一种牙髓间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法
【专利摘要】本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种牙髓间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法。本发明提供的复苏培养基的制备方法为：取牙髓间充质干细胞，采用完全培养基进行第一培养后，再采用无血清培养基进行第二培养后，收集上清液，获得复苏培养基。采用本发明牙髓间充质干细胞的复苏培养基进行牙髓间充质干细胞的复苏培养，有利于牙髓间充质干细胞复活活力的提高与细胞增殖，能够更好的保持牙髓间充质干细胞的生物学特征。
【专利说明】
一种牙髓间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法
技术领域
[0001]本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种牙髓间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法。
【背景技术】
[0002]牙周炎是累及四种牙周支持组织(牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)的慢性感染性疾病，往往引发牙周支持组织的炎性破坏。在35岁以后较为多见。常见病因为菌斑、牙石、创伤性咬合、食物嵌塞、不良修复体、口呼吸等。牙周炎具有四大特征，即牙周袋形成、袋壁的炎症、牙槽骨吸收、牙齿逐渐松动。严重的牙周炎会造成牙齿脱落，从而导致咀嚼功能低下而引起消化不良及胃肠病，影响全身心的健康。
[0003]治疗牙周炎的主要在于消除炎症，促进被破坏的牙周组织的再生，恢复牙齿的正常功能。临床常采用的牙周炎治疗方法包括:牙周基础治疗(洁治、刮治、根面平整)、牙周翻瓣术及牙周组织再生术。
[0004]牙周基础治疗:洁治，也称洁牙，俗称洗牙，其是预防和治疗牙病的一种方法。即用洁治器械清除龈上牙石、菌斑和牙面上附着的色素，并抛光牙面，是防止菌斑和牙石再沉积，防治牙周病的措施。在洁治时还应该将龈沟内与龈上牙石相连的一部分龈下牙石也一并清除掉。根据所用的器械不同，龈上洁治术分为手用器械洁治法和超声波洁牙机洁治法。对于牙龈炎患者，每6?12个月作一次洁治，可有效地维护牙周健康。龈下刮治术，即根面平整术，其是用手工的龈下刮治器械伸入牙周袋内去除附着于牙周袋内根面上和嵌入牙骨质内的龈下牙石和菌斑，并刮除牙根表面受到毒素污染的病变牙骨质，从而形成光滑、清洁的根面，使根面具有生物相容的表面，有利于牙周组织的附着和新生。根面平整术不应用于健康牙周部位，以免导致牙周附着丧失。
[0005]牙周翻瓣术:指采用不同的手术切口，将牙龈与下方的组织分离，形成牙龈组织瓣，暴露病变区的根面和牙槽骨，提供清创入路和可视性。刮除病变组织和菌斑牙石后，将牙龈瓣复位在合适的位置上并缝合，达到消除牙周袋或使牙周袋变浅的目的。
[0006]牙周组织再生术:在已经缺失的牙槽骨区植入人工骨，并覆盖专用的生物引导膜，使牙周膜上的细胞选择性地在根面上生长，从而达到牙周膜、牙槽骨和牙骨质的再生。通过这种骨植和生物膜的技术，恢复已经破坏的牙槽骨、牙龈及其他的牙周组织，完成牙齿的重新稳定。
[0007]以上方法无法修复损伤的牙周附着及牙槽组织，不能满足目前临床上对口腔颂面部组织缺损修复再生及功能、外形恢复的要求，其次牙周炎治疗通过抗生素来控制菌斑生长，进行全身和局部的药物治疗。但抗生素副作用较多，病原微生物也会产生耐药性。
[0008]牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是存在于牙齿牙髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。牙髓干细胞具有多向分化的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。据报道，牙髓干细胞在牙周炎治疗中可起到很好的修复作用，作用机制为:通过植入局部并分化为缺损细胞，分泌细胞因子，趋化干细胞到局部，抑制局部炎症，促进局部血管新生。
[0009]在牙髓干细胞的临床应用中涉及到牙髓干细胞的冻存、复苏技术，细胞复苏是将长期超低温冻存于液氮中的细胞，迅速解冻到常温过程，同时确保恢复细胞的活性与生物学特征。目前，通常采用普通商品化的完全培养基对牙髓干细胞进行复苏培养。但普通商品化的完全培养基在细胞的复苏过程中无法保证干细胞的活力，细胞增值率较低，影响干细胞的临床利用。因此，需要开发一种能够更好地维持牙髓间充质干细胞活力的复苏培养基及其复苏方法。
【发明内容】
[0010]有鉴于此，本发明提供了一种牙髓间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法。该复苏培养基能够更好地维持牙髓间充质干细胞的活力。
[0011]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
[0012]本发明提供了一种牙髓间充质干细胞的复苏培养基，该复苏培养基的制备方法为:取牙髓间充质干细胞，采用完全培养基进行第一培养后，再采用无血清培养基进行第二培养后，收集上清液，获得复苏培养基。
[0013]作为优选，第一培养的时间为24?72h。
[0014]在本发明提供的一些实施例中，第一培养的时间为24h。
[0015]在本发明提供的一些实施例中，第一培养为在37°C,5%CO2条件下培养。
[0016]作为优选，第一培养的牙髓间充质干细胞的接种密度为(5?10)X103cell/cm2。
[0017]优选地，第一培养的牙髓间充质干细胞的接种密度为7X103Cell/Cm2。
[0018]作为优选，无血清培养基为DMEM/F12培养基。
[0019]作为优选，第二培养的时间为24?72h。
[0020]在本发明提供的一些实施例中，第二培养的时间为24h、48h或72h。
[0021 ]在本发明提供的一些实施例中，第二培养为在37°C,5%CO2条件下培养。
[0022]作为优选，收集上清液后还包括离心的步骤。
[0023]作为优选，离心为1000?2000rpm离心5?lOmin。
[0024]在本发明提供的一些实施例中，离心为100rpm离心5min。
[0025]作为优选，离心后还包括过滤除菌的步骤。
[0026]在本发明提供的一些实施例中，用于过滤除菌的滤膜的孔径为0.22μπι。
[0027]本发明还提供了一种牙髓间充质干细胞的复苏培养方法，采用本发明的复苏培养基复苏培养冻存的牙髓间充质干细胞。
[0028]作为优选，本发明提供的牙髓间充质干细胞的复苏培养方法为:取冻存的牙髓间充质干细胞，经温育后，采用本发明复苏培养基复苏培养温育后的牙髓间充质干细胞。
[0029]优选地，本发明提供的牙髓间充质干细胞的复苏培养方法为:取冻存的牙髓间充质干细胞，在35?42°C下震荡温育30?60s，加入5?10倍体积的本发明复苏培养基，离心，去上清，按(5?10) X 13ceIVcm2的密度接种于本发明复苏培养基，在37°C、5%⑶2条件下培养24h，获得第一复苏牙髓间充质干细胞;然后按(5?10) X 13ceIVcm2的密度将第一复苏牙髓间充质干细胞接种于本发明复苏培养基，在37°C、5%C02条件下继续培养24?48h，获得复苏后的牙髓间充质干细胞。
[0030]在本发明提供的一些实施例中，本发明提供的牙髓间充质干细胞的复苏培养方法为:取冻存的牙髓间充质干细胞，在42°C下震荡温育60s，加入5倍体积的本发明复苏培养基，离心，去上清，按7 X 13Cel Ι/cm2的密度接种于本发明复苏培养基，在37 °C,5%⑶2条件下培养24h，获得第一复苏牙髓间充质干细胞;然后按7 X 13ceIVcm2的密度将第一复苏牙髓间充质干细胞接种于本发明复苏培养基，在37°C、5%C02条件下继续培养48h，获得复苏后的牙髓间充质干细胞。
[0031]本发明提供了一种牙髓间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法。该复苏培养基的制备方法为:取牙髓间充质干细胞，采用完全培养基进行第一培养后，再采用无血清培养基进行第二培养后，收集上清液，获得复苏培养基。本发明的有益效果为:用牙髓间充质干细胞的条件培养基进行牙髓间充质干细胞的复苏培养，有利于牙髓间充质干细胞复活活力的提高与细胞增殖，能够更好的保持牙髓间充质干细胞的生物学特征。
【附图说明】
[0032]图1示实施例1复苏后细胞活力检测结果；
[0033]图2示实施例1中试验组的复苏后的牙髓间充质干细胞的流式检测结果;其中图2-1示⑶73检测结果，图2-2示⑶90检测结果，图2-3示⑶105检测结果，图2-4示⑶34检测结果，图2-5示⑶45检测结果，图2-6示HLA-DR检测结果；
[0034]图3示实施例1中对照组的复苏后的牙髓间充质干细胞的流式检测结果;其中图3-1示⑶73检测结果，图3-2示⑶90检测结果，图3-3示⑶105检测结果，图3_4示⑶34检测结果，图3-5示⑶45检测结果，图3-6示HLA-DR检测结果；
[0035]图4示实施例1中试验组的复苏后的牙髓间充质干细胞的诱导成骨分化鉴定结果；
[0036]图5示实施例1中试验组的复苏后的牙髓间充质干细胞的诱导成脂分化鉴定结果；
[0037]图6示实施例2复苏后细胞活力检测结果；
[0038]图7示实施例2中试验组的复苏后的牙髓间充质干细胞的流式检测结果;其中图7-1示⑶73检测结果，图7-2示⑶90检测结果，图7-3示⑶105检测结果，图7_4示⑶34检测结果，图7-5示⑶45检测结果，图7-6示HLA-DR检测结果；
[0039]图8示实施例2中对照组的复苏后的牙髓间充质干细胞的流式检测结果;其中图8-1示⑶73检测结果，图8-2示⑶90检测结果，图8-3示⑶105检测结果，图8-4示⑶34检测结果，图8-5示⑶45检测结果，图8-6示HLA-DR检测结果；
[0040]图9示实施例3复苏后细胞活力检测结果；
[0041]图10示实施例3中试验组的复苏后的牙髓间充质干细胞的流式检测结果;其中图
10-1示CD73检测结果，图10-2示CD90检测结果，图10_3示CD105检测结果，图10_4示CD34检测结果，图10-5示CD45检测结果，图10-6示HLA-DR检测结果；
[0042]图11示实施例3中对照组的复苏后的牙髓间充质干细胞的流式检测结果;其中图
11-1示⑶73检测结果，图11-2示⑶90检测结果，图11_3示⑶105检测结果，图11_4示⑶34检测结果，图11-5示CD45检测结果，图11-6示HLA-DR检测结果。
【具体实施方式】
[0043]本发明公开了一种牙髓间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0044]术语解释:
[0045]细胞复苏:将长期超低温冻存于液氮中的细胞，迅速解冻到常温过程，同时确保恢复细胞的活性与生物学特征；
[0046]条件培养基:在细胞增殖培养过程中，细胞会分泌活性物质到培养液中，其中细胞因子是主要的活性物质之一，这种培养过某种细胞或组织以后，含有细胞分泌物的培养液就叫做条件培养液。利用条件培养液可有效提高细胞或组织体外培养的成功率，而且不同来源的条件培养液对不同细胞、组织有不同的促进或抑制作用。
[0047]本发明提供的牙髓间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法中所用生物材料均可由市场购得。
[0048]下面结合实施例，进一步阐述本发明:
[0049]实施例1
[0050](— )牙髓间充质干细胞的培养及条件培养基的收集
[0051](I)牙髓间充质干细胞的培养
[0052]收集30岁以下人脱落及拔出的健康牙齿，PBS清洗牙齿表面污垢，用钳夹裂牙齿，暴露牙髓组织；用无菌镊子夹取牙髓组织。剪碎，放置50mL离心管中，加入10倍体积的3g/LI型胶原酶，封口后充分混合均匀，转移至恒温空气摇床中，37°C、200R消化10-20min左右，加入等体积的完全培养基终止消化，反复吹打离散细胞团块，通过70μπι的细胞筛网过滤，以获得单个离散的细胞，100rpm离心5min。丢弃上清，用30mL PBS清洗沉淀I次，100rpm离心5!!^11。沉淀用0腿1/^12+10%?83培养重悬，以0.5?1\104/0112接种至六孔板中，每孔加入2mL生长培养基，再加入表皮生长因子EGF与碱性成纤维生长因子bFGF(两者终浓度为1ng/mL)，混匀细胞悬液，放于37 °C、湿度为95 %的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液I次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至80%-90%汇合时，0.125%胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。离心后用完全培养基重悬沉淀，7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中继续培养。取P3-P5代细胞进行条件培养基收集。
[0053](2)条件培养基收集
[0054]用于条件培养基的牙髓间充质干细胞，先按照7X 103/cm2细胞密度接种培养皿，完全培养基进行培养24小时后，用PBS清洗后，加入无血清的DMEM/F12培养基继续培养24小时后，收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，100pm离心5min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取条件培养基，用0.22μπι滤膜过滤，收集在无菌培养瓶中。放置在-20°C培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80°C保存I年以上。需要使用时，恢复到常温使用。
[0055](二)牙髓间充质干细胞的复苏
[0056]复苏试验分为试验组和对照组，试验组的操作流程为:将冻存的牙髓间充质干细胞将冻存的间充质干细胞从液氮中取出，放置在42 0C的水浴锅中，震荡温育60秒，细胞解冻后，立即将冻存液加入到5倍体积的上述收集到的条件培养基中，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞悬液以100rpm离心5分钟，去上清，用条件培养基重悬沉淀;轻轻吹打混匀，并按照7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中，用条件培养基培养。放置在37°C，5%C02培养箱静置24小时后，更换条件培养基继续培养，每日观察细胞扩增情况，细胞进行继续培养48小时，用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞进行细胞传代或其他实验。
[0057]对照组的操作流程为:从液氮中取出牙髓间充质干细胞，立即投入42°C水浴中融化。PBS洗涤后，取出细胞进行细胞活力检测，以100rpm离心5分钟，去上清，用完全培养基重悬细胞，按照7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中，并放置于37 °C,5%⑶2培养箱中培养72小时。用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测。其余细胞进行细胞传代或其他实验。活力检测结果见图1。
[0058]由图1可知，试验组细胞复活活力高于对照组，表明本实施例复苏培养基有利于牙髓间充质干细胞复活活力的提高与细胞增殖，能够更好的保持牙髓间充质干细胞的生物学特征。
[0059](三)流式细胞仪检测复苏后的干细胞表面标志
[0060]待复苏后细胞汇合度达到80 %-90%,ffl0.25%胰酶消化离心细胞，并计数后每管加入2 X 15细胞数，染色缓冲液洗I次，100rpm离心5min;弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞;加入CD73、CD90、CD 105、CD34、CD45及HLA-DRA抗体各2yL，并设一管为空白对照；在4 °C下，避光反应15-20min;染色缓冲液洗一次，100rpm离心5min;直接标记的细胞弃上清，避光加入500yL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。试验组的试验结果见图2，对照组的试验结果见图3。
[0061]由图2、图3可知，试验组采用本发明提供的复苏培养基对冻存的间充质干细胞进行复苏培养后，阴性表面标志⑶34、⑶45、HLA-DR为均呈现阴性，同时间充质干细胞表面标记物CD73、CD90，CD105均呈现阳性。说明复苏后牙髓间充质干细胞依然保持间充质干细胞的生物学特征。
[0062](四)复苏后细胞诱导成骨分化鉴定
[0063]待试验组复苏后细胞汇合度达到80%-90%，用0.25%胰酶消化离心细胞，按照5X 13细胞/Cm2接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2-3天换液，28天后进行茜素红染色，结果见图4。
[0064]由图4可见，复苏后的间充质干细胞，经过成骨诱导4周后，由茜素红染色可见钙化结节，说明经过本发明复苏培养基复苏后的牙髓间充质干细胞仍然保持向成骨分化的潜會K。
[0065](五)复苏后间充质干细胞诱导成脂分化鉴定
[0066]待试验组复苏后细胞汇合度达到80 %-90 %，用0.25 %胰酶消化离心细胞，收集细胞后，并按照5X 13细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10 %胎牛血清、0.5mM IBMX, ΙμΜ地塞米松、ΙΟΟμΜ吲哚美辛、5yg/mL胰岛素、2mm/L谷氨酰胺等。每三天换液。四周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，结果见图5。
[0067]由图5可见，复苏后的间充质干细胞，经过成脂诱导4周后，由油红O染色可见红色油滴，说明经过本发明复苏培养基复苏后的牙髓间充质干细胞仍然保持向脂肪分化的潜會K。
[0068]实施例2
[0069](— )牙髓间充质干细胞的培养及条件培养基的收集
[0070](I)牙髓间充质干细胞的培养
[0071 ]收集30岁以下人脱落及拔出的健康牙齿，PBS清洗牙齿表面污垢，用钳夹裂牙齿，暴露牙髓组织；用无菌镊子夹取牙髓组织。剪碎，放置50mL离心管中，加入10倍体积的3g/LI型胶原酶，封口后充分混合均匀，转移至恒温空气摇床中，37°C、200R消化10-20min左右，加入等体积的完全培养基终止消化，反复吹打离散细胞团块，通过70μπι的细胞筛网过滤，以获得单个离散的细胞，100rpm离心5min。丢弃上清，用30mL PBS清洗沉淀I次，100rpm离心5!!^11。沉淀用0腿1/^12+10%?83培养重悬，以0.5?1\104/0112接种至六孔板中，每孔加入2mL生长培养基，再加入表皮生长因子EGF与碱性成纤维生长因子bFGF(两者终浓度为1ng/mL)，混匀细胞悬液，放于37 °C、湿度为95 %的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液I次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至80%-90%汇合时，0.125%胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。离心后用完全培养基重悬沉淀，7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中继续培养。取P3-P5代细胞进行条件培养基收集。
[0072](2)条件培养基收集
[0073]用于条件培养基的牙髓间充质干细胞，先按照7X 103/cm2细胞密度接种培养皿，完全培养基进行培养24小时后，用PBS清洗后，加入无血清的DMEM/F12培养基继续培养48小时后，收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，100rpm离心5min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取条件培养基，用0.22μπι滤膜过滤，收集在无菌培养瓶中。放置在_20°C培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80°C保存I年以上。需要使用时，恢复到常温使用。
[0074](二)牙髓间充质干细胞的复苏
[0075]复苏试验分为试验组和对照组，试验组的操作流程为:将冻存的牙髓间充质干细胞将冻存的间充质干细胞从液氮中取出，放置在42 0C的水浴锅中，震荡温育60秒，细胞解冻后，立即将冻存液加入到5倍体积的上述收集到的条件培养基中，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞悬液以100rpm离心5分钟，去上清，用条件培养基重悬沉淀;轻轻吹打混匀，并按照7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中，用条件培养基培养。放置在37°C，5%C02培养箱静置24小时后，更换条件培养基继续培养，每日观察细胞扩增情况，细胞进行继续培养48小时，用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞进行细胞传代或其他实验。
[0076]对照组的操作流程为:从液氮中取出牙髓间充质干细胞，立即投入42°C水浴中融化。PBS洗涤后，取出细胞进行细胞活力检测，以100rpm离心5分钟，去上清，用完全培养基重悬细胞，按照7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中，并放置于37 °C,5%⑶2培养箱中培养72小时。用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测。其余细胞进行细胞传代或其他实验。细胞活力检测结果见图6。
[0077]由图6可知，试验组细胞复活活力高于对照组，表明本实施例复苏培养基有利于牙髓间充质干细胞复活活力的提高与细胞增殖，能够更好的保持牙髓间充质干细胞的生物学特征。
[0078](三)流式细胞仪检测复苏后的干细胞表面标志
[0079]待复苏后细胞汇合度达到80 %-90%,ffl0.25%胰酶消化离心细胞，并计数后每管加入2 X 15细胞数，染色缓冲液洗I次，100rpm离心5min;弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞;加入CD73、CD90、CD 105、CD34、CD45及HLA-DRA抗体各2yL，并设一管为空白对照；在4 °C下，避光反应15-20min;染色缓冲液洗一次，100rpm离心5min;直接标记的细胞弃上清，避光加入500yL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。试验组的试验结果见图7，对照组的试验结果见图8。
[0080]由图7、图8可知，试验组采用本发明提供的复苏培养基对冻存的间充质干细胞进行复苏培养后，阴性表面标志⑶34、⑶45、HLA-DR为均呈现阴性，同时间充质干细胞表面标记物CD73、CD90，CD105均呈现阳性。说明复苏后牙髓间充质干细胞依然保持间充质干细胞的生物学特征。
[0081 ](四)复苏后细胞诱导成骨分化鉴定
[0082]待试验组复苏后细胞汇合度达到80%-90%，用0.25%胰酶消化离心细胞，按照5X 13细胞/Cm2接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2-3天换液，28天后进行茜素红染色，结果与图4相似。可见，复苏后的间充质干细胞，经过成骨诱导4周后，由茜素红染色可见钙化结节，说明经过本发明复苏培养基复苏后的牙髓间充质干细胞仍然保持向成骨分化的潜能。
[0083](五)复苏后间充质干细胞诱导成脂分化鉴定
[0084]待试验组复苏后细胞汇合度达到80%-90 %，用0.25 %胰酶消化离心细胞，收集细胞后，并按照5X 13细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10 %胎牛血清、0.5mM IBMX, ΙμΜ地塞米松、ΙΟΟμΜ吲哚美辛、5yg/mL胰岛素、2mm/L谷氨酰胺等。每三天换液。四周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，结果与图5相似。可见，复苏后的间充质干细胞，经过成脂诱导4周后，由油红O染色可见红色油滴，说明经过本发明复苏培养基复苏后的牙髓间充质干细胞仍然保持向脂肪分化的潜能。
[0085]实施例3
[0086](— )牙髓间充质干细胞的培养及条件培养基的收集
[0087](I)牙髓间充质干细胞的培养
[0088]收集30岁以下人脱落及拔出的健康牙齿，PBS清洗牙齿表面污垢，用钳夹裂牙齿，暴露牙髓组织；用无菌镊子夹取牙髓组织。剪碎，放置50mL离心管中，加入10倍体积的3g/LI型胶原酶，封口后充分混合均匀，转移至恒温空气摇床中，37°C、200R消化10-20min左右，加入等体积的完全培养基终止消化，反复吹打离散细胞团块，通过70μπι的细胞筛网过滤，以获得单个离散的细胞，100rpm离心5min。丢弃上清，用30mL PBS清洗沉淀I次，100rpm离心5!!^11。沉淀用0腿1/^12+10%?83培养重悬，以0.5?1\104/0112接种至六孔板中，每孔加入2mL生长培养基，再加入表皮生长因子EGF与碱性成纤维生长因子bFGF(两者终浓度为1ng/mL)，混匀细胞悬液，放于37 °C、湿度为95 %的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液I次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至80%-90%汇合时，0.125%胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。离心后用完全培养基重悬沉淀，7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中继续培养。取P3-P5代细胞进行条件培养基收集。
[0089](2)条件培养基收集
[0090]用于条件培养基的牙髓间充质干细胞，先按照7X 103/cm2细胞密度接种培养皿，完全培养基进行培养24小时后，用I3BS清洗后，加入无血清的DMEM/F12培养基，继续培养72小时后，收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，100pm离心5min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取条件培养基，用0.22μπι滤膜过滤，收集在无菌培养瓶中。放置在_20°C培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80°C保存I年以上。需要使用时，恢复到常温使用。
[0091](二)牙髓间充质干细胞的复苏
[0092]复苏试验分为试验组和对照组，试验组的操作流程为:将冻存的牙髓间充质干细胞将冻存的间充质干细胞从液氮中取出，放置在42 0C的水浴锅中，震荡温育60秒，细胞解冻后，立即将冻存液加入到5倍体积的上述收集到的条件培养基中，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞悬液以100rpm离心5分钟，去上清，用条件培养基重悬沉淀;轻轻吹打混匀，并按照7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中，用条件培养基培养。放置在37°C，5%C02培养箱静置24小时后，更换条件培养基继续培养，每日观察细胞扩增情况，细胞进行继续培养48小时，用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞进行细胞传代或其他实验。
[0093]对照组的操作流程为:从液氮中取出牙髓间充质干细胞，立即投入42°C水浴中融化。PBS洗涤后，取出细胞进行细胞活力检测，以100rpm离心5分钟，去上清，用完全培养基重悬细胞，按照7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中，并放置于37 °C,5%⑶2培养箱中培养72小时。用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测。其余细胞进行细胞传代或其他实验。细胞活力检测结果见图9。
[0094]由图9可知，试验组细胞复活活力高于对照组，表明本实施例复苏培养基有利于牙髓间充质干细胞复活活力的提高与细胞增殖，能够更好的保持牙髓间充质干细胞的生物学特征。
[0095](三)流式细胞仪检测复苏后的干细胞表面标志
[0096]待复苏后细胞汇合度达到80 %-90%,ffl0.25%胰酶消化离心细胞，并计数后每管加入2 X 15细胞数，染色缓冲液洗I次，100rpm离心5min;弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞;加入CD73、CD90、CD 105、CD34、CD45及HLA-DRA抗体各2yL，并设一管为空白对照；在4 °C下，避光反应15-20min;染色缓冲液洗一次，100rpm离心5min;直接标记的细胞弃上清，避光加入500yL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。试验组的试验结果见图10，对照组的试验结果见图11。
[0097]由图10、11可知，试验组采用本发明提供的复苏培养基对冻存的间充质干细胞进行复苏培养后，阴性表面标志⑶34、⑶45、HLA-DR为均呈现阴性，同时间充质干细胞表面标记物CD73、CD90，CD105均呈现阳性。说明复苏后牙髓间充质干细胞依然保持间充质干细胞的生物学特征。
[0098](四)复苏后细胞诱导成骨分化鉴定
[0099]待试验组复苏后细胞汇合度达到80%-90%，用0.25%胰酶消化离心细胞，按照5X 13细胞/Cm2接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2-3天换液，28天后进行茜素红染色，结果与图4相似。可见，复苏后的间充质干细胞，经过成骨诱导4周后，由茜素红染色可见钙化结节，说明经过本发明复苏培养基复苏后的牙髓间充质干细胞仍然保持向成骨分化的潜能。
[0100](五)复苏后间充质干细胞诱导成脂分化鉴定
[0101 ]待试验组复苏后细胞汇合度达到80 % -90 %，用0.25 %胰酶消化离心细胞，收集细胞后，并按照5X 13细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10 %胎牛血清、0.5mM IBMX, ΙμΜ地塞米松、ΙΟΟμΜ吲哚美辛、5yg/mL胰岛素、2mm/L谷氨酰胺等。每三天换液。四周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，结果与图5相似。可见，复苏后的间充质干细胞，经过成脂诱导4周后，由油红O染色可见红色油滴，说明经过本发明复苏培养基复苏后的牙髓间充质干细胞仍然保持向脂肪分化的潜能。
[0102]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种牙髓间充质干细胞的复苏培养基，其特征在于，所述复苏培养基的制备方法为:取牙髓间充质干细胞，采用完全培养基进行第一培养后，再采用无血清培养基进行第二培养后，收集上清液，获得复苏培养基。2.根据权利要求1所述的复苏培养基，其特征在于，所述第一培养的时间为24?72h。3.根据权利要求1所述的复苏培养基，其特征在于，所述第一培养的牙髓间充质干细胞的接种密度为(5?10) X 103cell/cm2。4.根据权利要求1所述的复苏培养基，其特征在于，所述无血清培养基为DMEM/F12培养基。5.根据权利要求1所述的复苏培养基，其特征在于，所述第二培养的时间为24?72h。6.根据权利要求1所述的复苏培养基，其特征在于，所述收集上清液后还包括离心的步骤。7.根据权利要求6所述的复苏培养基，其特征在于，所述离心为1000?2000rpm离心5?1min08.根据权利要求6或7所述的复苏培养基，其特征在于，所述离心后还包括过滤除菌的步骤。9.一种牙髓间充质干细胞的复苏培养方法，其特征在于，所述采用权利要求1至8中任一项所述的复苏培养基复苏培养冻存的牙髓间充质干细胞。10.根据权利要求9所述的复苏培养方法，其特征在于，所述复苏培养方法为:取冻存的牙髓间充质干细胞，经温育后，采用权利要求1至8中任一项所述的复苏培养基复苏培养所述温育后的牙髓间充质干细胞。
【文档编号】C12N5/0775GK105861429SQ201610235181
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】陈海佳, 王飞, 王一飞, 葛啸虎, 冯德龙
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司