肌球蛋白II马达活性抑制剂处理的粘附细胞的延长的细胞突起。(d)使用铺于PDL包被皿上的hiPS细胞测定不同浓度 MLCK抑制剂ML-7对细胞生存力的作用。观察到细胞存活没有显著增加。从使用hES细胞的实验得到相似的结果。标尺，25 μ m。图IlA-C显示通过肌球蛋白II马达活性抑制剂增强悬浮培养的hiPS细胞的存活。hiPS(NHDFl)细胞在肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y-27632存在或缺乏下悬浮培养生长2天，并进行活细胞计数(a)和TUNEL测定(b)。数据是平均值士 SD，*p < 0. 05，
<0. 01，η = 3。(c)悬浮条件下生长的hiPS细胞以不同浓度的ML-7处理。在以ML-7处理的细胞中观察到存活率没有差异。
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图12显示在确定条件下培养的hES细胞中保持了染色体完整性。hES(H9)细胞在确定条件(肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL)下生长20代，并通过标准G-带核型分析评价。证实了没有异常的雌性核型分析。如本领域技术人员将意识到的那样，在附图中表示的数据和信息仅是代表性的并且没有描述本公开的全部范围。
具体实施例方式如本文和后附权利要求书中所使用，单数形式“一”、“和”和“the”包括复数形式， 除非上下文明确地另外说明。因此，例如，当提到“细胞”时包括此类细胞的复数形式，并且当提到“试剂”时包括本领域技术人员已知的一种或多种试剂，等等。同样，“或”的使用意思是指“和/或”，除非另外说明。类似地，“包含”、“包含着”、 “包含的”、“包括”、“包括着”和“包括着”可互换并且不旨在是限制性的。还应当进一步理解，当使用术语“包含”描述不同实施方案时，本领域技术人员将
理解，在一些特定情况下，实施方案可备选地使用“基本上由......组成”或“由......组
成”描述。虽然在实施本公开的方法和组合物中可使用与本文所述的方法和材料相似或等效的那些方法和材料，但是本文描述示例性的方法、装置和好材料。除非另外定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。因此，如在本申请通篇中所使用，下列术语将具有下列含义。多能干细胞是经历自我更新而同时保持了产生所有三胚层衍生组织和生殖细胞谱系能力的细胞类型。虽然来源于人胚泡的多能人胚胎干细胞(hES)是用于治疗疾病和病症例如帕金森病、心肌梗塞、脊髓损伤和糖尿病的基于细胞治疗的有希望的来源，但是由于它们的免疫原性和伦理问题妨碍了它们的临床潜能。本公开证明，liho-Rock-肌球蛋白II (RRM)信号轴调节细胞-细胞以及细胞_基质相互作用，以及hiPS和hES细胞两者的细胞存活。基于该信息，本公开提供组合肌球蛋白II的化学抑制剂的培养系统(例如肌球蛋白II选择性的化学抑制剂)。此外，本公开证明生长在确定的合成的D-赖氨酸上的hES和 hiPS可以用于培养hES和hiPS细胞。因此，进一步添加低浓度肌球蛋白II抑制剂(例如诸如肌球蛋白II马达活性抑制剂及其类似物)与单一的合成基质的组合，以及完全确定成分培养基提供了如此的培养系统，即其减少(或消除)来自人来源或动物来源培养系统的病原体的存在。可以使用本公开培养基培养的细胞类型包括来自任何哺乳动物包括人、猴和猿的干细胞，并且包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和Nanog iPS细胞(见例如Nature，448 313-318，2007年7月；和Takahashi等，Cell，131 (5) :861-872 ；该两篇文献通过参考并入本文)。例如，诱导的多能干细胞(iPS或iPSC)是通过(内源基因的)选择性基因表达或者通过以异源基因转染从非多能细胞得到的一种类型的多能干细胞。诱导的多能干细胞由日本京都大学的Shinya Yamanaka研究组描述。Yamanaka已经鉴定了在胚胎干细胞中特别活跃的基因，并使用反转录病毒以选择的这些基因转染小鼠成纤维细胞。最后，分离了对于多能干细胞产生必需的四个关键的多能性基因0ct-3/4、 S0X2、c-Myc和Klf4。通过抗生素选择从细胞中分离出1^x15+细胞。该研究组与来自哈佛大学、MIT和加州大学洛杉矶分校的两个其他独立研究组一起公布了的一项研究显示成功地将小鼠成纤维细胞重编程进入iPS并且甚至产生活的嵌合体。虽然iPS细胞与ES细胞在分子和功能水平实际上相同，但是将它们的治疗潜能转化成医学应用存在关键的障碍。问题之一是，由于用于iPS细胞重编程和繁殖的当前标准方案包括不适宜用于潜在临床目的的动物来源的材料，所以需要开发产生和扩增hiPS细胞的确定的方法。用于hiPS和hES细胞的培养环境基本上依赖于两大主要元素，即培养基和ECM包被，后者包括基质胶，一种广泛用于无培养层培养方法的小鼠肿瘤细胞来源的ECM的混合物。虽然在理解自我更新机制中的最新进展已经导致制造出完全限定培养基，由于ECM结构成分的复杂性和关于多能干细胞细胞-细胞或细胞-基质相互作用方面的基础研究积累不足，所以满足严格的临床标准的包被方法的开发仍然是主要的挑战。细胞迁移、肌球蛋白合成和ECM相互作用在细胞发育、分化以及某些疾病例如动脉粥样硬化、关节炎和肾小球肾炎的发展中是重要的。细胞迁移的最初事件是突出物向迁移方向的极化和延伸。Rho家族小GTP酶通过调节细胞骨架和细胞粘附控制这些突出物(板状伪足和丝足)的形成。Rac和Cdc42分别参与板状伪足和丝足的形成，并且他0参与张力纤维的形成和收缩。通过这些Mio家族成员的协同调节使细胞能够迁移。当通过激动剂刺激细胞时，⑶P结合形式的Mio家族小GTP酶转变成GTP结合形式，并且它们与效应分子相互作用。MiO通过其效应分子例如MiO-激酶/R0CK/R0K和肌球蛋白磷酸酶的肌球蛋白结合亚基(MBQ调节肌球蛋白磷酸化(Kimura等，1996)。活化的 Rho与Iih0-激酶和MBS相互作用并活化Mio-激酶。随后，活化的Iiho-激酶磷酸化肌球蛋白轻链(MLC)和MBS。MBS的磷酸化使肌球蛋白磷酸酶失活。ESC源自胚泡的内细胞团(ICM)。ESC可无限生长(自我更新)而同时保持产生所有体细胞类型和生殖细胞谱系的能力(多能性)。这种特异性的干细胞功能已经在分子水平进行了研究，结果鉴定出主要转录因子例如0ct3/4和Nanog以及分泌的信号分子包括白血病抑制因子(LIF)、骨形态发生蛋白(BMP)和Wnt具有关键作用。最近对hESC的诱导开启了使用多能干细胞作为治疗疾病例如帕金森病和糖尿病的细胞移植治疗来源的大门。随着对hESC用于医学应用研究需求的日益增加，有必要研究如何调节多能性以开发过硬的技术以便诱导和扩大在诱导任何分化类型的成体细胞之前处于整个细胞治疗策略中心地位的hESC。干细胞是能够分化成其它细胞类型，包括具有特定的专门功能的那些细胞(例如组织特异性细胞、实质细胞及其祖细胞)的细胞。祖细胞(即“专能”)是可以产生不同的终末分化细胞类型的细胞，和能够产生不同祖细胞的细胞。产生一些或许多，但并非全部生物体细胞类型的细胞常常称作“多能性”干细胞，其能够分化成成熟生物体身体内的任何细胞类型，虽然在不重编程时它们不能够去分化成衍生它们的细胞。如将认识到的那样，“专能干细胞/祖细胞(例如神经干细胞)比多能干细胞具有更窄的分化潜能。比多能干细胞甚至更原始的另一类细胞(即未定型至走向特定分化的命运)是所谓的“全能”干细胞(例如受精卵，处于发育中二细胞和四细胞阶段的胚胎细胞)，可具有分化成特定物种任何细胞类型的能力。例如，单个全能干细胞将产生完整的动物，以及特定物种(例如人)中存在的无数的细胞类型。如可认识到的那样，在分离和培养干细胞用于移植、细胞再生和取代治疗、药物开发、产生模型系统用于研究哺乳动物发育、以及基因治疗存在很大的兴趣。然而，当前的培养条件在其维持分离的干细胞处于未分化但增殖状态的能力有限。例如，使用已经补加白血病抑制因子(LIF)的无饲养层培养可以维持胚胎干细胞和生殖细胞。另一方面，当细胞在没有适当的饲养细胞层或者来自适当饲养细胞系的条件培养基情况下培养时，甚至在 LIF存在下培养时，用于维持人胚胎干细胞的常规技术导致它们快速分化。此外，培养未分化干细胞的当前方法除了需要添加饲养细胞层(或者来自适当饲养细胞系的条件培养基)外，还需要诸如使用血清。对成分诸如血清、饲养细胞和/或条件培养基使培养干细胞过程复杂化，另外，对于体内应用，培养条件会导致异种材料的污染。 此外，饲养细胞和异种培养成分(例如胎牛血清等等)的使用增加了干细胞被不必要成分 (例如异常细胞、病毒、会引起干细胞群体接受体内免疫反应的细胞、异种融合细胞等等) 污染的风险，因此限制了干细胞作为治疗剂或者在生产治疗剂中的治疗潜能。本公开提供用于在缺乏动物产物的情况下培养干细胞的组合物、方法和系统。因此，本公开提供无动物产物的干细胞、使用此类干细胞的方法和包含此类干细胞的组合物。 本公开还提供用于在饲养细胞和动物材料缺乏情况下在完全确定成分培养基中培养干细胞，而同时维持高生存力(例如等于或高于典型的干细胞培养技术)并维持细胞处于未分化状态的方法和组合物。本公开包括修饰干细胞维持过程中的细胞信号发放，由此组织分化并且同时维持旺盛的细胞增殖的方法和组合物。例如，本公开的培养基将缺乏N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和/或乳酸脱氢酶增高症病毒(LDEV)，它们是来源于存在动物产物的培养基的污染物。本公开证明，通过选择性化学抑制剂肌球蛋白II马达活性抑制剂抑制肌球蛋白 II增强hiPS和hES细胞的细胞-基质相互作用和细胞存活，这是人多能干细胞在临床相关培养环境下成功生长的关键要素。此外，由于用于hiPS细胞和hES细胞诱导过程的培养条件与用于人多能干细胞常规维持和生长的培养条件基本上相同，所以本公开中开发的技术可用于产生无动物来源材料的新的hiPS和hES细胞系。通过由特异性细胞内信号传导途径调节的多种粘附分子、它们互联的支架蛋白质以及肌动蛋白-细胞骨架的协同合作实现细胞-细胞接触。虽然研究已经证明，数种细胞外分泌性信号分子例如LIF、BMP、FGF、TGF- β /Nodal和Wnt对于多能性遗传程序是重要的， 但是关于控制细胞-细胞通讯和整合的特异性细胞内信号分子在多能ESC内的功能意义知道的很少。细胞-细胞接触受多种类型粘附分子和互联骨架结构，包括肌球蛋白的调节，肌球蛋白是一种ATP-驱动的分子马达，其还决定细胞结构和极性细胞功能。siRNA介导的功能丧失实验证明，对于ES细胞的细胞粘附需要非肌肉肌球蛋白II。肌球蛋白II是双头常规肌球蛋白，它包括三种同种型，HA, IIB和IIC，它们当中除了 IIC外均在ES细胞中表达， 而分化的细胞表达所有这三种同种型。惊人的是，当肌球蛋白IIA和IIB同种型同时缺乏时，细胞表现出细胞-细胞接触的瓦解，这模拟了在缺乏Mio和Rock功能的细胞中所观察到的表型。Rock磷酸化MYPTl并使其失活，以保护驱动肌球蛋白II功能的磷酸化的活化形式MRLC。发现MYPTl专一性地定位于mES细胞中的细胞-细胞接触部位。如果Rock通过抑制mES细胞中的MYPTl控制肌球蛋白功能，则缺乏MYPTl将从Rock抑制剂的强大效应中援救本来的细胞-细胞通讯。与该假设相一致，在抑制剂处理之前或之后使MYPTl缺乏分别导致细胞-细胞接触明显地保护或恢复。当ESC在未分化状态下生长时，保持了较小的细胞大小和高的核/质比并经历紧密的集落形成。然而，当它们开始分化时表现出更大的和更扁的形态学，并且偶尔降低细胞-细胞接触，然后迁移至集落的外面。不管形态学观察的描述性性质如何，由于形态学准确地代表干细胞的特异生物学状态，所以它仍然常规用作主要且可靠的指标确定ESC分化状态。整联蛋白和受体酪氨酸激酶(RTK)通过例如G蛋白偶联受体(GPCR)向细胞骨架发信号可导致对细胞的活性，包括细胞形态、迁移、增殖和存活的变化产生不同的影响。整联蛋白与黏着斑(FA)复合体的其它成分一起充当细胞外基质和细胞骨架之间的连接。整联蛋白活化导致黏着斑激酶(FAK)和Src激酶活化，这导致其它FA成分例如桩蛋白和Crk 相关底物P130CAS的磷酸化，以及信号衔接蛋白的募集。这除了 FA动力学和FA周转之外， 还通过肌动蛋白装配实现。RTK以相似的方式利用内在的酪氨酸激酶活性磷酸化它们的细胞内环和/或相关信号成分上的部位。这导致衔接蛋白和调节磷酸肌醇信号下游介导物的信号激酶的募集， 小的GTP酶活化，和MAP激酶级联。GPCR利用异源三聚体G蛋白起始的第二信使欧联至相似的信号机制，影响肌动蛋白动力学行为。细胞对外界信号的细胞内调节通过大量的信号级联发生，包括Iih0家族小的GTP 酶(I h0、Rac和cdc4》和它们的激活剂，鸟苷酸交换因子(GEF)，以及下游蛋白质激酶效应子，包括Mio-激酶/ROCK和p21活化激酶(PAK)。这些级联使调节肌动蛋白细胞骨架行为的蛋白质聚集，包括肌动蛋白相互作用调节性蛋白质例如肌动蛋白丝切蛋白、Arp2/3、Ena/ VASP、成蛋白、肌动蛋白抑制蛋白和凝溶胶蛋白。通过不同途径发信号可导致不同肌动蛋白依赖性结构的形成，它们的协调装配/分解对于定向细胞迁移和其它细胞行为是重要的。 还通过向肌球蛋白发信号调节迁移，这涉及前缘肌动蛋白动力学并能使细胞后部收缩。Rho是小的GTP结合蛋白质，其已经被证明是髓磷脂衍生的生长抑制性信号的中心整合者(McKerracher和Winton，Neuron，36 :345_348，200 。在髓磷脂相关抑制剂(例如MAG或Nogo-Α)缺乏情况下，据信因为Iih0-GDI-诱导的他0活性的阻抑，发生神经生长和再生。在一个非限定性的机制中，髓磷脂相关抑制剂(例如MAG和Nogo-Α)结合NgR，其反过来结合并活化P75。活化的p75使Iih0-GDI远离他0，使得Iih0通过将⑶P换成GTP而变成活化的。然后活化的GTP结合的他0与信号蛋白质例如Mio激酶(ROCK)相互作用抑制轴突生长和再生(综述于 Kaplan 和 Miller，Nat. Neurosci.，6 :435-436,2003 中)。Rho GTP酶家族蛋白，包括I hoA、Racl和Cdc42，控制广泛的细胞过程，例如细胞形态、运动、增殖、分化和凋亡(Hall，1994 ；Van Aelst and D' Souzalchorey，1997)。Mio相关的形成卷曲螺旋的蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(ROCK)家族成员是Ras相关小 GTP 酶 Rho 的效应子。ROCK 家族包括 ρ 160R0CK (R0CK-1)、R0K α /Rho-激酶/ROCK-II、 蛋白激酶PKN以及citron和citron激酶。ROCK涉及多种疾病和病症，包括高血压、脑血管痉挛、冠状血管痉挛、支气管哮喘、勃起功能障碍、青光眼、血管平滑肌细胞增殖、心肌肥大、 malignoma、缺血/再灌注引起的损伤、内皮功能障碍、克隆病和大肠炎、神经突生长物、雷诺氏病、咽痛、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化和心脏肥大以及血管周纤维化。ROCK的两种同种型包括ROCKl (其还称作ROK- β或pl60R0CK)和ROCKII (其还称作ROK-α或他0-激酶)。两种同种型具有65%的总体序列相似性，并且激酶结构域包含 92%的序列同一性。虽然两种同种型在组织中遍在表达，但是它们在某些组织中强度不同。ROCKl是具有kr/Thr蛋白激酶活性的IihoA结合蛋白并且长度为1358个氨基酸。多肽包括在N-末端的催化激酶结构域，其长度大约300个氨基酸并且包含Ser/Thr 激酶特征性的保守性模体；激酶结构域还涉及与ROCK活性负调节物MioE结合。此外， ROCKl的C-末端具有数个功能结构域，包括易弯曲的卷曲螺旋区域内的他0-结合结构域、 pleckstrin同源(PH)结构域和半胱氨酸丰富结构域。在一些实施方案中，PH结构域对于通过与脂质信使例如花生四烯酸的调节可能是必需的。当ROCK的羧基末端与激酶结构域相互作用时降低激酶活性，从而证明了 ROCK具有自身抑制活性。长度大约80个氨基酸并且对于与活化的MioA相互作用所需的Mio-结合结构域与一些Mio结合蛋白质中存在的结构域具有相当大的序列相似性。示例性的ROCK抑制剂包括Y-27632和法舒地尔，它们结合激酶结构域以ATP竞争性机制抑制ROCK的酶活性。ROCK活化的负调节物包括小的GTP结合蛋白质例如Gem、 RhoE和I ad，它们可以减弱ROCK活性。还可以使用H-1152 二盐酸盐(H-1152P-2HC1 ； (S) - (+) -2-甲基-1- [ (4-甲基-5-异喹啉)磺酰]高哌嗪)。另外的ROCK抑制剂包括国际申请公布号W0 01/56988 ；WO 02/100833 ；WO 03/059913 ；WO 02/076976 ；WO 04/029045 ；WO 03/064397 ；WO 04/039796 ；WO 05/003101 ；WO 02/085909 ；WO 03/082808 ；WO 03/080610 ； WO 04/112719 ；WO 03/062225 ；和WO 03/062227中描述的那些。在这些例子中的一些例子中，抑制剂中的模体包括吲唑核；2-氨基吡啶/嘧啶核；9-脱氮鸟嘌呤衍生物；含苯甲酰胺；含氨基呋咱；和/或其组合。例如，WO 03/080610涉及作为激酶抑制剂例如ROCK抑制剂的咪唑并吡啶衍生物以及用于抑制ROCKl和/或R0CK2效应的方法。上面所引用申请的公开通过参考并入本文。Rho的另一抑制剂是S-法呢基硫代水杨酸(FTQ及其衍生物和类似物。另一抑制剂是包含咪唑的苯二氮革和类似物(见例如WO 97/30992)。Iiho抑制剂还可以通过与 ROCKO^ho活化激酶)相互作用作用于下游，导致他0抑制。此类抑制剂描述于美国专利号 6，642J63中(其公开全文通过参考并入本文)。可以使用的其它Mio抑制剂描述于美国专利号6，642，263和6，451，825中。此类抑制剂可以使用常规细胞筛选测定法鉴定，例如描述于美国专利号6，620，591(它们全文通过参考并入本文)中的方法。在本公开的特定实施方案中，靶向R0CK1，而不是ROCK 2，其中试剂结合变构部位导致抑制ROCKl。由于只有活性形式的Iih0 GTP酶可以通过结合特异的效应蛋白质(对于Mio信号传导途径为Mio激酶和Diaphanous的哺乳动物同系物mDia)而将信号传导至下游途径，所以认为它们是时空性整合肌动蛋白细胞骨架和分子马达成为高等亚细胞结构特定构象的分子开关(图1)。虽然已经在许多不同细胞类型中广泛研究了 Mio家族蛋白质对于多方面生物学功能的重要作用，但是在本文描述它们对于干细胞调节的作用的研究。研究表明，他0 GTP酶对于控制成年皮肤、造血和间质干细胞中的干细胞功能起着关键的作用。本公开证明，ESC利用他0信号传导途径控制细胞-细胞完整性同时维持多能性。本公开证明，抑制ROCK导致干细胞(例如人胚胎干细胞-hESC和诱导的干细胞) 具有不需要任何包被例如细胞外基质而在塑料培养皿上生长的能力。此外，本公开证明，抑制肌球蛋白I I的活性还调节干细胞(例如hES和hiPS)生长和维持多能性的能力(对于所述途径的示意图见例如图5)。在一个实施方案中，提供包含肌球蛋白II抑制剂的培养基。在另一实施方案中， 提供包含ROCK抑制剂、肌球蛋白II抑制剂或其组合的培养基。培养基用于在饲养层或细胞外基质包被组织培养材料缺乏下培养干细胞，包括hESC和hiPS细胞。在另一实施方案中，培养基用于在聚-D-赖氨酸包被的组织培养材料上培养干细胞。在又一实施方案中，培养基除了包含ROCK抑制剂、肌球蛋白II抑制剂或其组合外还包含其它成分。例如，培养基可包含氨基酸(例如非必需氨基酸)、抗生素、杀真菌剂、生长因子、LIF、含硫生物活性化合物(例如β-巯基乙醇)、丙酮酸盐(例如丙酮酸钠)、血清 (例如人血清、牛血清)及其任意组合。优选地，任何另外的试剂可以来自与待培养干细胞相同的物种，或者可以化学性合成。在仍然进一步优选的实施方案中，细胞培养基和培养条件缺乏任何动物来源的产物。本公开部分地基于生物学试剂可以用于促进在缺乏动物来源产物情况下培养的干细胞的增殖和强壮的发现。此外，本公开基于本公开的生物学试剂还促进在饲养层缺乏下的干细胞培养物生长、复制和强壮的发现。培养基可以是基本上无血清的，并且不需要使用饲养细胞层或者来自分开培养的饲养细胞的条件培养基，虽然在一些实施方案中，其可以用于在对于连续传代(例如1-50代或更多代)的将细胞转移至新鲜的、无饲养层培养基之前的包括异基因饲养细胞(或者来自此类细胞的条件培养基)的生长环境中最初培养干细胞。根据本公开的培养基包含肌球蛋白II抑制剂、ROCK抑制剂或其组合。培养基还可包括但不限于非必需氨基酸、抗氧化剂、还原剂、生长因子和丙酮酸盐。基础培养基可以是例如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、DMEM/F_12或K0-DMEM，每一种添加有L-谷氨酰胺(例如包括二肽L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Invitrogen))、非必需氨基酸和β -巯基乙醇。培养基有代表性地在加入至细胞培养物中之前已经灭菌(例如通过过滤)。培养基还可以补加有抗生素和杀真菌剂。示例性的肌球蛋白II抑制剂包括肌球蛋白II马达活性抑制剂(同义词1-苯基-1，2，3，4-四氢-4-羟基吡咯并[2. 3-b]-7-甲基喹啉_4_酮；C18H16N2O2)和具有通式I
的类似物
1权利要求
1.组合物，包含基础培养基和肌球蛋白II抑制剂。
2.权利要求1的组合物，还包含结合并抑制RHO的激酶结构域的ROCK抑制剂。
3.权利要求1的组合物，其中肌球蛋白II抑制剂是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。
4.权利要求1的组合物，还包含血清。
5.权利要求4的组合物，其中血清与待培养的细胞是异体的。
6.权利要求4的组合物，其中血清与待培养的细胞是自体的。
7.权利要求1的组合物，还包含氨基酸。
8.权利要求7的组合物，其中氨基酸是非必需氨基酸。
9.权利要求1的组合物，还包含还原剂。
10.权利要求9的组合物，其中还原剂是β-巯基乙醇。
11.权利要求1的组合物，还包含抗生素和/或杀真菌剂。
12.权利要求1的组合物，还包含丙酮酸盐。
13.权利要求12的组合物，其中丙酮酸盐是丙酮酸钠或丙酮酸钾。
14.权利要求1的组合物，还包含LIF。
15.权利要求1的组合物，还包含L-谷氨酰胺。
16.组合物，包含补加有非必需氨基酸、抗氧化剂、还原剂、生长因子、丙酮酸盐和肌球蛋白II抑制剂的基础培养基。
17.权利要求16的组合物，其中基础培养基是DMEM。
18.试剂盒，包含聚-D-赖氨酸、确定成分培养基和肌球蛋白II抑制剂。
19.权利要求18的试剂盒，还包含组织培养基底。
20.权利要求18的试剂盒，还包含含有生长因子的添加物。
21.权利要求18的试剂盒，其中确定成分培养基是无血清的并且包含重组bFGF、重组 TGF β，具有大约330-350m0sm的容量克分子渗透压浓度和7. 25至7. 45的pH。
22.权利要求18的试剂盒，其中肌球蛋白II抑制剂是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。
23.培养干细胞的方法，包括将干细胞悬浮于包含肌球蛋白II抑制剂的培养基中；和在聚-D-赖氨酸包被的组织培养基底存在下培养干细胞。
24.权利要求23的方法，其中培养基是确定成分培养基。
25.权利要求对的方法，其中确定成分培养基是无血清的。
26.权利要求25的方法，还包含重组bFGF、重组TGFβ、大约330-350m0sm的容量克分子渗透压浓度和7. 25至7. 45的pH。
27.干细胞培养物，包含在权利要求1的组合物中的干细胞。
28.权利要求23的干细胞培养物，其中干细胞在聚-D-赖氨酸存在下培养。
29.权利要求27的干细胞培养物，其中肌球蛋白II抑制剂是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。
30.试剂盒，包含权利要求1或16的组合物。
31.试剂盒，包含区室化的肌球蛋白II抑制剂，所述区室化的肌球蛋白II抑制剂将添加至基础培养基或者确定成分培养基中。
32.培养干细胞的方法，包括在饲养层缺乏情况下将干细胞与权利要求1或16的组合物接触，其中干细胞生长和增殖。
33.组合物，包含含有重组bFGF、重组TGFii的确定成分培养基，其中组合物是无血清的并且包含肌球蛋白II抑制剂。
34.权利要求33的组合物，其中确定成分培养基具有大约330-350m0sm的容量克分子渗透压浓度和7. 25至7. 45的pH。
35.在包含聚-D-赖氨酸基底的无动物培养基中和促进干细胞增殖和生长的培养基中培养干细胞的方法，其中培养基包含无动物成分和肌球蛋白II抑制剂、ROCK抑制剂或其组合。
全文摘要
本公开提供用于培养干细胞，包括胚胎干细胞、成体干细胞和胚胎生殖细胞的方法和组合物。
文档编号C12N5/0735GK102395672SQ201080016516
公开日2012年3月28日 申请日期2010年4月13日 优先权日2009年4月13日
发明者佐藤升 申请人:加利福尼亚大学董事会