一种低氧后侧群分选人牙髓干细胞的实验方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞生物学领域，涉及人牙髓干细胞研宄，具体涉及一种低氧后侧群分选人牙髓干细胞的实验方法。该方法从人牙髓细胞中分选出侧群细胞(SP cells, sidepopulat1n cells)，研宄表明其具有干细胞的生物学特性。
【背景技术】
[0002]干细胞的分选对于研宄干细胞生物学特性以及利用干细胞进行组织或器官再生有十分重要的意义。分选出增殖能力强、具有多向分化潜能的干细胞是有效运用干细胞进行组织工程的前提。侧群细胞的分离具有普遍适用性，可用于表面标志未知的干细胞的分离，这种分选方法可应用于牙髓干细胞的分离和纯化，简化实验过程，节约时间，提高分选效率。
[0003]现有技术通过细胞膜表面的分化抗原(免疫表型)来“认识”特定的细胞亚群，并以这些抗原界定分化层级(Hierarchy)。如使用Stro-1与⑶146作为分子标记，以免疫磁珠分选系统获得牙髓干细胞。
[0004]传统的实验方法存在如下缺陷:缺乏特异性的表面标记，实验操作较为繁琐，耗时耗力。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题，就是提供一种低氧后侧群分选人牙髓干细胞的实验方法，侧群分选出的牙髓干细胞具有较高的增殖能力、充足的细胞来源、对供者伤害小和无论理学限制等优点；且低氧培养后可促进人牙髓侧群细胞的表达。
[0006]解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0007]一种低氧后侧群分选人牙髓干细胞的实验方法，其特征是包括以下步骤:
[0008]SI恒牙牙髓细胞原代培养
[0009]收集28岁以下患者完整拔除的健康阻生第三磨牙或因正畸拔除的双尖牙，表面经75%乙醇消毒和灭菌PBS冲洗后，自釉牙骨质界劈开牙齿，无菌条件下取出牙髓，浸泡于含青链霉素的PBS溶液中剪碎，以1:1的比例加入3mg/ml的I型胶原酶和4mg/ml的Dispase消化液，37°C消化60min后离心；离心沉淀物加入DMEM培养基充分混匀，反复吹打以机械力离散细胞团块，过40 μ m细胞筛，获得单细胞悬液；
[0010]再次离心后用含20% FBS的DMEM调整细胞浓度为I X 14个/ml，接种于75cm2培养瓶，置于5% CO2、饱和湿度37 °C恒温培养箱中培养，8 - 12d达70%汇合时，即按1:3传代；
[0011]S2.低氧条件的模拟
[0012]用2% 02and 2% FBS的低氧和低血清模拟体内缺血状态24_48h，优选36h，其中低氧状态由气体混配器实现，即通过二氧化碳、空气、氮气流量计，使二氧化碳、空气、氮气按所需比例混配至低氧盒，在低氧盒中的氧浓度由氧浓度仪监测；
[0013]S3.侧群细胞检测与分选，包括以下子步骤:
[0014]S3-1，细胞预制:第二代人恒牙牙髓细胞经过24-48h体外缺血培养，，优选36h，胰酶消化后，用37°C含2%胎牛血清DMEM重悬后计数；调整细胞悬液浓度约为I X 16个/ml，加入50ml离心管，分别设实验组和对照组；两组均加入荧光染料H0echst33342，使终浓度为3-5 μ g/ml，对照组还加入ABCG2抑制剂维拉帕米，使终浓度为50 μ M ;37°C水浴避光孵育90min ;孵育过程中每间隔15min摇晃孵育管；孵育结束后，立即4°C离心细胞或冰上急冷后离心，用冰预冷的PBS液重悬细胞；细胞悬液过滤网去除细胞团块，吹打均匀后待上机检测；
[0015]S3-2，侧群细胞流式检测:预先清洗流式细胞仪内部管道后上样，Hoechst33342用紫外激光激发，450nm边缘长通滤片(BP)接受Hoechst蓝光，675nmBP接受Hoechst红光；选取线性信号，做Hoechst Red(X轴)和Hoechst Blue (Y轴)二维散点图，将Hoechst Red及Hoechst Blue弱信号且维拉帕米对照组缺失的区域设定为侧群细胞的门，计算百分比；
[0016]S3-3，侧群细胞流式分选:细胞预制后上流式机进行细胞分选，在状态良好细胞中收集侧群细胞至含20%胎牛血清的DMEM培养液的离心管，4°C保存；分选完成后100rpm离心5min，小心抽弃上清，以适当的培养基吹勾制成细胞悬液，接种至6孔板，调整细胞浓度至5X 15个/ml，常规培养，获得人牙髓干细胞。
[0017]有益效果:用本发明方法获得的牙髓干细胞可用于组织工程，干细胞治疗方面，为牙髓干细胞的临床应用打下坚实的基础。
【具体实施方式】
[0018]本发明的低氧后侧群分选人牙髓干细胞的实验方法实施例一，包括以下步骤:
[0019]SI恒牙牙髓细胞原代培养
[0020]收集28岁以下患者完整拔除的健康阻生第三磨牙或因正畸拔除的双尖牙，表面经75%乙醇消毒和灭菌PBS冲洗后，自釉牙骨质界劈开牙齿，无菌条件下取出牙髓，浸泡于含青链霉素的PBS溶液中剪碎，以1:1的比例加入3mg/ml的I型胶原酶和4mg/ml的Dispase消化液，37°C消化60min后离心；离心沉淀物加入DMEM培养基充分混匀，反复吹打以机械力离散细胞团块，过40 μ m细胞筛，获得单细胞悬液；
[0021]再次离心后用含20% FBS的DMEM调整细胞浓度为I X 14个/ml，接种于75cm2培养瓶，置于5% CO2、饱和湿度37 °C恒温培养箱中培养，8 - 12d达70%汇合时，即按1:3传代；
[0022]S2.低氧条件的模拟
[0023]用2% 02and 2% FBS的低氧和低血清模拟体内缺血状态24h，其中低氧状态由气体混配器实现，即通过二氧化碳、空气、氮气流量计，使二氧化碳、空气、氮气按所需比例混配至低氧盒，在低氧盒中的氧浓度由氧浓度仪监测；
[0024]S3.侧群细胞检测与分选，包括以下子步骤:
[0025]S3-1，细胞预制:第二代人恒牙牙髓细胞经过24h体外缺血培养，胰酶消化后，用37 °C含2 %胎牛血清DMEM重悬后计数；调整细胞悬液浓度约为I X 16个/ml，加入50ml离心管，分别设实验组和对照组；两组均加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为3-5 μ g/ml，对照组还加入ABCG2抑制剂维拉帕米，使终浓度为50 μ M ;37°C水浴避光孵育90min ;孵育过程中每间隔15min摇晃孵育管；孵育结束后，立即4°C离心细胞或冰上急冷后离心，用冰预冷的PBS液重悬细胞；细胞悬液过滤网去除细胞团块，吹打均匀后待上机检测；
[0026]S3-2，侧群细胞流式检测:预先清洗流式细胞仪内部管道后上样，Hoechst33342用紫外激光激发，450nm边缘长通滤片(BP)接受Hoechst蓝光，675nmBP接受Hoechst红光；选取线性信号，做Hoechst Red(X轴)和Hoechst Blue (Y轴)二维散点图，将Hoechst Red及Hoechst Blue弱信号且维拉帕米对照组缺失的区域设定为侧群细胞的门，计算百分比；
[0027]S3-3，侧群细胞流式分选:细胞预制后上流式机进行细胞分选，在状态良好细胞中收集侧群细胞至含20%胎牛血清的DMEM培养液的离心管，4°C保存；分选完成后100rpm离心5min，小心抽弃上清，以适当的培养基吹勾制成细胞悬液，接种至6孔板，调整细胞浓度至5X 15个/ml，常规培养，获得人牙髓干细胞。
[0028]实施例二
[0029]与实施例一不同之处仅在于以下2点:
[0030]步骤S2.低氧条件的模拟
[0031]用2% 02and 2% FBS的低氧和低血清模拟体内缺血状态48h ；
[0032]步骤S3的子步骤S3-1，细胞预制:第二代人恒牙牙髓细胞经过48h体外缺血培养。
[0033]实施例三
[0034]与实施例一不同之处仅在于以下2点:
[0035]步骤S2.低氧条件的模拟
[0036]用2% 02and 2% FBS的低氧和低血清模拟体内缺血状态36h ；
[0037]步骤S3的子步骤S3-1，细胞预制:第二代人恒牙牙髓细胞经过36h体外缺血培养。
【主权项】
1.一种低氧后侧群分选人牙髓干细胞的实验方法，其特征是包括以下步骤: Si恒牙牙髓细胞原代培养 收集28岁以下患者完整拔除的健康阻生第三磨牙或因正畸拔除的双尖牙，表面经75%乙醇消毒和灭菌PBS冲洗后，自釉牙骨质界劈开牙齿，无菌条件下取出牙髓，浸泡于含青链霉素的PBS溶液中剪碎，以1:1的比例加入3mg/ml的I型胶原酶和4mg/ml的Dispase消化液，37°C消化60min后离心；离心沉淀物加入DMEM培养基充分混匀，反复吹打以机械力离散细胞团块，过40 μ m细胞筛，获得单细胞悬液； 再次离心后用含20% FBS的DMEM调整细胞浓度为IX 14个/ml，接种于75cm2培养瓶，置于5% CO2、饱和湿度37 °C恒温培养箱中培养，8 — 12d达70%汇合时，即按1:3传代； 52.低氧条件的模拟 用2% 02and 2% FBS的低氧和低血清模拟体内缺血状态24_48h，其中低氧状态由气体混配器实现，即通过二氧化碳、空气、氮气流量计，使二氧化碳、空气、氮气按所需比例混配至低氧盒，在低氧盒中的氧浓度由氧浓度仪监测； 53.侧群细胞检测与分选，包括以下子步骤: S3-1，细胞预制:第二代人恒牙牙髓细胞经过24-48h体外缺血培养，胰酶消化后，用37 °C含2 %胎牛血清DMEM重悬后计数；调整细胞悬液浓度约为I X 16个/ml，加入50ml离心管，分别设实验组和对照组；两组均加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为3-5 μ g/ml，对照组还加入ABCG2抑制剂维拉帕米，使终浓度为50 μ M ;37°C水浴避光孵育90min ;孵育过程中每间隔15min摇晃孵育管；孵育结束后，立即4°C离心细胞或冰上急冷后离心，用冰预冷的PBS液重悬细胞；细胞悬液过滤网去除细胞团块，吹打均匀后待上机检测； S3-2，侧群细胞流式检测:预先清洗流式细胞仪内部管道后上样，Hoechst33342用紫外激光激发，450nm边缘长通滤片接受Hoechst蓝光，675nmBP接受Hoechst红光；选取线性信号，做 Hoechst Red 和 Hoechst Blue 二维散点图，将 Hoechst Red 及 Hoechst Blue 弱信号且维拉帕米对照组缺失的区域设定为侧群细胞的门，计算百分比；S3-3，侧群细胞流式分选:细胞预制后上流式机进行细胞分选，在状态良好细胞中收集侧群细胞至含20%胎牛血清的DMEM培养液的离心管，4°C保存；分选完成后100rpm离心5min，小心抽弃上清，以适当的培养基吹匀制成细胞悬液，接种至6孔板，调整细胞浓度至5X 15个/ml，常规培养，获得人牙髓干细胞。
2.根据权利要求1所述的低氧后侧群分选人牙髓干细胞的实验方法，其特征是:所述的步骤S2低氧条件的模拟中，模拟体内缺血状态时间为48h，所述的步骤S3的子步骤S3-1细胞预制中，第二代人恒牙牙髓细胞是经过36h的体外缺血培养。
【专利摘要】一种低氧后侧群分选人牙髓干细胞的实验方法，包括以下步骤：S1恒牙牙髓细胞原代培养；S2.低氧条件的模拟；S3.侧群细胞检测与分选，包括以下子步骤：S3-1，细胞预制；S3-2，侧群细胞流式检测；S3-3，侧群细胞流式分选：细胞预制后上流式机进行细胞分选，在状态良好细胞中收集侧群细胞至含20％胎牛血清的DMEM培养液的离心管，4℃保存；分选完成后1000rpm离心5min，小心抽弃上清，以适当的培养基吹匀制成细胞悬液，接种至6孔板，调整细胞浓度至5×105个/ml，常规培养，获得人牙髓干细胞。本发明侧群分选出的牙髓干细胞具有较高的增殖能力、充足的细胞来源、对供者伤害小和无论理学限制等优点；且低氧培养后可促进人牙髓侧群细胞的表达。
【IPC分类】C12N5-074
【公开号】CN104694465
【申请号】CN201510082165
【发明人】王劲茗, 李俊达, 陈美霖, 李燕玲
【申请人】王劲茗
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月13日