培养多能干细胞的制作方法

培养多能干细胞的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于培养和维持处于未分化状态的多能干细胞的方法。所述方法包括将所述多能干细胞培养在包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂、AMPK和/或BMP信号转导的双重抑制剂以及LIF的培养基中。还提供了一种通过所述方法产生的细胞、用于执行所述的方法的细胞培养基和试剂盒。
【专利说明】
培养多能干细胞
技术领域
[0001] 本发明涉及干细胞。具体来说，本发明涉及一种用于培养和维持处于未分化状态 的多能干细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 胚胎干细胞(ESC)源自于胚泡的内细胞团（ICM) ASC能够分化成三个胚层并且潜 在地分化成成人身体的所有细胞。
[0003] 这种多能特征使得它们在再生医学领域中是所合乎需要的并且为剖析早期胚胎 发育提供了一种宝贵的工具。尽管ESC与内细胞团的多能外胚层细胞共有这种特性，但是已 经观测到差异。
[0004] 虽然具有非常类似于体内发育的人类胚胎干细胞(hESC)状态将大有益处，但是尚 不清楚的是，hESC的体外培养条件在模拟其中多能性仅短暂存在的胚泡的环境方面受限到 什么程度。
[0005] 在小鼠中，已经报道了多种细胞类型满足多能性的要求并且这些不同的细胞匹配 不同的胚胎发育阶段。
[0006] 不同多能状态由因子所介导的分离也已经被成功地应用于人类细胞，这证实了在 原则上在多种多能细胞类型之间相互转化的可行性。
[0007] 为了获得更类似于天然多能外胚层的hESC，无转基因的方法将是有利的。
[0008] 因此，本发明的目的在于提供和维持如下的多能干细胞状态，所述多能干细胞状 态修正了现有技术的缺点并且更有效地分化。

【发明内容】

[0009] 在第一个方面，提供了一种用于培养和维持处于未分化状态的多能干细胞的方 法，所述方法包括将所述多能干细胞培养在包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂、AMPK和/或BMP信 号转导的双重抑制剂以及LIF的培养基中。
[0010] 在第二个方面，提供了一种多能干细胞，所述多能干细胞是通过如本文所述的方 法而产生的。
[0011] 在第三个方面，提供了一种用于由多能干细胞产生谱系特异性细胞的方法，所述 方法包括:a)根据本文所述的方法培养处于未分化状态的多能干细胞;b)分离未分化的所 述多能干细胞；以及c)将所述分离的未分化的多能干细胞培养在适合于使所述分离的多能 干细胞分化成谱系特异性细胞的培养基中。
[0012] 在第四个方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒在用于如本文所述的方法中时用 于培养和维持处于未分化状态的多能干细胞，所述试剂盒包括如所述的培养基和使用说明 书。
[0013] 定义
[0014] 如本文所用的短语"培养基"指的是用于支持干细胞和细胞谱系中的任一种生长 的液体物质。根据一些实施方案，由本发明所使用的培养基可以是基于水的培养基，所述培 养基可以包含诸如盐、营养素、矿物质、维生素、氨基酸、核酸、蛋白质之类的物质的组合，所 述蛋白质诸如细胞因子、生长因子以及激素。
[0015] 如本文所用的术语"饲养细胞"指的是在将干细胞在饲养细胞上共培养时或在将 多能干细胞在由饲养细胞产生的条件培养基存在下培养在基质（例如细胞外基质、合成基 质）上时维持所述干细胞处于增殖状态的饲养细胞(例如成纤维细胞）。所述饲养细胞的支 持取决于在处于培养中时饲养细胞的结构(例如通过将饲养细胞培养在组织培养板中所形 成的三维基质）、饲养细胞的功能(例如饲养细胞分泌的生长因子、营养素以及激素、饲养细 胞的生长速率、饲养细胞在衰老之前的扩增能力)和/或干细胞对一个或多个饲养细胞层的 附着。
[0016] 如本文所用的术语"层粘连蛋白"指的是通常参与细胞外基质的形成和维持的糖 蛋白家族中的任一种。层粘连蛋白是由a链、M连、以及Y链形成的异三聚体。在本公开的一 些方面，可以使用各种层粘连蛋白的片段、衍生物或类似物，如具有与层粘连蛋白al链至少 基本上同源的至少一部分的层粘连蛋白。
[0017] 如本文所用，如本文所用的术语"胶原"被理解为意指所有胶原类型和任何形式的 胶原，无论是天然与否、去端肽胶原、不溶性胶原、胶原纤维、可溶性胶原、以及酸溶性胶原。
[0018] 如本文所用的术语"纤维连接蛋白"指的是二硫化物连接的二聚体糖蛋白（它以可 溶性形式存在于血浆和其它体液中，并且以纤维状形式沉积作为疏松结缔组织的细胞外基 质的主要成分）。它由被称作I型、II型以及III型同源物的三种不同的结构基序构成，从而 产生纤维连接蛋白分子的模块化组织，其中它的多种生物学活性可以各自归因于特定的结 构域。
[0019]如本文所用的术语"蛋白多糖"意指"人类分泌型蛋白多糖"，它可能含有或可能不 含与蛋白多糖的核心蛋白共价结合的糖胺聚糖链。所述术语还意图包括人类分泌型蛋白多 糖的肽片段，其中肽核心蛋白含有少于天然存在数目的氨基酸，如蛋白多糖的保留了生物 学(功能或结构)活性的部分片段。
[0020] 如本文所用的术语"功能的"是以与天然非重组蛋白质相同的方式诱导特定生物 学反应的能力。结构活性的实例是结合也识别天然非重组蛋白质的抗体的能力。所述术语 还用于包括任何肽，所述肽包含天然存在的蛋白质或其类似物连同一个或多个侧接氨基酸 的序列，它们显示出生物学(功能或结构)活性。
[0021] "功能衍生物"指的是与非重组蛋白质或其它生物分子的生物学活性基本上类似 的生物学(功能的或结构的)活性。功能衍生物可能含有或可能不含翻译后修饰。术语"功能 衍生物"意图包括分子的"片段"、"变体"、"类似物"或"化学衍生物"。
[0022] 如本文所用的术语"片段"意图指的是分子的任何变体，如肽核心或肽核心的可能 具有或可能不具功能性的变体。
[0023] 如本文所用的术语"变体"意图指的是在结构和生物学活性上与整个分子或其片 段基本上类似的分子。因此，假如两个分子具有相似的活性，那么即使所述分子中的一个的 组成或二级结构、三级结构或四级结构与另一个中所存在的并不相同或即使氨基酸残基的 序列并不相同，它们仍被认为是变体，如该术语在本文中所使用的那样。
[0024] 如本文所用，分子的"类似物"意图指的是在功能上与整个分子或其片段基本上类 似的分子。如本文所用，当分子含有通常不是所述分子的一部分的另外的化学部分时，它被 认为是另一分子的"化学衍生物"。这些部分可以提高分子的溶解性、吸收性、生物半衰期 等。所述部分可以可选地减小分子的毒性、消除或减弱分子的任何不希望有的副作用等。能 够介导这样的作用的部分公开于Remington's Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科 学》）（1980)中。用于使这样的部分与分子偶联的程序是本领域公知的。
[0025] 如本文所用的术语"巢蛋白"还意图指的是巢蛋白-l(NID-l)。巢蛋白是基底膜除 了诸如IV型胶原、蛋白多糖(硫酸乙酰肝素和糖胺聚糖）、层粘连蛋白以及纤维连接蛋白之 类的其它组分以外的一种组分。
[0026] 如本文所用的"硫酸乙酰肝素"是碳水化合物的糖胺聚糖家族的成员并且在结构 上与肝素非常密切相关。这两者均由可变硫酸化的重复二糖单元组成。
[0027] 如本文所用的术语"生物聚合物"指的是单一生物聚合物或两种或更多种生物聚 合物的混合物。"生物聚合物"用于表示天然聚合物，包括但不限于多糖(纤维素、淀粉等）； 由天然产品和副产品合成的聚合物。
[0028]如本文所用的RNA测序指的是用于确定RNA分子的序列和/或对样品中的RNA分子 的量进行定量的技术。RNA分子包括但不限于总RNA、信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转 运RNA(tRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或RNA片段。
[0029] 如本文所用的实时PCR指的是聚合酶链反应(PCR)技术，所述技术用于监测在反应 期间由PCR测定所发出的信号作为在每一个PCR扩增循环期间（8卩"实时"）扩增子产生的指 标，这与常规的PCR方法相反，在所述常规的PCR方法中，在PCR反应的终点时检测测定信号。
[0030] 如本文所用的"MEK抑制剂"是抑制有丝分裂原激活的蛋白激酶MEK1和/或MEK2的 化学品或药物。
[0031]如本文所用的GSK3抑制剂是抑制糖原合酶激酶3的化学品或药物。
[0032]如本文所用的AMPK抑制剂是抑制5'腺苷一磷酸激活的蛋白激酶的化学品或药物。 [0033]如本文所用的BMP信号转导抑制剂是抑制骨形态发生蛋白（BMP)信号转导的化学 品或药物。
[0034] 如本文所用的"LIF"指的是白血病抑制因子。
[0035] 如本文所用的术语"谱系特异性细胞"可以是体细胞或细胞器。在另一个实施方案 中，所述谱系特异性细胞可以是内胚层谱系细胞。在另一个实施方案中，所述体细胞可以是 能够自我更新或分化成一个或几个体细胞谱系的定向祖细胞，或完全成熟的体细胞分化的 细胞。
[0036] 本文说明性描述的发明可以在不存在本文没有具体公开的任何一个或多个要素、 一个或多个限制条件的情况下被适当地实施。因此，举例来说，术语"包含"、"包括"、"含有" 等应当被宽泛地并且不加限制地解读。此外，本文所用的术语和表达已经被用作描述性术 语而非限制性术语，并且并不意图在使用这些术语和表达时排除所示的以及所述的特征或 其部分的任何等同方案，但应当认识到的是，各种改动方案在要求保护的本发明的范围内 是可能的。因此，应当了解的是，尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征明确地公开了 本发明，但是本文所公开的发明中所体现的改动方案和变化方案可以由本领域技术人员所 采取，并且这些改动方案和变化方案被认为落入本发明的范围内。
[0037]本发明已经在本文中被宽泛地并且一般性地描述。落入一般性公开内的较缩小内 容和亚类分组中的每一个也形成本发明的一部分。这包括以从所述类中去除任何主题的附 带条件或负面限制条件来一般性地说明本发明，不论所排除的内容是否在本文被具体地叙 述。
[0038] 其它实施方案落入以下权利要求书和非限制性实施例的范围内。此外，在本发明 的特征或方面以马库什组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到的 是，本发明因此同样以马库什组的任何单个成员或成员的亚组来描述。
【附图说明】
[0039] 在结合非限制性实施例和附图考虑时，参考详细说明将更好地理解本发明，在附 图中：
[0040]图1:对于支持人类多能细胞状态的新型培养条件进行的小分子筛选。
[0041] A)用于鉴定支持新型多能细胞状态的培养条件的小分子的列表。示出了化学品的 名称和它们所靶向的对应通路。
[0042] B)经过单个化学品处理的hESC针对多能性标志物NAN0G、0CT4以及TRA-1 -60的染 色。将hESC以1:12的比率接种并且在接种后的48小时之时用单个化学品处理4天。与经过 DMS0处理的对照细胞相比，多能性标志物的水平基本上保持不变。比例尺代表200mi。
[0043] C)在经过单个化学品处理的hESC中多能性标志物的基因表达水平。经过TGFI3抑制 剂R印S0X和A83-01以及GSK30抑制剂BI0处理的hESC显示出NAN0G和P0U5F1的下调。
[0044] D)用于这一研究中的小分子化合物的24种组合。
[0045] E)在用小分子的24种组合处理后hESC集落的形态。比例尺代表200mi。
[0046] F)将细胞用组合22(PD03/BI0/D0R)的单个化学品处理，在饲养细胞上传代培养， 并且在4天后收集以检查多能性标志物表达。经过PD03或D0R处理的细胞的NAN0G和P0U5F1 的表达保持在相当的范围内。在经过B10处理的细胞中NAN0G和P0U5F1下调。还分析了谱系 标志物的表达水平。在经过H)03处理的细胞中PAX6转录物增加，并且经过BI0处理的细胞显 示出T和GATA6的更强上调。所有值均是3次独立实验的平均值土s.d。
[0047] G)在转化期间从3iL hESC培养条件中去除单个小分子或LIF。将hESC用3iL hESC 条件处理，但是没有用3种小分子中的1种或没有用LIF处理。在hESC集落不再能够被维持 时，收集细胞以用于表达分析。将在不存在H)03或LIF的情况下培养的细胞在2次传代后收 集，而将在不存在BI0或D0R的情况下培养的细胞在4次传代后收集。小分子和LIF的去除使 得多能性基因表达降低。经由相对于对照3iL hESC归一化来获得相对表达水平。所有值均 是3次独立实验的平均值±s.d。
[0048] 图2:用小分子处理hESC诱导了新型LIF依赖性hESC状态。
[0049] A)在接种后的48小时之时用小分子的24种不同的组合处理4天的hESC的多能性标 志物NAN0G (顶部）和P0U5F1 (底部）的表达水平。经由相对于经过DMS0处理的对照样品归一 化来获得相对表达。所有值均是3次独立实验的平均值±s.d。
[0050] B)在小鼠成纤维细胞饲养细胞上经过化学品组合21至24处理的hESC的繁殖。只有 经过组合22处理的hESC形成了小的致密的集落。比例尺代表200mi。
[0051 ] C)经过组合22处理的细胞仅在人类LIF存在下增殖。将经过组合22处理的细胞在 存在或不存在LIF的情况下连续传代培养。对于每一代(P1-P3)，将细胞在汇合时固定并且 用hESC特异性表面标志物TRA-1-60染色。比例尺代表200mi。
[0052] D)示出了在3i中在存在或不存在LIF的情况下培养的hESC(Pl-3)的TRA-1-60阳性 集落的数目。所有值均是3次独立实验的平均值±s.d。
[0053] E)3iL hESC和hESC的形态。比例尺代表200wii。
[0054] F)3iL hESC可以单细胞形式被传代培养。将3iL hESC和hESC以单细胞形式以克隆 密度传代培养到96孔培养皿中。经过和没有经过ROCK抑制剂（lyM噻唑维恩(Thiazovivin)) 处理的hESC用作对照。将细胞维持5天，固定并且针对0CT4进行染色。所有值均是3次独立实 验的平均值土s.d。
[0055]图3:3iL hESC的自我更新依赖于LIF信号转导。
[0056] A)将3iL hESC用0.6yM的Jak抑制剂（inh)处理。将对照细胞用DMS0处理。将细胞在 处理10天后固定并且针对多能性标志物NAN0G、0CT4以及TRA-1-60进行染色。
[0057] B)在3iL hESC中在存在和不存在Jak抑制剂的情况下TRA-1-60阳性集落的数目。 所有值均是3次独立实验的平均值± s. d。
[0058] C)在hESC中在存在和不存在Jak抑制剂的情况下多能性基因和LIF信号转导响应 性基因的表达。所有值均是3次独立实验的平均值±s.d。
[0059] D)在hESC中LIF信号转导组分的表达。示出了 STAT3、LIFR、GP130以及看家基因 GATOH的平均Ct值。高Ct值表明GP130在hESC中低表达。所有值均是3次独立实验的平均值土 s ? d〇
[0060] E)在用3 i处理hESC时对GP130表达的诱导。经由相对于经过DMS0处理的对照样品 归一化来获得相对表达水平。所有值均是3次独立实验的平均值±s.d。
[0061 ] F)在3iL hESC和hESC中GP130的相对表达水平。所有值均是3次独立实验的平均值 土 s ? d 〇
[0062] G)与hESC相比，在3iL hESC中GP130蛋白质的上调。使用针对GP130具有特异性的 抗体来检测3iL hESC和hESC的全细胞提取物中GP130的存在。
[0063] H)与经过LIF处理的hESC相比，3iL hESC显示出更高水平的磷酸化STAT3。使用 hESC、在10ng/ml LIF存在下培养的hESC以及3iL hESC的全细胞提取物来确定在各个培养 条件中STAT3磷酸化的水平。GAPDH蛋白质水平用作上样对照。与3iL培养条件相比，LIF的添 加微弱地激活了 STAT3磷酸化。
[0064] I)在用3i、3iL、或LIF处理4天后在hESC中STAT3响应性基因 S0CS3和KLF4的激活。 所有值均是3次独立实验的平均值± s. d。
[0065]图4:对于3iL培养条件来说重要的信号转导通路。
[0066] A)在经过3i处理的hESC中NAN0G表达水平对LIF信号转导有响应。将hESC在存在和 不存在3i的情况下培养，并且用递增量的人类重组LIF处理。在处理5天后，将细胞收集用于 表达分析。与经过DMS0处理的对照hESC相比，多能性基因 NAN0G的水平在3i小分子存在下以 剂量依赖性方式对LIF信号转导有响应。
[0067] B)抑制关键的hESC信号转导通路引起3iL hESC分化。将3iL hESC用抑制TG邱信号 转导通路（A83-01)、FGF信号转导通路（PD173074)、PI3K通路（LY294002)以及EGF通路 (PD15035)的化学品处理。将3iL hESC处理10天并且针对多能性标志物进行染色。与3iL hESC对照相比，在3iL hESC中抑制TGFWI路、FGF通路以及PI3K通路使得多能性标志物 NANOG、0CT4以及TRA-1 -60丧失。比例尺代表200wii。
[0068] C)在经过信号转导通路抑制剂处理的3iL hESC中多能性基因的下调。所有值均是 3次独立实验的平均值土s.d。
[0069]图5:3iL hESC是多能的。
[0070] A)3iL hESC和hESC针对多能性标志物NAN0G和0CT4、以及hESC特异性细胞表面标 志物TRA-1 -60和TRA-1 -81的染色。比例尺:200wii。
[0071] B)在hESC和3iL hESC中多能性相关基因和外胚层基因的相对表达。所有值均是3 次独立实验的平均值土s.d。
[0072] C)hESC和3iL hESC中NAN0G和0CT4的蛋白质水平的蛋白质印迹分析。对应于NAN0G 基因表达水平的提高，与hESC相比，3iL hESC中的NAN0G蛋白质水平更高。
[0073] D)对3iL hESC和hESC中的多能性标志物进行的FACS分析表明3iL hESC表达更高 水平的 NAN0G、TRA-1-60 以及 TRA-1-81。
[0074] E)3iL hESC在悬浮培养中形成类胚体(EB)并且在体外分化成3个胚层和滋养外胚 层。示出了在悬浮液中培养20天的3iL hESC衍生的EB(顶部左图）以及被接种到明胶板上的 类胚体的粘附和扩增（顶部右图）。311 hESC可以分化成外胚层（PAX6)、定形内胚层 (S0X17)、中胚层(GATA4)以及滋养外胚层(p57Kip2)。比例尺:200_。
[0075] F)3iL hESC在被注射到SCID小鼠体内时形成畸胎瘤。示出了含有代表了所有三个 胚胎胚层的组织的畸胎瘤切片。比例尺:50mi。
[0076] G)3iL hESC比hESC更有效地形成畸胎瘤。由3iL hESC形成的畸胎瘤的体积(左图） 以及形成畸胎瘤所花费的平均时间（右图）。示出了对于每一种条件进行的6次重复实验。 [0077] H)在培养2个月后，3iL hESC表现出正常的核型。
[0078]图6:3iL培养条件支持其它hESC细胞系和iPSC的稳定培养。
[0079] A)hES3hESC和hES3衍生的3iL hESC的形态。比例尺代表200wii。
[0080] B)hES3hESC和hES3衍生的3iL hESC针对多能性标志物NAN0G和0CT4、以及细胞表 面标志物TRA-1-60和TRA-1-81的染色。比例尺代表200wii。
[0081 ] C)与hES3hESC相比，hES3衍生的3iL hESC表达更高水平的NAN0G。所有值均是3次 独立实验的平均值土s.d。
[0082] D)hES3衍生的3iL hESC在被注射到SCID小鼠体内时形成畸胎瘤。示出了含有代表 了所有三个胚胎胚层的组织的畸胎瘤切片。比例尺代表50mi。
[0083] E)在培养2个月后，hES3衍生的3iL hESC表现出正常的核型。
[0084] F)在hES3衍生的3iL hESC中外胚层特异性基因（Yan等，2013)的表达。与hESC相 比，在3iL hESC中外胚层特异性基因上调。所有值均是3次独立实验的平均值土s.d。
[0085] G)hES2hESC和hES2衍生的3iL hESC的形态。比例尺代表200wii。
[0086] H)hES2hESC和hES2衍生的3iL hESC针对多能性标志物NAN0G和0CT4、以及细胞表 面标志物TRA-1-60和TRA-1-81的染色。比例尺代表200wii。
[0087] I)与hES2hESC相比，hES2衍生的3iL hESC表达更高水平的NAN0G。所有值均是3次 独立实验的平均值土s.d。
[0088] J)hES2衍生的3iL hESC在被注射到SCID小鼠体内时形成畸胎瘤。示出了含有代表 了所有三个胚胎胚层的组织的畸胎瘤切片。比例尺代表50mi。
[0089] K)在培养2个月后，hES2衍生的3iL hESC表现出正常的核型。
[0090] L)在hES2衍生的3iL hESC中外胚层特异性基因的表达。与hESC相比，在3iL hESC 中外胚层特异性基因上调。所有值均是3次独立实验的平均值±s.d。
[0091 ] M)将人类MRC5成纤维细胞用四种Yamanaka重编程因子(reprogramming factor) (0CT4、S0X2、KLF4以及MYC)和pMX-GFP进行逆转录病毒转导。在3周后，将细胞用标准培养基 或3i+LIF培养基处理。在处理1周后，对TRA-1-60集落的数目进行计数。
[0092] N)3iL处理(参见M)产生更高数目的TRA-1-60阳性集落，这些集落还呈GFP阴性，这 表明在3iL处理后获得了更多的高质量iPSC集落。
[0093] 0)定量PCR数据，所述数据显示在3iL条件中培养的iPSC中病毒转基因更大程度下 调。所有值均是3次独立实验的平均值土 s. d。
[0094] P)在3iL培养条件中6次传代后先前表征的人类iPSC的形态。比例尺代表200mi。 [0095] Q)人类iPSC以及在3iL条件中培养6代的相同细胞针对多能性标志物NAN0G和0CT4 以及细胞表面标志物TRA-1-60和TRA-1-81的染色。比例尺代表200_。
[0096] R)3iL hiPSC中外胚层特异性基因的表达。与iPSC相比，在3iL hiPSC中外胚层特 异性基因上调。所有值均是3次独立实验的平均值±s.d。
[0097]图7:3iL hESC的转录组类似于体内植入前外胚层。
[0098] A)hESC和3iL hESC中熟勵6、1(1^4、18父3、0??厶3以及6厶?011的经过归一化的尺祖-569 读段计数。黑线示出了三次重复实验的平均值，单独的重复实验分别是以灰色阴影示出的 (重叠）。通过每一次重复实验的定位读段的数目对读段计数进行归一化。坐标是关于人类 基因组版本hgl9。
[0099] B) 3 i L特异性基因的表达与植入前胚胎中hESC特异性基因的表达的比较。示出了 来自非配对t检验的检验统计量，正值表明3iL特异性基因显示出比hESC特异性基因高的表 达，而对于负值来说则相反。显著性差异(多重检验调整的P值〈0.05)用*标出。在检验前将 每个样品和基因的数据归一化。
[0100] C)热图，所述热图显示来自植入前胚泡和hESC的在3iL hESC与hESC之间差异性表 达的基因的单细胞基因表达。使用分层聚类对这组基因进行聚类。基因是按照胚泡与hESC 之间平均表达的倍数变化来排序的（黑色到白色的比例尺）。差异性表达的基因（3iL hESC 对比hESC)由黑线标出。
[0101] D)基因集富集分析(GSEA)。基因是根据3iL hESC与hESC之间表达的倍数变化来排 序的。示出了在hESC和人类外胚层中差异性表达的基因的富集。在3iL hESC中显示出增加 的表达的基因被富集在外胚层特异性基因的集合中（虚线，魏氏秩和检验(Wilcoxon rank-sum test)p值=1.03e-48)，而在常规的hESC中显示出增加的表达的基因被富集在与在人 类外胚层中相比在hESC中显示出更高表达的基因的集合中（实线，p值= 1.61e-20)。
[0102] E)在3iL hESC、hESC、人类植入前外胚层（来自单细胞数据的平均值）、第0代hESC (来自单细胞数据的平均值）、第1 〇代hESC (来自单细胞数据的平均值）中hESC特异性基因和 3iL hESC特异性基因的经过归一化的表达。使用配对t检验计算p值。基因的数目对应于在 3iL hESC和hESC中差异性表达并且其中表达先前已被提供的基因。
[0103] F)对与在hESC中相比在3iL hESC中上调的外胚层特异性基因的实时qPCR验证。所 有值均是3次独立实验的平均值土 s. d。
[0104] 图8:在3iL培养的hESC中天然外胚层标志物和GATA6的表达。
[0105] A)与在hESC中相比在3iL hESC中显示出增加的表达的基因与和在hESC中相比在 外胚层细胞中显示出增加的表达的基因的重叠。使用费雪精确检验（Fisher's exact test)确定显著性分数。
[0106] B)与在hESC中相比在3iL hESC中显示出减少的表达的基因与和在hESC中相比在 外胚层细胞中显示出增加的表达的基因的重叠。使用费雪精确检验确定显著性分数。
[0107] C)与在hESC中相比在3iL hESC中显示出减少的表达的基因与和在hESC中相比在 外胚层细胞中显示出减少的表达的基因的重叠。使用费雪精确检验确定显著性分数。
[0108] D)与在hESC中相比在3iL hESC中显示出增加的表达的基因与和在hESC中相比在 外胚层细胞中显示出减少的表达的基因的重叠。使用费雪精确检验确定显著性分数。
[0109] E)对hESC和3iL hESC进行的单细胞基因表达分析。在hESC与3iL hESC之间P0U5F1 表达水平是相当的。在3iL hESC中包括NAN0G在内的外胚层基因的表达增加，并且所述数据 揭示了这些基因在3iL hESC中共表达。分化基因在hESC和3iL hESC这两者中以低的并且相 当的水平表达。
[0110] F)GATA6的基因组基因座，示出了在hESC和3iL hESC中经过归一化的RNA-Seq读段 计数。黑线示出了三次生物学重复实验的平均值，单独的重复实验是以灰色阴影示出的（重 叠）。通过每一次重复实验的定位读段的数目对读段计数进行归一化，坐标是关于人类基因 组版本hgl9。
[0111] G)在3iL hESC和hESC中hESC特异性基因的对数转换FPKM值。使用配对魏氏检验来 确定显著性。
[0112] H)对与外胚层、内胚层以及中胚层相关的基因进行的定量PCR验证。所有值均是3 次独立实验的平均值土s.d。
[0113] I)对3iL hESC中GATA6的表达进行的定量PCR验证。所有值均是3次独立实验的平 均值土s.d。
[0114] J)3iL hESC和hESC中GATA6的蛋白质水平。肌动蛋白用作上样对照。
[0115] K)GATA6和NAN0G的免疫荧光共染色证实这2种蛋白质在3iL hESC中共表达。比例 尺代表200wii。
[0116] L)对3iL hESC和hESC中NAN0G和GATA6的共表达进行的FACS分析。仅用二抗对同种 型对照进行染色。
[0117] M)对3iL hESC和hESC中0CT4和GATA6的共表达进行的FACS分析。仅用二抗对同种 型对照进行染色。
[0118] N)对3iL hESC和hESC中TRA-1-60和GATA6的共表达进行的FACS分析。仅用二抗对 同种型对照进行染色。
[0119] 0)3iL hESC和hESC中0CT4和NAN0G的结合谱。通过定位读段的总数对读段计数进 行归一化。
[0120] 图9: 3iL hESC的表观基因组全貌(epigenomic landscape)。
[0121] A)GSEA曲线图，示出了与在hESC中相比在3iL hESC中在启动子处显示出H3K4me3、 H3K27ac以及H3K27me3的增加(虚线）或减少(实线）的基因的富集。将基因按照cuffdiff检 验统计量排序。在3iL hESC中显示出增加的表达的基因被富集在显示出增加的H3K27ac(魏 氏秩和检验P值= 8.83e-263)、增加的H3K4me3(p值= 2.4e-69)以及减少的H3K27me3(p值= 4.90e-92)的基因的集合中。在3iL hESC中显示出减少的表达的基因被富集在显示出减少 的 H3K27ac(p 值〈1.0e-300)、减少的 H3K4me3(p值= 3.38e-193)以及增加的 H3K27me3(p值= 1.44e-12)的基因的集合中。
[0122] B)使用DESeq2估计的差异性表达的基因在启动子处的组蛋白修饰的经过归一化 的读段计数的倍数变化。将基因按照cuffdiff检验统计量排序并且将每个基因归一化。
[0123] C)第0代hESC特异性基因和外胚层特异性基因在启动子(转录起始位点，TSS)处的 组蛋白修饰的经过归一化的读段计数的倍数变化。使用魏氏秩和检验来估计显著性。
[0124] D)在3iL hESC和hESC中H3K4me3、H3K27ac以及H3K27me3的ChIP-Seq谱。突出显示 的区域代表了所观测到的组蛋白甲基化谱中的变化。对于TBX3、ZNF600、KLF5以及H0XB簇， 突出显示的区域标出了3iL hESC中具有增加的H3K27ac和/或减少的H3K27me3的基因座。对 于C19orf66和0LFM2,突出显示的区域标出了3iL hESC中具有减少的H3K27ac和/或增加的 H3K27me3的基因座。通过定位读段的总数对读段计数进行归一化。
[0125]图10:胚泡细胞和hESC中所选择的天然外胚层标志物的表达。
[0126] A)在3iL hESC中显示出增加的H3K27ac的基因（TBX3、KLF5、ZNF600)以及在3iL hESC中显示出增加的H3K27me3的基因（C19orf66和0LFM2)在胚泡、hESC P0以及hESC P10中 的平均FPKM值。
[0127] 图ll:3iL hESC中新型的NAN0G和0CT4结合位点。
[0128] A)与保持不变的NAN0G结合事件相比，3iL特异性NAN0G结合事件距最接近的基因 显著更远。使用魏氏秩和检验来估计显著性。P值=1.19eT 166。
[0129] B)3iL hESC和hESC中0CT4、NAN0G以及STAT3的结合谱。突出显示的区域标出了3iL hESC中具有增加的NAN0G结合的基因座。通过定位读段的总数对读段计数进行归一化。 [0130] 图12:3iL hESC中多能性转录网络的重塑。
[0131] A)GSEA曲线图，示出了显示出附近的NAN0G结合、0CT4结合或p300结合的增加(虚 线)或减少(实线）的基因的富集。将基因按照cuffdiff检验统计量排序。在3iL hESC中显示 出增加的表达的基因被富集在显示出增加的NAN0G结合(魏氏秩和检验p值= 3.97e-38)、 0CT4结合(p值= 4.43e-ll)以及p300结合(p值= 8.81e-24)的基因的集合中。在3iL hESC中 显示出减少的表达的基因被富集在显示出减少的NAN0G结合（p值=7.16e-06)和减少的 0CT4结合(p值=5.5e-08)的基因的集合中。
[0132] B)3iL hESC和hESC中0CT4、NAN0G以及STAT3的结合谱。突出显示的区域标出了3iL hESC中具有增加的0CT4和/或NAN0G的基因座。通过定位读段的总数对读段计数进行归一 化。
[0133] C)3iL hESC中的重新连线的转录回路。3iL诱导的回路包括在3iL hESC中上调并 且在天然外胚层中表达的基因，特别是TBX3、DPPA3、KLF5。由诸如P0U5F1和S0X2的基因组成 的核心多能性回路网络仍是新网络的一部分，从而强调了所述3iL网络是被重新连线，而不 是被替代。STAT3也与所述网络的基因结合(箭头指示了具有显著性分数>150的峰值），这表 明外部信号转导网络潜在地与所述转录网络配合以诱导3iL hESC中的天然外胚层标记。
[0134] D)3iL支持了更类似于天然植入前外胚层状态的LIF依赖性hESC状态。每一个小圆 代表了转录因子或细胞类型特异性因子。圆圈之间的实线或虚线表示在调节不同的多能状 态中这些因子之间的相互作用。从浅到深的灰色梯度代表了3iL hESC和hESC与人类胚泡的 多能外胚层细胞的接近度。
[0135] 图13:诱导3iL hESC中的发育基因增强了3iL hESC分化。
[0136] A)3iL hESC中胚胎外谱系基因的上调。与hESC相比，在3iL hESC中早期滋养母细 胞标志物⑶X2和BMP4以及内胚层标志物GATA4和GATA6的表达上调。所有值均是3次独立实 验的平均值土s.d(n = 3)。
[0137] B)3iL hESC中的中内胚层基因的上调。与hESC相比，在3iL hESC中，中内胚层标志 物T、MIXL1以及E0MES的表达上调。所有值均是3次独立实验的平均值±s.d(n = 3)。
[0138] C)3iL hESC在使用激活素 A和IDE-1处理的情况下有效地沿着内胚层谱系分化。将 3iL hESC和hESC以相似的密度接种在基质胶包被的培养皿上并且用激活素 A和IDE-1处理 以朝向内胚层谱系分化。在处理第5天时将细胞固定并且针对定形内胚层标志物S0X17和 F0XA2进行染色。在3iL hESC样品中检测到S0X17和F0XA2阳性细胞的集群，而在hESC样品中 有很少的细胞针对这些标志物染色呈阳性。
[0139] D)与经过激活素 A和IDE-1处理的hESC样品相比，在3iL hESC样品中内胚层标志物 被更强诱导。与hESC样品相比，在3iL hESC样品中，内胚层标志物S0X17、F0XA2、HNF4A以及 CXCR4的基因表达非常高地上调。所有值均是3次独立实验的平均值土s.d(n = 3)。
[0140] E)3iL hESC和hESC在使用激活素 A/FGF2/BMP4处理的情况下有效地沿着内胚层谱 系分化。将3iL hESC和hESC以相似的密度接种在基质胶包被的培养皿上并且用激活素 A/ FGF2/BMP4处理以朝向内胚层谱系分化。在处理第5天时将细胞固定并且针对定形内胚层标 志物S0X17和F0XA2进行染色。与hESC样品中的细胞相比，3iL hESC样品中有更多的细胞表 达更高水平的F0XA2。
[0141] F)与经过激活素 A/FGF2/BMP4处理的hESC样品相比，在3iL hESC样品中内胚层标 志物被更强诱导。与hESC样品相比，在3iL hESC样品中，内胚层标志物F0XA2、HNF4A以及 CXCR4的基因表达非常高地上调。所有值均是3次独立实验的平均值土s.d(n = 3)。
【具体实施方式】
[0142] 在第一个方面，本发明涉及一种用于培养和维持处于未分化状态的多能干细胞的 方法，所述方法包括将所述多能干细胞培养在包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂、AMPK和/或BMP 信号转导的双重抑制剂以及LIF的培养基中。
[0143] 在一个实施方案中，所述多能干细胞是诱导性多能干细胞。
[0144] 在另一个实施方案中，所述培养基可以是条件培养基。
[0145] 在另一个实施方案中，所述培养基可以包含饲养细胞。在另一个实施方案中，所述 培养基可以不含饲养细胞。
[0146] 可以将所述多能干细胞培养在基质上。所述基质可以是基底膜基质。在一个实施 方案中，所述基质可以是包含以下各项中的一种或多种的细胞外基质：层粘连蛋白、胶原、 明胶、纤维连接蛋白、玻连蛋白、蛋白多糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素、合成生物聚合物或合成 肽。
[0147] 所述多能干细胞可以是胚胎干细胞。所述胚胎干细胞优选地是人类的。然而，将了 解的是，来自其它物种的干细胞可以是合适的。举例来说，鼠类胚胎干细胞或灵长类动物胚 胎干细胞也可以是合适的。
[0148]如本文所述的方法可以包括将处于未分化状态的多能干细胞进一步传代的步骤。 [0149] 所述MEK抑制剂可以选自由以下各项组成的组：曲美替尼（Trame t in ib ) (GSK1120212)、司美替尼（Selumetinib)、比尼替尼（Binimetinib)或 MEK162、PD-0325901、 卡比替尼（Cobimetinib)或 乂1518、(：1-1040、？098059、？0184352、1]0126或来自这些现有化合 物的任何衍生物。
[0150] 所述MEK抑制剂可以处在以下浓度：约0. lyM-5yM、约0.2yM-4yM、约0.3yM-3yM、约 0.4yM-2yM以及约0.5yM- lyM。在一个实施方案中，所述MEK抑制剂可以处在约0.5yM-1 yM的 浓度。
[0151] 所述GSK3 抑制剂可以选自 6-溴靛玉红-3'-E(BI0)、CHIR-99021、SB216763、CHIR-98014、TWS119、頂-12、1-氮杂坎帕罗酮、AR-A014418、SB415286、AZD1080、AZD2858、-S&、 以及这些化合物的任何衍生物。
[0152] 所述GSK3抑制剂可以处在以下浓度:约0.5yM-5yM、约0.75yM-4yM、约0.8yM-3yM、 约0.85yM-2yM、约0.9yM-2yM、约0.95yM-2yM、约 lyM-2yM以及约 1.5yM-2yM。在一个实施方案 中，所述GSK3抑制剂可以处在约lyM-2yM的浓度。
[0153] 所述BMP4信号转导和AMPK抑制剂可以选自6-[4-(2_哌啶-1-基乙氧基）苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[1，5-a]嘧啶（多索摩芬（Dorsomorphin))、LDN-193189、LDN212854、 K02288、A-769662、阿卡地新（Acadesine)、苯乙双胍(Phenformin)以及来自这些化合物的 任何衍生物。
[0154] 所述BMP4信号转导和AMPK抑制剂可以处在以下浓度：约0.5yM、约1 yM、约1.2 5yM、 约1.5yM、约1.75yM以及约2yM。在一个实施方案中，所述AMPK抑制剂可以处在约2yM的浓度。
[0155] 所述LIF可以处在以下浓度：约 lng/ml_20ng/ml、约2ng/ml_20ng/ml、约2ng/ml_ 18ng/ml、约3ng/ml_16ng/ml、约4ng/ml_14ng/ml、约5ng/ml_12ng/ml、约6ng/ml_10ng/ml、 约7ng/ml-10ng/ml、约8ng/ml-10ng/ml。在一个实施方案中，所述LIF可以处在约8ng/ml_ 10ng/ml的浓度。
[0156] 包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂、AMPK和/或BMP信号转导的双重抑制剂以及LIF的培 养基可以进一步包含表观遗传修饰剂，例如表观遗传抑制剂。表观遗传抑制剂包括但不限 于DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂，例如1^108、81乂、0似￡?、丙戊 酸、丁酸钠以及5-氮杂-2 脱氧胞苷。
[0157] 在另一个方面，提供了一种多能干细胞，所述多能干细胞是通过如本文所述的方 法而产生的。通过如本文所述的方法所产生的多能干细胞可以表达选自由以下各项组成的 组的至少一种多能性标志物：NAN0G、TRA-1-60、0CT4、TRA-1-81、S0X2、LIN28、PRDM14&& ZFP42。在另一个实施方案中，本文所述的多能干细胞可以表达选自由以下各项组成的组的 至少一种外胚层样基因表达标志物：DPPA3、KLF4、KLF5、TBX3、DM1T3L、AHNAK、ARRB1、 CLEC4D、GGT5、IL6R、UMCH1、MFAP3L、SLC25A16、SMYD2、S0AT1 以及ZNF600。
[0158] 在另一个实施方案中，如本文所述的多能干细胞可以表达选自由以下各项组成的 组的至少一种胚胎外标志物:CDX2、BMP4、GATA4以及GATA6。
[0159] 在另一个实施方案中，本文所述的多能干细胞可以表达选自T、E0MES或MIXL1的至 少一种中内胚层标志物。
[0160]如本文所述的多能干细胞可以包含相对于没有根据本文所述的方法培养的细胞 增加的表达水平的至少一种标志物。
[0161 ] 可以通过RNA测序或实时PCR来确定所述至少一种标志物的表达水平。
[0162] 在一个实施方案中，所述至少一种标志物的表达水平相对于没有根据如本文所述 的方法培养的细胞可以增加至少1.5倍至5倍。
[0163] 在一个实施方案中，所述至少一种标志物是NAN0G并且相对于没有根据如本文所 述的方法培养的细胞，所述表达水平可以增加1.5倍至2倍。
[0164] 在一个实施方案中，相对于没有根据如本文所述的方法培养的细胞的分化，如本 文所述的多能干细胞向内胚层细胞、神经元细胞或中胚层细胞的分化增强。
[0165] 在另一个方面，还提供了一种用于培养和维持处于未分化状态的多能干细胞的培 养基，其中所述培养基包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂、AMPK抑制剂以及LIF。
[0166] 在另一个方面，还提供了一种用于由多能干细胞产生谱系特异性细胞的方法，所 述方法包括:a)根据如本文所述的方法培养处于未分化状态的多能干细胞;b)分离所述未 分化的多能干细胞；以及c)将所述分离的未分化的多能干细胞培养在适合于使所述分离的 多能干细胞分化成谱系特异性细胞的培养基中。
[0167] 在一个实施方案中，所述谱系特异性细胞可以是体细胞或细胞器。在另一个实施 方案中，所述谱系特异性细胞可以是内胚层谱系细胞。
[0168] 在另一个实施方案中，所述体细胞可以是能够自我更新或分化成一个或几个体细 胞谱系的定向祖细胞，或完全成熟的体细胞分化的细胞。
[0169] 在另一个方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒在用于如本文所述的方法中时用 于培养和维持处于未分化状态的多能干细胞，所述试剂盒包括如本文所述的培养基和使用 说明书。
[0170] 实验部分
[0171] 材料和方法 [0172]细胞培养
[0173] 将hESC细胞系HI (WA-01，第28代）用于这一研究。对于hESC在TeSRl (干细胞技术公 司（Stem cell technologies))中的常规培养，将细胞在无饲养细胞的情况下培养在基质 胶(碧迪公司（BD))上。每天更换细胞培养基。每5天-7天将hESC用lmg/ml分散酶(干细胞技 术公司）传代培养。3iL hESC培养基在TeSRl中含有lyM的H)0325901 (西格玛公司（Sigma))、 2iiM的BIO(西格玛公司）、2iiM的多索摩芬（西格玛公司）以及10ng/ml的人类LIF(密理博公司 (Millipore))。将3iL培养基新鲜制备并且在4°C储存不超过2周。对于用3iL条件进行处理， 在接种后的48小时之时将培养在TeSRl中的hESC用3iL处理。随后将细胞在丝裂霉素 C灭活 的小鼠成纤维细胞上传代培养。使用TrypLE(生命科技公司（Life Technologies))将细胞 游离成单细胞。每天补充3iL培养基并且将细胞在汇合时传代培养。以liiM的最终浓度添加 ROCK抑制剂噻唑维恩以提高前几次传代的细胞存活率。已经将用于所有实验中的3iL hESC 培养了至少10代以充分适应于新的培养条件。
[0174] 小分子化合物处理
[0175] 在接种后的48小时之时将hESC用分散酶游离并且开始处理。对于单一化学品和组 合化学品处理，以如下最终浓度使用小分子:0.5yM A83-01 (Stemgent公司）、2yM BI0(西格 玛公司）、3yM (：1111?99021(3丨611^61^公司）、2_多索摩芬（西格玛公司）、8_佛司可林 (Forskolin) (Stemgent公司）、2yM IDE-1 (Stemgent公司）、0 ? 5yM PD153035(西格玛公司）、 1福PD173074(西格玛公司）、1虚ro〇325901(西格玛公司）、5虚皮斐松-a(Pifithrin-a) (西格玛公司）以及lyM RepSox(西格玛公司）。将所有小分子在DMS0中复水。对于PI3K通路 抑制，以10yM的最终浓度使用LY294002(西格玛公司）。
[0176] RNA提取、逆转录、定量实时PCR以及RNA测序(RNA-Seq)准备
[0177] 对于表达分析，使用TRIzol试剂（英杰公司（Invitrogen))以氯仿提取总RNA并且 用异丙醇使其沉淀。在4 °C将沉淀的RNA以13000rpm离心10分钟。将RNA沉淀物用70 %乙醇洗 涤并且随后用DEPC处理过的水(AMBI0N公司）复水。在37°C将DNA污染物用DNA酶KAmbion公 司）消化30分钟。在70°C使DNA酶I热失活10分钟。用NanoDrop 2000(赛默科技公司（Thermo Scientific))测定RNA浓度。使用500ng RNA来使用Superscript II试剂盒(英杰公司）进行 每一次逆转录反应以产生用于后续定量测定的cDNA。用SYBR绿色主混合物(KAPA公司），使 用ABI PRISM 7900序列检测系统进行定量实时PCR(qPCR)分析。对于RNA-Seq文库制备，将 总RNA通过柱(Pure 1 ink RNA小型试剂盒，Ambi on公司）进一步纯化。根据制造商的说明书 (TruSeq RNA样品制备试剂盒v2，Illumina公司）使用4yg的总RNA制备RNA-Seq文库。简单地 说，利用以聚T寡核苷酸附接的磁珠进行两轮纯化来获得mRNA。然后将mRNA片段化并且进行 第一链和第二链cDNA合成，然后进行末端修复、腺苷酸化、适体连接并且最终进行15个循环 的PCR。将样品多重化并且测序(单一读段76bp) (HiSeq 2000，Illumina公司）。
[0178]染色质免疫沉淀
[0179] 如先前所述进行染色质免疫沉淀(〇11?)(1^^3〇1^-如18；[118等，2013)。简单地说， 在室温将细胞用1%甲醛固定10分钟，并且通过添加甘氨酸达到0.2M的最终浓度以使甲醛 失活。将细胞裂解物超声处理并且在4°C使用蛋白G Dynal磁珠使染色质提取物进行免疫沉 淀过夜，所述磁珠已经与针对以下各项的抗体偶联:0(^4(艾博抗公司（&1303111)31319857)、 Nanog(R&D公司AF1997)、STAT3(细胞信号转导公司（Cell Signaling)9145)、p300(圣克鲁 斯公司（Santa cruz)sc585)、H3K4me3(密理博公司04-745)、H3K27ac(艾博抗公司ab4729) 或H3K27me3(密理博公司07-449)。使用NEBNext⑧ChIP-Seq文库试剂盒(NEB Biolabs公 司）根据制造商的说明书来制备染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq)文库并且用HiSeq 2000系 统（11 lumina公司）对其进行测序。
[0180] 单细胞基因表达分析
[0181] 在Biomark系统高级开发方案（Biomark System Advanced Development Protocol)41上在单细胞基因表达后使用具有低R0X的SsoFast EvaGreen超混合液收集单 细胞基因表达数据。简单地说，直接将hESC和用3iL培养的hESC用BD FACSAria 11(碧迪生 物科技公司）分选到加有逆转录特异性靶标扩增溶液(生命科技公司）的96孔PCR板中。进行 逆转录、20个循环的预扩增以及核酸外切酶1(NEB公司）处理，之后将预扩增的产物进行7倍 稀释。在Biomark系统（Fluidigm公司）上使用48 X 48动态阵列以具有低R0X的2 X SsoFast EvaGreen超混合液（伯乐公司（Bio-Rad))和各个qPCR引物分析扩增的单细胞样品。使用 BioMark实时PCR分析软件(Fluidigm公司）计算阈值交叉(Ct)值。
[0182] 体外分化
[0183] 对于经由类胚体形成进行的自发分化，将3iL hESC通过TrypLE游离并且悬浮培养 在低吸附10cm培养皿中。在2周-3周后，将类胚体转移到明胶包被的板中并且再培养6天。对 于生长因子诱导的分化，将细胞接种到基质胶上并且用对应的培养基处理以沿着不同的谱 系分化:对于定形内胚层分化，是于含有2%FBS(GIBCO公司）的高级RPMI培养基(GIBCO公 司）中的100ng/ml激活素 A;对于中胚层分化，是于含有20%KSR(GIBC0公司）的F12DMEM (GIB⑶公司）中的100ng/ml BMP4和4ng/ml bFGF;对于滋养外胚层分化，是于含有20%KSR (GIBC0公司）的F12 DMEM(GIBCO公司）中的100ng/ml BMP4和1處PD0325901;以及对于神经 外胚层分化，是于补充有0.5 X N2和B27补充剂的神经基础培养基中的10yM SB431542和2yM 多索摩芬。
[0184] 畸胎瘤形成
[0185] 将在标准培养基中培养的hESC或3iL hESC用TryplE游离并且以1X107个细胞/毫 升的浓度重悬在30%基质胶/F12DMEM(GIBC0公司）中。将Rock抑制剂噻唑维恩(Stemgent公 司）以0.5yM的最终浓度添加到标准培养基中的hESC培养物中。将200yl的细胞悬浮液注射 到用阿佛丁(Avertin)麻醉的SCID小鼠的背侧侧腹中。在6周至8周后形成畸胎瘤并且将它 们通过手术解剖，固定在布安溶液(Bouin's solution)中并且包埋于石錯中。将它们切片 并且用马洛里四色染色(Mallory's Tetrachrome staining)分析。
[0186] 蛋白质印迹分析
[0187] 将hESC用补充有蛋白酶抑制剂混合液（默克公司（Merck))的裂解缓冲液（50mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、10yM ZnCl、0.5%诺乃（Nonidet)P-40、5%甘油）裂解。使 用Bradford测定试剂盒(伯乐公司）测量蛋白质浓度。使50yg的细胞裂解物在10%SDS-聚丙 烯酰胺凝胶上分离并且转移到聚偏二氟乙烯膜(密理博公司）上。将膜用溶解在含有0.1% !^?^1120的?83(0.1%?831')中的5%脱脂奶封闭。在封闭后，分别将印迹与抗0(^4(艾博抗公 司）、抗NAN0G(R&D公司）、GP130 (圣克鲁斯公司）、抗STAT3 (细胞信号转导公司）、抗磷酸化 Tyr705STAT3(细胞信号转导公司）或抗GAPDH(圣克鲁斯公司）一抗孵育过夜，用0.1%roST 洗涤并且与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗兔IgG(圣克鲁斯公司）或HRP缀合的抗山羊IgG (圣克鲁斯公司）一起孵育。在用PBST洗涤后，使用蛋白质印迹鲁米诺(Luminol)试剂(圣克 鲁斯公司)检测信号。
[0188] 免疫荧光染色
[0189] 将hESC或分化培养物用在roS中的4%多聚甲醛固定。在l%Triton X-100/PBS中 透化30分钟后，使用以下一抗进行免疫染色：NAN0G(R&D系统公司）、0CT4(艾博抗公司）、 TRA-1-60(圣克鲁斯公司）、TRA-1-81 (圣克鲁斯公司）、PAX6(科文斯公司（Covance))、GATA4 (圣克鲁斯公司）、S0X17(艾博抗公司）、p57kip2(Neomarkers公司）。所使用的二抗是Alexa Fluor 488/546抗小鼠 IgM、Alexa Fluor 488/546抗山羊IgG以及Alexa Fluor488/546抗小 鼠或抗兔IgG(英杰公司）。使用DAPI或赫斯特(Hoechst)(英杰公司）对核进行染色。
[0190] 对免疫染色的细胞进行的流式细胞术分析
[0191]将在3iL培养基或标准培养基中培养的细胞收集并且在80%乙醇中固定过夜。将 细胞在冰上在200yl的0.5%1>1切1^-100?83溶液中裂解10分钟。在那之后，将细胞在1% BSA中封闭并且在冰上用针对TRA-1-60(圣克鲁斯公司）、TRA-1-81 (圣克鲁斯公司）、NAN0G (R&D公司）或0CT4(艾博抗公司）的抗体染色2小时。在二抗染色之前和之后，将细胞洗涤三 次。使用单独的二抗染色作为同种型对照。在BD LSR II流式细胞仪系统上分析细胞。通过 Flowjo vx分析所收集的数据。
[0192] 核型分析
[0193] 将细胞用秋水仙酰胺处理以使得有丝分裂阻滞并且通过标准低渗处理和甲醇：乙 酸(3:1)固定来收集。通过标准空气干燥法制备载片并且进行G带核型分析。
[0194] 生物信息学分析
[0195] 使用TopHat2 2.0.9版以参数吒2-非常灵敏将1?熟-5叫读段定位到人类基因组集 合hgl9,我们还使用来自Ensembl的具有转录组注释的-GTF选项（GRCh37.69)。使用 cuffdiff 2.1.1版估计差异表达。使用cuffdiff检验统计量将基因排序以进行基因集富集 分析。使用cuff links 2.1 ? 1版以选项-b、一多读段_正确、_g、repeatMasker注释来估计单 个样品的表达数据，这些选项用于屏蔽rRNA、tRNA、snRNA以及srpRNA基因。将来自植入前人 类胚胎的单细胞RNA-Seq表达数据下载，与3iL和Tesr RNA-Seq数据合并，然后进行分位数 归一化。将每一个样品中每一个基因的表达值进一步除以基因表达的总和。使用mul ttest (多重检验)包计算图4B的平均表达的差异，检验统计量来自t检验，p值是经过多重检验校 正的。将图4C中的基因进一步在基因和样品的子集上归一化。为了使特定基因组基因座处 的RNA-Seq数据可视化，通过定位读段的数目对读段进行归一化。
[0196] 使用Bowtie(0.12.5)将ChIP-Seq读段相对于hgl9参考基因组定位，用MACS (1.4.0)进行峰寻找(peak calling)。峰与最接近的TSS有关。在当前注释的所有编码基因 的转录起始位点周围在4kb窗中对读段进行计数(Ensembl 69版，总数：19，978)。在多个TSS 的情况下，仅选择具有PolII ChIP-Seq读段的最大数目的TSS，假定这代表了hESC中对应基 因的主要TSS。使用DESeq2计算组蛋白修饰和转录因子占据的对数倍数变化。使用在3iL hESC与hESC之间具有最强倍数变化的前1000个基因座形成ChIP-Seq数据的GSEA曲线图。在 R中使用标准设置生成箱线图。使用R3.0版和Bioconductor 2.12版进行所有的生物学信息 分析。
[0197] 登录号
[0198] RNA-Seq和ChlP-Seq数据可在ArrayExpress数据库（www .ebi.ac.uk/ arrayexpress)中以登录号E-MTAB-2031 (RNA-Seq)、E-MTAB-2041(组蛋白修饰）、MTAB-2042 (STAT3)以及E-MTAB-2044 (0CT4、NAN0G、p300、输入控制）获得。
[0199] 实施例
[0200] 实施例1
[0201]小分子的组合诱导独特的hESC状态
[0202]为了诱导潜在地更接近体内植入前外胚层状态的替代性hESC状态，使用靶向8个 信号转导通路的11种小分子针对提高NAN0G表达的条件进行筛选(图lAhNANOG在多能外胚 层从植入前胚胎的内细胞团中的内胚层分离中用作确定性标志物。小鼠胚泡中Nanog的水 平在植入期间降低，这表明Nanog水平反映了多能性的不同状态。与hESC相比，在人类天然 植入前外胚层中，NAN0G的表达也是富集的。首先单独地研究这些抑制剂的影响。尽管经过 大部分的小分子处理的细胞针对hESC标志物染色呈阳性，但是它们在它们的形态上没有表 现出变化或没有诱导NAN0G转录物的上调（图1B-C)。因此，然后使用这些分子的组合（图 1D)。与使用单独的分子相反，使用若干种组合进行的处理引起了hESC形态变化和NAN0G的 上调（图2A、图1E)。具体来说，组合21、22、23以及24诱导NAN0G转录物增加1.5倍-2.0倍。在 这些组合中P0U5F1水平基本上保持不变(图2A)，这表明这些细胞仍是多能的。
[0203] 随后，对化学品组合21至24进行研究以确定它们是否可以稳定地维持hESC自我更 新。然而，对于这些条件中的3种观测到增殖方面的强烈受损，因此在第一次传代之后有很 少的集落存活。只有经过组合22(PD03/BI0/D0R，在本文被称为3i)处理的hESC能够在小鼠 成纤维细胞饲养细胞上形成小的致密的集落（图2B)。然而，集落数目在每一次后续传代中 减少，这表明自我更新被破坏（图2C-D)。由于这些细胞的形态类似于小鼠胚胎干细胞 (mESC)，因此研究促进mESC的自我更新的信号转导通路的激活是否可以提高细胞存活率。 LIF信号转导在维持mESC、ICM、以及小鼠多能状态之间的转换方面是一个关键性的信号转 导通路。惊人的是，添加 LIF可以解救3i hESC的受损的自我更新并且使得这些细胞能够稳 定地繁殖多于30代（图2C-D)。与在TeSRl培养基中培养的hESC(在本文被称为hESC)相比，这 些经过3i+LIF处理的hESC(在本文被称为3iL hESC)形成更小并且更致密的集落（图2E)。与 hESC相反，3iL hESC可以在没有添加 ROCK抑制剂的情况下以单细胞形式在传代后继续存活 (图2F)。〗种抑制剂的组合使用对于维持3iL hESC状态来说是重要的，这是因为在从培养基 中去除单个化学品时所述细胞不能被维持（图1G)。综上所述，施用3种抑制剂和LIF使与常 规的hESC不同的hESC能够有效繁殖。
[0204] 实施例2
[0205] 3iL hESC中的活性LIF信号转导
[0206]与不依赖于LIF信号转导的常规hESC相反，LIF对于3iL hESC的自我更新来说似乎 是必要的。为了进一步研究LIF在3iL hESC中的作用，使用靶向LIF信号转导通路的Jak抑制 剂（inh)。用Jak抑制剂处理3iL hESC诱导多能性标志物表达减少以及集落数目强烈减少 (图3A-BKNAN0G以及LIF信号转导响应性基因 KLF4和S0CS的基因表达减少（图3C)。这些结 果进一步表明LIF信号转导是为维持hESC所需的。
[0207] 在hESC中LIF信号转导可以被诱导。然而，与3iL hESC相反，LIF对于hESC自我更新 来说不是必要的。为了研究LIF需求上差异的原因，比较这两种细胞状态中的LIF信号转导 活性。在hESC中，与LIF信号转导通路的其它组分相比，作为对于LIF活性来说必要的共受体 的GP130的转录物低表达（图3D)。将hESC用3i短暂处理以及将hESC在3iL中稳定培养均引起 GP130转录物（图3E-F)和蛋白质水平（图3G)的上调，这表明这些细胞已经变得对LIF信号转 导更敏感。相应地，与单独用LIF培养的hESC相比，在3iL hESC中磷酸化STAT3的水平也显著 更高（图3H)，这表明LIF信号转导在3iL hESC中更具活性。与单独LIF相比，在经过3i+LIF处 理的hESC中，已知的STAT3靶标S0CS3和KLF4的表达水平也提高（图31)。有趣的是，NAN0G表 达水平在添加 LIF的情况下在3i处理下以剂量依赖性方式提高，这表明NAN0G可能是LIF信 号转导的直接靶标（图4A)。这些结果表明虽然3i处理不能维持hESC自我更新，但是它诱导 了对LIF信号转导高度响应的hESC状态。升高的LIF信号转导对于在3i培养条件下维持多能 细胞状态来说变得必要。
[0208]随后，研究在hESC中重要的其它信号转导通路在3iL hESC中是否也起作用。FGF、 PI3K以及激活素信号转导通路已经被报道在维持hESC中起重要作用。将3iL hESC用这三个 信号转导通路以及没有被报道在hESC中起作用的作为阴性对照的EGF信号转导的对应的小 分子抑制剂处理。抑制FGF、PI3K以及激活素信号转导通路在处理10天后使得多能性标志物 丧失（图4B-C)。这一结果表明仍需要其它信号转导通路与LIF信号转导通路结合起作用以 支持独特的3iL hESC状态。
[0209] 实施例3
[0210] 3iL hESC表现出多能性的标志
[0211]以下进行表征以确定这些3iL hESC是否确实是多能的。所述细胞针对多能性标志 物0CT4、NAN0G、TRA-1 -60以及TRA-1 -81染色呈阳性（图5A)。多能性标志物的转录水平在3iL hESC与未处理的hESC之间仍是相当的（图58)。3让hESC维持2倍较高水平的NAN0G表达（图 5B)，这也反映在蛋白质水平上（图5C)。有趣的是，在3iL hESC中观测到包括DPPA3和TBX3在 内的外胚层特异性基因的上调（图5B)。荧光激活细胞分选(FACS)分析揭示3iL hESC明确表 达0CT4,并且具有NAN0G、TRA-1-60以及TRA-1-80水平的显著提高（图叨）。
[0212]随后，研究3iL hESC是否可以分化成所有生殖谱系。3iL hESC形成大的类胚体，所 述类胚体可以分化成胚胎外谱系和所有三个胚层的细胞（图5E)。在体内，3iL hESC在被注 射到免疫缺陷小鼠体内时也产生了所有三个生殖谱系的组织（图5F)。有趣的是，与hESC相 比，3iL hESC在更短的时间内产生了更大体积的畸胎瘤（图5G)。重要的是，在3iL条件中培 养2个月后，3iL hESC维持正常的核型（图5H)。这些结果证实3iL hESC确实是多能的。为了 确认3iL hESC状态不是HlhESC特有的，在两种其它人类hESC细胞系hES2和hES3上测试3i+ LIF小分子组合（图6A-L)。观测到形态、对标志物表达的诱导以及分化成畸胎瘤中的所有3 个胚层的能力方面的可再现的变化。随后对3iL条件进行测试以确定它是否能够维持诱导 性多能干细胞(iPSC)。将细胞在病毒诱导3周后用3iL条件处理。虽然没有观测到iPSC集落 总数的增加（图6M)，但是观测到这些iPSC集落中病毒沉默的显著提高（图6N-0)，这表明真 正的iPSC集落的数目增加。iPSC克隆也可以在3iL条件中被稳定地培养（图6P-R)。这些数据 确认了 3iL对不同的细胞状态的诱导是可以在不同的人类多能细胞当中实现的。
[0213] 实施例4
[0214] 3iL hESC的转录组类似于天然植入前外胚层
[0215] 上述结果表明3iL hESC不同于hESC。为了对这些差异进行表征，使用RNA-Seq比较 3iL hESC和hESC的转录组。首先鉴定出在3iL hESC与hESC之间在表达水平上显示出显著变 化的基因，这些基因进一步被称为3iL hESC特异性基因（在3iL hESC中表达增加)和hESC特 异性基因（在3iL hESC中表达减少）。表1示出了3iL hESC特异性基因的列表。
[0216] 表l:3iL hESC特异性基因。

[0219] 3iL特异性基因中有NANOG、DPPA3、KLF4以及TBX3 (图7A)，这确认了最初的观测结 果。为了研究3iL hESC是否类似于体内多能细胞，将3iL hESC表达数据与来自人类植入前 胚胎和源自于胚泡的原代hESC在第0代和第10代时的单细胞RNA-Seq数据相比较。惊人的 是，发现与hESC特异性基因相比，3iL hESC特异性基因在植入前胚泡细胞中显示出显著更 高的表达（图7B)。相比之下，在来自胚泡的原代hESC生长物中，与3iL hESC特异性基因相 比，hESC特异性基因显示出更高的表达（图7B)。重要的是，3iL hESC特异性基因和hESC特异 性基因的集合足以基于单细胞RNA-Seq数据将hESC与植入前胚泡细胞相区分（图7C)。所表 征的胚泡的ICM由多能外胚层(EPI)的细胞和原始内胚层(PE)的细胞组成。由于胚泡的外胚 层细胞受到特别的关注，因此在3iL hESC中评估推定的EPI特异性基因的表达。与在hESC中 相比在EPI细胞中以更高的水平表达的基因（外胚层特异性基因）在3iL hESC中是显著富集 的（图7D-E、图8A-D)。通过定量PCR进一步确认了在3iL hESC中这些外胚层特异性基因的表 达增加（图7F)。单细胞PCR数据确认了多能性基因和外胚层基因确实是共表达的并且不是 异质细胞群体的结果（图8E)。因此，3iL处理诱导了 hESC朝向更接近地类似于来自人类植入 前胚胎的多能细胞的细胞状态转化。
[0220] 实施例5
[0221] 3iL hESC中GATA6和NAN0G的共表达
[0222] 在胚泡和3iL hESC中表达但是在常规的hESC中不表达的基因之一是GATA6(图 SFhGATAe已经被报道能够在重编程期间替代0CT4并且在早期植入前胚胎中表达。由于 GATA6也牵涉到原始内胚层和中胚层分化，因此我们希望排除GATA6表达由自发分化所引起 的可能性。对多能性相关基因的表达进行的检验表明这些基因在3iL hESC和hESC中显示出 相似的表达水平（图8G)。通过定量PCR进行的验证也确认了分化相关基因在3iL hESC中没 有上调（图8H)。用定量PCR进一步确认3iL hESC中GATA6的表达并且用蛋白质印迹分析进一 步确认蛋白质水平（图81-JhGATAe和NAN0G的共免疫染色揭示了这2种蛋白质在3iL hESC 中共表达（图8K)。为了进一步确认这一结果，进行流式细胞术分析并且发现显著多于50% 的3iL hESC表达NAN0G和GATA6这两者，相比之下，hESC中少于5 %表达这两者（图8L)。GATA6 也与0CT4和TRA-1-60共表达（图8M-N)。这些结果表明GATA6的表达不是由分化或多能性的 丧失所引起的，而是反映了3iL hESC的特定特性。NAN0G和GATA6在多能外胚层从内胚层分 离之前在胚泡的ICM内的细胞中共表达。所述结果表明3iL hESC潜在地类似于这些共表达 NAN0G和GATA6的细胞。因而，3iL hESC可以提供模型来研究GATA6和其它早期胚胎发育基因 在多能性中的作用。
[0223] 实施例6
[0224] 在3iL hESC中植入前外胚层相关基因的去阻遏
[0225] 为了研究3iL hESC的基因表达谱是否由表观遗传全貌中随之而来的变化而稳定 化，产生与活性染色质(H3K27ac、H3K4me3)和阻遏性染色质(H3K27me3)相关的组蛋白修饰 的全基因组谱。对于每一个基因，计算3iL hESC与hESC之间对应的组蛋白标记的经过归一 化的倍数变化。实际上，发现基因表达的变化反映在启动子处组蛋白修饰的整体变化（图 9A-B)。在3iL hESC中显示出增加的表达的基因被显著富集在显示出活性组蛋白修饰 H3K27ac (p值=8 ? 83e-263)和H3K4me3 (p值=2 ? 38e-69)的增加以及H3K27me3 (p值=4 ? 90e-92)的减少的基因的集合中，所述H3K27me3是通常与发育基因相关的阻遏性标记（图9B)。惊 人的是，在研究在天然植入前外胚层和体外hESC中差异性表达的基因的启动子时，发现在 外胚层特异性基因处出现H3K27me3的丧失（图9C)。因此，在hESC从胚泡衍生期间沉默的基 因，如TBX3、KLF5、ZNF600以及HOXB簇（图9D、图10)在3iL hESC中显示出重新激活。这些数据 共同表明3iL hESC以不同的状态存在，所述不同的状态提供了一种独特的模型以研究植入 前胚胎发生的表观遗传学。
[0226] 实施例7
[0227] 3iL hESC中的重新连线的调节回路
[0228]控制多能性的基因调节网络已经在ESC中被研究并且提供了对胚胎干细胞特征的 调节的基本了解。对基因表达和表观遗传修饰进行的这些分析表明3iL hESC代表了 一种与 常规的hESC不同的多能状态。为了研究在这两种细胞状态之间转录调节网络是否发生改 变，产生主多能性调节因子NAN0G和0CT4以及通用增强子结合蛋白P300的全基因组结合图 谱。对于0CT4、NAN0G以及P300的每一个结合位点，计算3iL hESC与常规的hESC之间的差异 结合以鉴定3iL特异性结合事件和hESC特异性结合事件。惊人的是，发现在这两种多能状态 之间数千个结合事件发生变化，这表明调节网络实际上是重新连线的（图11A、图12A、B以及 C)。在支持重新连线的网络下，发现转录因子差异结合与它们的靶基因的差异表达显著相 关(图12A)。
[0229]由于3iL hESC显示出在常规的hESC中沉默的外胚层特异性基因的表观遗传和转 录重新激活，因此研究3iL hESC是否可以用于鉴定在人类植入前发育中潜在地具有活性的 新型增强子。实际上，发现在远端增强子处NAN0G占据的增加与外胚层特异性基因的上调显 著相关（图12B)(费雪检验p值= 5.46e-13,图12B、C)。在天然植入前外胚层中表达并且在 3iL hESC中显示出新的或增强的结合位点的基因包括NAN0G、KLF4、DPPA3、KLF5、DMMT3L、 TBX3、ZNF600以及LAMB1 (图12B、C、图11B)。有趣的是，在这些基因中的一些附近检测到 STAT3结合（图12B、C)，这表明LIF信号转导潜在地与3iL细胞中的核心多能性网络整合（图 12B、C)。
[0230] 在这一研究中，证实用3种小分子进行的组合处理成功地诱导了不同的hESC状态。 这些3iL hESC需要LIF以自我更新，并且与天然人类胚泡细胞的多能外胚层细胞共有表达 标记。对人类植入前胚胎和hESC进行的单细胞分析已经揭示这两者之间的显著性差异。这 一研究的新型3iL hESC状态缩小了这些体内和体外多能状态之间的差距（图120)。3让 hESC与天然植入前外胚层细胞之间的相似性在破解指定多能性的分子通路方面为未来的 研究提供了平台。
[0231]已经在多种在化学上确定的条件中，使用包括LIF在内的各种外部信号转导因子 维持hESC。先前的LIF依赖性hESC与mESC的未处理的状态显示出相似性。相比之下，也具LIF 依赖性的3iL hESC与天然植入前外胚层细胞的多能状态显示出相似性。在重新连线的回路 中观测到STAT3结合位点，这表明LIF信号转导潜在地与核心转录网络配合以促成3iL hESC 表达标记。LIF信号转导已经被报道增强了体外人类胚泡的形成。然而，LIF信号转导如何在 胚泡的多能细胞中起作用仍是未知的。因此，剖析LIF在3iL hESC中的作用可以提供对LIF 信号转导如何促进胚泡发育的更好的了解。
[0232] 3iL hESC的标志之一是在早期人类胚胎发生中表达的一组基因的上调，这些基因 中的一些被认为是用作谱系特异因子。这种因子的实例是GATA6,它在小鼠胚胎和人类胚胎 这两者的早期I CM中表达。有趣的是，GATA3、GATA4以及GATA6能够在重编程中替代0CT4，这 表明谱系特异因子在多能性中的作用。尽管GATA6基因座由0CT4、NAN0G以及STAT3结合，但 是GATA6在3iL hESC中的作用仍尚待研究。在3iL hESC中，GATA6可以经由与核心多能性相 关转录因子相互作用而成为多能性网络的组分。可选地，GATA6可以标记将在谱系特异性分 化期间被诱导的基因。3iL hESC因此可能用作典范以了解多能性相关转录因子与谱系特异 因子之间的相互作用。
[0233] 尽管证实了 3iL诱导了 hESC中深远的转录和表观遗传变化，但是这一转化的机制 还没有被完全了解。来自这一研究的数据证实3iL可以诱导GP130表达，这似乎是hESC中的 LIF信号转导激活的限速因子之一。还可以设想的是，3iL经由调节细胞信号转导可以通过 形成新的位点而改变多能性相关转录因子的结合。实际上，观测到在3iL hESC中存在许多 新的结合位点，并且这些与表达的变化显著相关（图12A-C)。因此，调节网络响应于用3i和 LIF进行的处理的重新连线似乎参与了细胞状态转化。
[0234]由于调苄基因组研究需要对于人类胚胎来说不可获得的大量细胞，因此3iL hESC 可以用作研究胚泡中多能性的基因调节的系统。利用对染色质标记和转录因子结合位点的 ChIP-seq表征，鉴定出在人类胚泡中表达，但是在hESC中被阻遏的基因的许多先前未知的 增强子，从而证实了3iL hESC提供了对在这一研究之前一直难接近的功能的了解。除基因 调节之外，表观遗传特性在3iL hESC与hESC之间也不同。举例来说，观测到在来自人类植入 前胚胎的细胞中表达的基因的整体去阻遏并且发现诸如DNMT3L的若干种表观遗传调节因 子差异性地表达。DNMT3L调节DNA甲基化，所述DNA甲基化是早期胚胎发育期间的关键过程 之一。3iL hESC可以用作模型系统来研究这些表观遗传通路以及它们在调节多能性中的作 用。
[0235] 总之，发现用3iL处理hESC诱导了在表观遗传学上、在转录上以及在形态学上与常 规的hESC不同的多能状态。证实了3iL hESC中重新连线的调节回路支持了天然植入前外胚 层样表达标记。3iL hESC的更天然的状态提供了新的机会。因此，对3iL hESC的研究增加了 修正和扩展我们对人类细胞的多能性的了解的许多可能性。
[0236] 实施例8
[0237] 诱导3iL hESC中的发育基因增强了3iL hESC分化
[0238] 在3iL hESC中观测到胚胎外谱系特异因子CDX2、GATA4和GATA6以及中内胚层标志 物T和MIXL的强烈上调（图13A和13B)。同时，多能性相关基因在3iL hESC和hESC中显示出相 似的表达水平（图8G)，这表明这不是由分化或多能性的丧失所引起，而是反映了3iL hESC 的特定特性。
[0239] 尽管发育基因的表达增加，但仍维持了多能状态是惊人的。如下进行研究以确定 这些发育基因的表达是否可以在生物学上引发细胞分化。为了测试这一假设，使用两种内 胚层分化方案将3iL hESC的内胚层分化效率与hESC相比较。在第一种方案中，使用小分子 抑制剂IDE-1和激活素 A使hESC分化。与从hESC分化的细胞相比，在使用3iL hESC时，观测到 更多的针对内胚层标志物S0X17和F0XA2染色呈阳性的细胞（图13C)。相应地，在从3iL hESC 分化的细胞中存在内胚层基因 S0X17、F0XA2、HNF4A以及CXCR4的更强上调（图13D)。使用第 二种分化方案，在从3iL hESC和hESC分化的大部分的细胞中观测到对内胚层祖细胞标志物 SOX 17表达的强烈诱导（图13E)。然而，在使用3iL hESC时，更多的细胞针对内胚层祖细胞标 志物F0XA2染色呈阳性（图13E)。在从3iL hESC分化的细胞中还存在内胚层基因 HNF4A和 CXCR4的更强上调（图13F)。因此，3 iL hESC似乎更容易朝向内胚层谱系分化。
【主权项】
1. 一种用于培养和维持处于未分化状态的多能干细胞的方法，所述方法包括将所述多 能干细胞培养在包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂、AMPK和/或BMP信号转导的双重抑制剂以及 LIF的培养基中。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述培养基是条件培养基。3. 如权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含饲养细胞。4. 如权利要求1所述的方法，其中所述培养基不含饲养细胞。5. 如权利要求1所述的方法，其中将所述多能干细胞培养在基质上。6. 如权利要求5所述的方法，其中所述基质是基底膜基质。7. 如权利要求5所述的方法，其中所述基质是包含以下各项中的一种或多种的细胞外 基质：层粘连蛋白、胶原、明胶、纤维连接蛋白、蛋白多糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素、或合成生 物聚合物。8. 如权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞。9. 如权利要求8所述的方法，其中所述胚胎干细胞是人类的。10. 如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括将所述处于未分化状态的多能干细 胞传代。11. 如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述MEK抑制剂处在0.5μΜ-1μΜ的浓 度。12. 如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述GSK3抑制剂处在1μΜ-2μΜ的浓度。13. 如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述ΑΜΡΚ和/或ΒΜΡ信号转导的双重抑 制剂处在2μΜ的浓度。14. 如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述LIF处在8ng/ml-10ng/ml的浓度。15. -种多能干细胞，所述多能干细胞是通过权利要求1至14中任一项所述的方法产生 的。16. 如权利要求15所述的多能干细胞，其中所述细胞表达至少一种选自由以下各项组 成的组的多能性标志物:NANOG、TRA-1 -60、0CT4以及TRA-1 -81。17. 如权利要求15所述的多能干细胞，其中所述细胞表达至少一种选自由以下各项组 成的组的外胚层样基因表达标志物:DPPA3、KLF4、KLF5、以及TBX3。18. 如权利要求15所述的多能干细胞，其中所述细胞表达至少一种选自由以下各项组 成的组的胚胎外标志物:CDX2、BMP4、GATA4以及GATA6。19. 如权利要求15所述的多能干细胞，其中所述细胞表达至少一种选自T或MIXL1的中 内胚层标志物。20. 如权利要求15至19中任一项所述的多能干细胞，其中相对于没有根据权利要求1至 14中任一项所述的方法培养的细胞，至少一种标志物的表达水平增加。21. 如权利要求20所述的多能干细胞，其中所述至少一种标志物的表达水平是通过 RNA-seq或实时PCR确定的。22. 如权利要求20至21中任一项所述的多能干细胞，其中相对于没有根据权利要求1至 14中任一项所述的方法培养的细胞，所述至少一种标志物的表达水平增加至少1.5倍至5 倍。23. 如权利要求20至22中任一项所述的多能干细胞，其中所述至少一种标志物是NANOG 并且相对于没有根据权利要求1至14中任一项所述的方法培养的细胞，所述表达水平增加 1.5倍至2倍。24. 如权利要求15至19所述的多能干细胞，其中相对于没有根据权利要求1至14中任一 项所述的方法培养的细胞的分化，所述细胞向内胚层细胞、神经元细胞或中胚层细胞的分 化增强。25. -种用于培养和维持处于未分化状态的多能干细胞的培养基，其中所述培养基包 含MEK抑制剂、GSK3抑制剂、AMPK和/或BMP信号转导的双重抑制剂以及LIF。26. -种用于由多能干细胞产生谱系特异性细胞的方法，所述方法包括： a) 根据权利要求1至14中任一项所述的方法培养处于未分化状态的多能干细胞； b) 分离所述未分化的多能干细胞；以及 c) 将分离的所述未分化的多能干细胞培养在适合于使所述分离的多能干细胞分化成 谱系特异性细胞的培养基中。27. 如权利要求26所述的方法，其中所述谱系特异性细胞是体细胞或细胞器。28. 如权利要求27所述的方法，其中所述谱系特异性细胞是内胚层谱系细胞。29. 如权利要求27所述的方法，其中所述体细胞是能够自我更新或分化成一个或几个 体细胞谱系的定向祖细胞，或完全成熟的体细胞分化的细胞。30. -种试剂盒，所述试剂盒在用于权利要求1至14中任一项所述的方法中时用于培养 和维持处于未分化状态的多能干细胞，所述试剂盒包括根据权利要求24所述的培养基和使 用说明书。
【文档编号】C12N5/0735GK105849252SQ201480070956
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年10月27日
【发明人】曾永昇, 黄学晖
【申请人】新加坡科技研究局