专利名称：人牙髓干细胞库的构建方法
技术领域：
本发明属于生物组织材料技术领域，具体涉及人牙髓干细胞的制备及其细胞库的
构建方法。
背景技术：
由于各种原因导致的牙体缺损和牙齿缺失已成为危害口腔乃至人体健康的主要疾病，其发病率逐年增加。目前主要是借助于各种牙科材料充填来应对牙齿缺损疾病，虽然在一定程度上能阻止病变的继续发展，但却不能解决根本问题。对于牙齿缺失尽管解决途径很多，但最有效和最根本的办法还是牙齿生物性再生。 随着组织再生医学的快速发展，为牙体缺损和牙齿缺失的有效治疗带来了希望。目前已有许多研究利用牙源性上皮和牙源性间充质的相互作用再生出了牙齿组织。常用的牙源性间充质包括牙乳头细胞和牙髓组织细胞。由于牙乳头细胞在临床上难以获得，因此，目前用于牙体及牙齿再生的种子细胞首选是牙髓组织来源的细胞，其中最重要的是牙髓干细胞。 2000年首次发现了牙髓干细胞(S.Gronthos， M.Mankani， J. Brahim， P， et al，Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro andin vivo，Proc Natl AcadSci U S A. 2000 December 5 ;97(25) :13625-13630.)。这是一类具有高增殖能力、高度自我更新能力、多向分化能力等于细胞特性的细胞。已有研究利用该细胞成功地构建了牙髓、牙本质以及牙齿组织。因此，牙髓干细胞是构建牙体及牙齿组织的理想种子细胞。
干细胞库是在深低温中储存干细胞以及搜集存储干细胞资源相关资料的场所。完善的干细胞库应具备随时随地将健康的干细胞提供于临床使用的能力。目前已成功建立有一些干细胞库(如脐带血干细胞库)，而至今仍无人牙髓干细胞库。 从乳恒牙替换至阻生牙、多生牙及正畸牙齿，大量的牙齿被废弃，其中的牙髓干细胞资源白白流失。因此，制备牙髓干细胞，建立人牙髓干细胞库，为自体及他人提供牙体治疗及牙齿再生的种子细胞具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种人牙髓干细胞库的构建方法，并提出一种充分利用乳牙、阻生牙、多生牙及正畸牙为来源的人牙髓干细胞的制备方法；为人牙髓干细胞库的构建和人牙髓干细胞的制备提供容易掌握、安全可行、成本低廉的操作规范。 本发明所提出的人牙髓干细胞库的构建方法，有基本信息采集、牙髓干细胞获取、牙髓干细胞的冻存、入库以及信息记录与核对的步骤；具体包括 步骤一、采集基本信息如检索编码，供体姓名、年龄、身份证号码、出生日期、种族、通讯地址、联系方式、常规检查结果以及后续步骤的相关信息；所述的常规检查包括供体血液的AB0/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、异型肝炎抗原抗体检测、CMV抗体检测及HIV免疫检测等，还可以包括供体三代以内上述项目的检测；
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步骤二、获取牙髓干细胞(1)将供体新鲜牙齿组织采用含V/V为5% 20%新生牛血清的DMEM培养液完成转移，在无菌条件下用PBS液冲洗清除牙周组织，用破碎机破碎牙齿，挑选牙髓组织用PBS液冲洗；(2)在1000 2000转/分钟离心3 10分钟，去除上清液，加入5 10倍体积的消化液后，用吸管吹散均匀，置入37t:孵箱中透气孵育10 60分钟，所述的消化液为3 9U/ml胶原酶溶液与相同体积的0. 2 5U/ml分散酶溶液的混合；(3)孵育完成后，在悬液中加入所述含新生牛血清的DMEM培养液，吹散组织细胞悬液阻止继续消化，在800 2000转/分钟离心3 10分钟，弃上清后，加入5 10倍体积的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液转入培养瓶中进行原代培养；(4)培养7 9天后用3 9U/ml浓度的胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱落后重新接种培养；待细胞长满瓶底80 90%时，采用磁珠分离法分离出牙髓干细胞；再用干细胞标志物(如STR0-1和CD146)对所得到的细胞进行鉴定，然后采用细胞工厂进行扩增培养； 所述的完全培养基是在a -MEM培养液中按体积比加有10 30%的胎牛血清，终浓度为400 600ng/ml的Noggin和终浓度为20 60ng/ml的成纤维细胞生长因子；另外，细胞条件培养基是牙髓干细胞在完全培养基中培养2 4天后，收集其培养液去除杂质后的液体。 步骤三、牙髓干细胞冻存、入库将所获得的牙髓干细胞按1 X 107 8 X 107个/ml的密度在冻存液中重悬，分装入冻存管，将冻存管在0 4t:条件下，以0. 5 2°C /分钟的速度冷冻至-80 -120°C ;再将冻存管转移至-196t:液氮中贮存入库；贮存入库可以按ABO/Rh和HLA分型进行分类保存； 所述的冻存液包括以下四种①完全培养基中含10%体积的甘油；②完全培养基中含10%体积的二甲基亚砜(DMSO);③所述冻存液①与同体积细胞条件培养基的混合； 所述冻存液②与同体积细胞条件培养基的混合。其中，①和②适用于乳牙及《40岁供体的恒牙牙髓干细胞库的构建；③和④适用于40-60岁供体的牙髓干细胞库的构建。所述冻存液中的二甲基亚砜和甘油，能够快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点、延缓冷冻过程，同时提高胞内离子浓度，避免液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的细胞损伤。
步骤四、信息记录与核对在贮存入库的容器载体上建立有相关信息，将前述所采集供体基本信息和相应牙髓干细胞制备及其细胞库构建过程的相关信息录入计算机信息
库；并按检索编码调出相关记录与供体资料进行核实，纳入细胞库管理；即完成人牙髓干细胞库的构建。 本发明所构建人牙髓干细胞库的应用方法是，按检索编码在细胞库管理中核对相关信息后，将对应的存贮细胞冻存管由液氮中取出，即刻放入37°C 45t:的水浴中，30秒至1分钟内融化，急速融化复苏可防止损害细胞；将所复苏细胞按照实际需要进行扩增培养后即可应用。 本发明的人牙髓干细胞制备及其细胞库的构建方法，可从废弃的人健康牙齿的牙髓中获得大量的牙髓干细胞，利用系统工程，建立有效资源的储备库。本发明储存于库内的人牙髓干细胞，经短期培养可获得大量(1X1(T 7X1(T)富有功能活性的牙髓干细胞，并能长期保存而不失其活性。与已有的干细胞库相比，本发明的构建操作规范，简单容易掌握，安全可行，建库成本低廉，标准化程度高，针对不同年龄段来源的细胞采用不同的冻存液使得复苏后细胞的活性增强，扩大了细胞的来源、增强了细胞的活性。此外，本发明所使用的牙齿均为各种原因被拔除废弃的牙齿，大大节约了医疗资源；因此，人牙髓干细胞库的 构建具有广泛的应用前景。
具体实施例方式以下结合实例对本发明技术方案作进一步说明，但并不受限于下述实例。实例中 的操作均在严格无菌环境进行，为保证细胞不受污染，在所有使用的PBS、 a -MEM及DMEM的 溶液中均加有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。
实施例1、人智齿牙髓干细胞的制备及其干细胞库的构建 步骤一、采集基本信息抽取供体静脉血经过检测程序(ABO/Rh血型检测、HLA分 型检测、梅毒抗体检测、异型肝炎抗原抗体检测、CMV抗体检测及HIV免疫检测等)确定安 全性后记录，采集供体基本信息包括检索编码、姓名、年龄、身份证号、出生日期、种族、通 讯地址及联系方式等。 步骤二、获取牙髓干细胞获取供体阻生智齿两颗置入准备好的含V/V为15%小 牛血清的DMEM培养液的离心管中，用膜封口后转移至无菌超净台，用pH7. 4的PBS液反复 冲洗牙齿组织去除表面残留血液和牙周膜；转移至破碎机中破碎牙齿，暴露出完全牙髓组 织，仔细挑选出牙髓组织碎块用PBS液冲洗；采用1200转/分钟离心5分钟，去除上清液， 加入2ml消化液(为6. 25U/ml的胶原酶溶液与相同体积的1U/ml分散酶溶液的混合)后用 吸管吹散牙髓组织碎块，放入37°C 、5% C02条件的孵箱中透气孵育50分钟；孵育完成后，在 悬液中加入所述含小牛血清的DMEM培养液5ml，吹散组织细胞悬液阻止其继续消化，1000 转/分钟离心5分钟，去除上清，加入4ml的完全培养基重悬细胞(完全培养基是在a -MEM 培养液中按体积比加有20%的胎牛血清，终浓度为400ng/ml的Noggin和终浓度为60ng/ ml的成纤维细胞生长因子)，将细胞悬液移入T型培养瓶进行原代培养，12小时后换液，此 后间隔2 3天换液；7天后用3U/ml浓度的胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱落后 重新接种培养；待细胞长满瓶底80 90%时，采用磁珠分离法分离出牙髓干细胞；对所获 得的牙髓干细胞进行STR0-1及CD146鉴定检测；然后将牙髓干细胞接种于细胞工厂中扩增 培养； 步骤三、牙髓干细胞冻存、入库将扩增所得的牙髓干细胞按3Xl(f个/ml的密度
在冻存液(细胞条件培养基与同体积含10%二甲基亚砜的完全培养基的混合)中重悬，分
装进冻存管，将冻存管置于fC环境中，以1°C /分钟的速度冷冻至-120°C ，然后将冻存管转
移到_1961:液氮罐中贮存入库；按AB0/Rh和HLA分型进行分类保存； 步骤四、信息记录与核对在贮存入库的容器载体上建立相关信息(如检索编码
和供体姓名)，将前述所采集供体基本信息和牙髓干细胞制备及细胞库构建过程的相关信
息(如细胞培养液构成及浓度、胰酶及胶原酶浓度及消化时间、细胞接种密度及原代与扩
增培养时间、冻存液构成及冻存时间等)录入计算机信息库；并按检索编码调出相关记录
与供体资料进行核实，确认所有资料及操作准确无误，纳入细胞库管理；即完成人智齿牙髓
干细胞库的构建。应用时将上述细胞按照实际需要进行复苏和扩增培养。 实施例2、人正畸拔除牙牙髓干细胞的制备及其干细胞库的构建 步骤一、采集基本信息抽取供体静脉血经过检测程序(AB0/Rh血型检测、HLA分
型检测、梅毒抗体检测、异型肝炎抗原抗体检测、CMV抗体检测及HIV免疫检测等)确定安全性后记录，采集供体基本信息包括检索编码、姓名、年龄、身份证号、出生日期、种族、通 讯地址及联系方式等； 步骤二、获取牙髓干细胞获取供体因正畸需拔除的尖牙4颗放入准备好的含V/ V为10%小牛血清的DMEM培养液的离心管中，用膜封口后转移至无菌超净台，用pH7. 4的 PBS液反复冲洗牙齿去除表面残留血液和牙周膜；转移至破碎机进行破碎牙齿，暴露出完 全牙髓组织；仔细挑选出牙髓组织碎块用PBS液冲洗，采用1200转/分钟离心5分钟，弃上 清液，加入2ml消化液(为6. 25U/ml的胶原酶溶液与相同体积的0. 5U/ml分散酶溶液的混 合)后用吸管吹散牙髓组织碎块，放入37°C、5% C02条件的孵箱中透气孵育50分钟；孵育 完成后，在悬液中加入所述含小牛血清的DMEM培养液2ml，吹散组织细胞悬液阻止其继续 消化，1000转/分钟离心5分钟，去除上清，加入4ml的完全培养基重悬细胞(完全培养基 是在a -MEM培养液中按体积比加有20%的胎牛血清，终浓度为600ng/ml的Noggin和终 浓度为40ng/ml的成纤维细胞生长因子)，将细胞悬液移入T型培养瓶进行原代培养，12小 时后换液，此后每间隔2天换液；8天后用6U/ml浓度的胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞 完全脱落后重新接种培养；待细胞长满瓶底80 90%时，采用磁珠分离法分离出牙髓干细 胞；对所获得的牙髓干细胞进行STR0-1及CD146鉴定检测；然后将牙髓干细胞接种于细胞 工厂中扩增培养； 步骤三、牙髓干细胞冻存、入库将扩增所得的牙髓干细胞按4Xl(f个/ml的密度 在冻存液(含10%体积的二甲基亚砜的完全培养基)中重悬，分装进冻存管，将冻存管置于 2t:环境中，以1°C /分钟的速度冷冻至-IO(TC，然后将冻存管转移到-1961:液氮罐中贮存 入库；按AB0/Rh和HLA分型进行分类保存； 步骤四、信息记录与核对在贮存入库的容器载体上建立相关信息(如检索编码 和供体姓名)，将前述所采集供体基本信息和牙髓干细胞制备及细胞库构建过程的相关信 息(如细胞培养液构成及浓度、胰酶及胶原酶浓度及消化时间、细胞接种密度及原代与扩 增培养时间、冻存液构成及冻存时间等)录入计算机信息库；并按检索编码调出相关记录 与供体资料进行核实，确认所有资料及操作准确无误，纳入细胞库管理；即完成人牙髓干细 胞库的构建。应用时将上述细胞按照实际需要进行复苏和扩增培养。
实施例3、人乳牙牙髓干细胞的制备及其干细胞库的构建 步骤一、采集基本信息抽取供体静脉血经过检测程序(AB0/Rh血型检测、HLA分 型检测、梅毒抗体检测、异型肝炎抗原抗体检测、CMV抗体检测及HIV免疫检测等)确定安 全性后记录，采集供体基本信息包括检索编码、姓名、年龄、身份证号、出生日期、种族、通 讯地址及联系方式等。 步骤二、获取牙髓干细胞获取供体因乳恒牙替换需拔除的乳牙3颗置入准备好 的含V/V为10X小牛血清的匿EM培养液的离心管中，用膜封口后转移至无菌超净台，用 pH7. 4的PBS液反复冲洗牙齿组织去除表面残留血液和牙周膜；转移至破碎机中破碎牙体， 暴露出完全牙髓组织，仔细挑选出牙髓组织碎块用PBS液冲洗；采用1200转/分钟离心3 分钟，去除上清液，加入2ml消化液(为4. 25U/ml的胶原酶溶液与相同体积的0. 4U/ml分散 酶溶液的混合)后用吸管吹散牙髓组织碎块，放入37°C、5% C02条件的孵箱中透气孵育45 分钟；孵育完成后，在悬液中加入所述含小牛血清的DMEM培养液3ml，吹散组织细胞悬液阻 止其继续消化，800转/分钟离心5分钟，去除上清，加入3ml的完全培养基重悬细胞(完全
6培养基是在a -MEM培养液中按体积比加有20%的胎牛血清，终浓度为500ng/ml的Noggin 和终浓度为50ng/ml的成纤维细胞生长因子)，将细胞悬液移入T型培养瓶进行原代培养， 12小时后换液，此后每间隔3天换液；9天后用5U/ml浓度的胰酶溶液消化并吹打细胞，使 细胞完全脱落后重新接种培养；待细胞长满瓶底80 90%时，采用磁珠分离法分离出牙髓 干细胞；对所获得的牙髓干细胞进行STR0-1及CD146鉴定检测；然后将牙髓干细胞接种于 细胞工厂中扩增培养； 步骤三、牙髓干细胞冻存、入库将扩增所得的牙髓干细胞按4Xl(f个/ml的密度 在冻存液(含10%体积甘油的完全培养基)中重悬，分装进冻存管，将冻存管置于4t:环境 中，以1°C /分钟的速度冷冻至-IO(TC，然后将冻存管转移到_1961:液氮罐中贮存入库；按 AB0/Rh和HLA分型进行分类保存； 步骤四、信息记录与核对在贮存入库的容器载体上建立相关信息(如检索编码 和供体姓名)，将前述所采集供体基本信息和牙髓干细胞制备及细胞库构建过程的相关信 息(如细胞培养液构成及浓度、胰酶及胶原酶浓度及消化时间、细胞接种密度及原代与扩 增培养时间、冻存液构成及冻存时间等)录入计算机信息库；并按检索编码调出相关记录 与供体资料进行核实，确认所有资料及操作准确无误，纳入细胞库管理；即完成人乳牙牙髓 干细胞库的构建。应用时将上述细胞按照实际需要进行复苏和扩增培养。
权利要求
一种人牙髓干细胞库的构建方法，其特征在于，有基本信息采集、牙髓干细胞获取、牙髓干细胞的冻存、入库以及信息记录与核对的步骤；具体包括步骤一、采集基本信息包括检索编码，供体姓名、年龄、身份证号码、出生日期、种族、通讯地址、联系方式、常规检查结果以及后续步骤的相关信息；步骤二、获取牙髓干细胞①将供体新鲜牙齿组织采用含V/V为5％～20％新生牛血清的DMEM培养液完成转移，在无菌条件下用PBS液冲洗清除牙周组织，破碎牙齿挑选牙髓组织用PBS液冲洗；②在1000～2000转/分钟离心3～10分钟，去除上清液，加入5～10倍体积的消化液后，用吸管吹散均匀，置入37℃孵箱中透气孵育10～60分钟；所述的消化液为3～9U/ml胶原酶溶液与相同体积的0.2～5U/ml分散酶溶液的混合；③孵育完成后，在悬液中加入所述含新生牛血清的DMEM培养液，吹散组织细胞悬液阻止继续消化，在800～2000转/分钟离心3～10分钟，弃上清后，加入5～10倍体积的完全培养基重悬细胞，转入培养瓶中进行原代培养；④培养7～9天后用3～9U/ml浓度的胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱落后重新接种培养；待细胞长满瓶底80～90％时，采用磁珠分离法分离出牙髓干细胞；再用干细胞标志物对所得到的细胞进行鉴定，然后采用细胞工厂进行扩增培养；步骤三、牙髓干细胞冻存、入库将所获得的牙髓干细胞按1×107～8×107个/ml的密度在冻存液中重悬，分装入冻存管，在0～4℃条件下，以0.5～2℃/分钟的速度冷冻至-80～-120℃；再将冻存管转移至-196℃液氮中贮存入库；步骤四、信息记录与核对在贮存入库的容器载体上建立相关信息，将前述所采集供体基本信息和相应牙髓干细胞制备及其细胞库构建过程的相关信息录入计算机信息库；并按检索编码调出相关记录与供体资料进行核实，纳入细胞库管理；即完成人牙髓干细胞库的构建。
2. 根据权利要求l所述的细胞库构建方法，其特征在于，所述的完全培养基是在 a -MEM培养液中按体积比加有10 30%的胎牛血清，终浓度为400 600ng/ml的Noggin 和终浓度为20 60ng/ml的成纤维细胞生长因子；所述的细胞条件培养基是牙髓干细胞在 完全培养基中培养2 4天后，收集其培养液去除杂质后的液体。
3. 根据权利要求1所述的细胞库构建方法，其特征在于，所述的冻存液包括以下四种①完全培养基中含10%体积的甘油；②完全培养基中含10%体积的二甲基亚砜；③所述冻存液①与同体积细胞条件培养基的混合；④所述冻存液②与同体积细胞条件培养基的混 合。
4. 根据权利要求1或2所述的细胞库构建方法，其特征在于，在所有使用的PBS、 a -MEM及DMEM的溶液中均加有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。
全文摘要
一种人牙髓干细胞库的构建方法，本发明包括基本信息采集、牙髓干细胞获取、牙髓干细胞的冻存、入库以及信息记录与核对的步骤；应用时按照实际需要进行复苏和扩增培养。本发明由废弃的人健康牙齿的牙髓中获得牙髓干细胞，利用系统工程，建立有效资源的储备库，储存于库内的人牙髓干细胞，经短期培养可获得大量富有功能活性的牙髓干细胞，并能长期保存而不失其活性；与已有技术相比，本发明的构建操作规范，简单容易掌握，安全可行，建库成本低廉，标准化程度高，针对不同年龄段来源的细胞采用不同的冻存液使得复苏后细胞的活性增强，扩大了细胞的来源、增强了细胞的活性。本发明所用的牙齿均为各种原因被拔除废弃的牙齿，大大节约了医疗资源，具有广泛的应用前景。
文档编号C12N5/074GK101717750SQ20091021940
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月9日 优先权日2009年12月9日
发明者张勇杰, 郭维华, 金岩 申请人:中国人民解放军第四军医大学;西安组织工程工程技术研究中心