专利名称：利用角朊细胞干细胞和牙髓干细胞进行牙齿再生的技术的制作方法
技术领域：
本发明属于器官再生技术，具体说，本发明涉及利用角朊细胞干细胞和牙髓干细胞进行牙齿再生的技术。
背景技术：
近年来，器官工程学与组织工程学是生物技术领域中发展很快的一门新兴学科。它的发展将使在常规医学技术下无法进行的人体遗传缺陷、组织的修复和器官再生等医学实践成为现实。就器官的组织结构和发育分化过程而言，牙齿是相对比较简单的一种器官。牙齿的发育与其它器官相比有着与众不同的特点，表现在牙齿是人体唯一能在成体中再次发育的器官。从器官发育的角度出发，牙齿的再生要比身体中其它器官的再生更为容易，更有可能实现。
牙齿的发生过程与其它器官的发生相似，也是由牙上皮细胞与其下方的牙间充质之间的相互诱导而发生的。诱导牙齿发生的信号首先出现在上皮，这种信号在上皮中表达是舜时的，随即牙上皮细胞诱导潜能转移到其下方的间充质中。
目前的研究表明，在体外利用牙上皮与牙间充质进行组织重组或重聚，经培养能形成牙齿。利用牙上皮和牙间充质虽能进行再生牙齿，但牙上皮和牙间充质来源有限，极大地限制了牙齿再生技术的应用。在进行人的牙齿再生时，临床上也不允许使用人胚来源的牙上皮和牙间充质。
干细胞是一种能不断自我更新，具有多种发育潜能，存在于胚胎、成体器官或组织中的未分化或分化程度很低的细胞。在研究中发现，人类牙髓干细胞能发育分化形成类似成牙细胞(odontoblast-like)的细胞，并产生牙本质结构。角朊细胞干细胞(keratinocyte stem cell，KSC)则是一种位于表皮基底层的成体干细胞，其作用是维持表皮的终生更新。
2002年，任少强等(任少强等，第三军医大学学报，2002年11期)和李建福等(李建福等，解放军医学杂志，2002年5期)公开了成熟的角朊细胞干细胞的大量培养技术；本发明提供了牙髓干细胞分离和体外培养技术，使本技术领域的同行利用角朊细胞干细胞和牙髓干细胞进行牙齿再生成为可能。本发明也正是利用实验室可大量培养的角朊细胞干细胞和牙髓干细胞分别替代牙上皮与牙间充质进行牙齿再生，克服了牙齿再生中材料来源不足的问题。
本发明的目的是利用材料来源极为丰富的角朊细胞干细胞替代牙上皮和牙髓干细胞替代牙间充质进行牙齿的再生。角朊细胞干细胞和牙髓干细胞可通过体外大量培养产生，因此，材料来源极为丰富。
发明内容
为实现本发明的目的而采用的技术方案如下1、牙髓干细胞的分离和体外培养取臼牙，在无菌条件下切断牙齿，暴露牙髓腔，取出牙髓组织，牙髓组织经消化酶消化40-60min，转入培养液培养24h后，用PBS洗涤三次，去除未贴壁的细胞。贴壁生长的细胞继续培养，每隔三天换一次培养液，培养至14-16天后，进行传代培养。细胞传至第3-5代，收获牙髓干细胞，直接用于牙齿再生或放入液氮中冻存备用。
2、牙髓干细胞成牙能力的诱导从牙髓中分离出的牙髓干细胞需经特定的生长因子诱导后才具有牙齿发育潜能，特定的生长因子是BMP4和FGF10(属于商业化产品，可在各生物制品、生化制品有限公司直接购买获得)。取步骤1中培养的牙髓干细胞1.0-5.0×105个，4000rpm离心5min，形成细胞团块。将细胞团块置于组织培养皿内，并向培养皿中添加分别含有100ng/ml BMP4和FGF10的培养液，置于37℃ 5％ CO2培养箱中培养24h。
3、角朊细胞干细胞与具有牙齿诱导能力的牙髓干细胞重组体外培养的角朊细胞干细胞经中性蛋白酶(dispase)消化后，切成小块，取一小块覆盖在步骤2中的牙髓干细胞上，形成重组团块。
4、重组团块的体外培养和移植将重组团块置于组织培养皿中，向组织培养皿内加入重聚团块三分之一高度的含10-20％胎牛血清的DMEM培养液，并置于37℃ 5％ CO2培养箱中培养24h，再移植到同种生物口腔内，经培养10-12周后，移植的重聚团块在口腔内形成牙齿。
本发明中，牙髓干细胞的分离和体外培养的培养液组成是含10-20％胎牛血清、20mM L-谷氨酰胺、0.1mM维生素C、100ug/ml的链霉素、100单位/ml青霉素的α-MEM。消化液含3mg/ml的I型胶原蛋白酶和4mg/ml中性蛋白酶。PBS由10mM磷酸缓冲液、2.7mM KCl和137mM NaCl组成，pH为7.4。牙髓干细胞成牙能力诱导的培养液为含100ng/ml BMP4、100ng/ml FGF10、10-20％胎牛血清的DMEM。重组团块体外培养的培养液是含10-20％胎牛血清的DMEM。
本发明可应用于哺乳动物牙齿的再生，特别是人类牙齿的再生。例如利用人角朊细胞干细胞和牙髓干细胞做成的重组团块移植到人的口腔内培养，将能进行人的牙齿再生。
本发明的优点在于利用角朊细胞干细胞和牙髓干细胞进行牙齿再生，角朊细胞干细胞和牙髓干细胞可根据公开的技术手段通过体外大量培养得到，大大扩大了材料的来源，方便推广使用。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例对本发明做进一步的说明。实例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明范围。
实施例1.牙髓干细胞的分离和体外培养取牙科中拔弃的人的臼牙，在无菌条件下切断牙齿，暴露牙髓腔，用吸管取出牙髓组织。在消化液(含3mg/ml的I型胶原蛋白酶和4mg/ml中性蛋白酶)中，37℃下，消化50min。将消化后的牙髓组织用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，置于10cm细胞培养皿进行培养。培养液成分为含15％胎牛血清、20mM L-谷氨酰胺、0.1mM维生素C、100ug/ml的链霉素、100单位/ml青霉素的α-MEM。在37℃ 5％ CO2的培养箱中培养24h后，用PBS(10mM磷酸缓冲液，2.7mM KCl 137mMNaCl pH7.4)洗涤三次，去除未贴壁的细胞。贴壁生长的细胞继续培养，每隔三天换一次培养液，培养至14-16天后，进行传代培养。传代培养时，将培养皿中的培养液用真空吸管吸去，贴壁的细胞用0.25％(w/v)胰蛋白酶37℃消化5min后，吸去胰蛋白酶液，并向细胞培养皿中加入新鲜的培养液，用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，以10个细胞/cm2的密度进行接种，接种后置于37℃ 5％ CO2的培养箱中培养。传代细胞经培养14-16天后，可继续传代培养。
2、牙髓干细胞成牙能力的诱导取传代培养的牙髓干细胞1.0-5.0×105个，4000rpm离心5min，细胞形成团块。小心取出细胞团块置于滤膜(0.22um Millipore滤膜)中，将滤膜转移到组织培养皿中的金属网架上，并向组织培养皿内添加含100ng/ml BMP4、100ng/ml FGF10、10-20％胎牛血清的DMEM培养液，培养液的量以没过细胞团块的1/3体积为宜，组织培养皿的外槽添满PBS。将组织培养皿置于37℃ 5％ CO2的培养箱中培养24h。
3、角朊细胞干细胞与牙髓干细胞重组向培养成片状的角朊细胞干细胞中加入3U/ml中性蛋白酶，并于37℃消化10-15min，用10％胎牛血清的DMEM终止消化。将已消化成的角朊细胞干细胞切成3×3mm大小的小块，将其中一小块角朊细胞干细胞转移到步骤2中经生长因子BMP4和FGF10诱导后具有牙齿发育潜能的牙髓干细胞团块上，注意应使角朊细胞干细胞片层尽量展开以覆盖牙髓干细胞团块。
4、重组团块的体外培养向含有重组团块的组织培养皿中加入10-20％胎牛血清的DMEM培养液至没过重组团块的1/3体积为止，组织培养皿的外槽添满PBS。将组织培养皿置于37℃ 5％ CO2的培养箱中培养24h。
5、重组团块的移植将步骤4中培养24h的重组团块移植到缺损的牙床部位，缝合。让重组团块在裸鼠(模式动物)口腔内生长10-12周，重聚团块将形成牙齿。
权利要求
1.一种牙齿再生技术，其特征在于该技术包括如下步骤I、牙髓干细胞的分离和体外培养从臼牙中取出牙髓组织，经消化液消化40-60min、转入培养液培养24h后，用PBS洗涤三次，取贴壁生长的细胞继续培养至14-16天；II、牙髓干细胞成牙能力的诱导取体外培养的牙髓干细胞1.0-5.0×105个，4000rpm离心5min，形成细胞团块，将细胞团块置于组织培养皿内，向培养皿中添加诱导培养液，并置于37℃5％CO2培养箱中培养24h；III、角朊细胞干细胞与牙髓干细胞重组体外培养的角朊细胞干细胞经中性蛋白酶消化后，切成小块，取一小块覆盖在步骤2中的牙髓干细胞上，形成重组团块；IV、重组团块的体外培养和移植将重组团块置于组织培养皿中，向组织培养皿内加入重组团块三分之一高度的含10-20％胎牛血清的DMEM培养液，并置于37℃5％CO2培养箱中培养24h，再移植到同种生物口腔内，经培养10-12周后，移植的重聚团块在口腔内形成牙齿。
2.据权利要求1所述的牙齿再生技术，其特征在于牙髓干细胞的分离和体外培养的培养液是含有10-20％胎牛血清、20mM L-谷氨酰胺、100μM维生素C、100μg/ml的链霉素、100u/ml青霉素的α-MEM。
3.权利要求1所述的牙齿再生技术，其特征在于牙髓干细胞成牙能力的诱导的培养液是含100ng/ml BMP4、100ng/ml FGF10、10-20％胎牛血清的DMEM。
4.权利要求1所述的牙齿再生技术，其特征在于重组团块体外培养的培养液是含10-20％胎牛血清的DMEM。
5.根据权利要求1所述的牙齿再生技术，其特征在于消化液含3mg/ml的I型胶原蛋白酶和4mg/ml中性蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的牙齿再生技术，其特征在于PBS由10mM磷酸缓冲液、2.7mM KCl和137mM NaCl组成，pH为7.4。
7.根据权利要求1所述的牙齿再生技术，其特征在于进行传代培养时贴壁生长的牙髓干细胞用0.25％(w/v)胰蛋白酶消化5min。
全文摘要
本发明属于器官再生技术，具体说，本发明涉及利用角朊细胞干细胞和牙髓干细胞进行牙齿再生的技术。本发明的技术方案从臼牙中取出牙髓组织，经消化酶消化后，转入培养液中培养；培养24h后，用PBS洗涤三次，去除末贴壁细胞，贴壁生长的细胞继续培养至14－16天时，进行传代培养；牙髓干细胞经生长因子BMP4和FGF10诱导24h后将体外培养的角朊细胞干细胞和牙髓干细胞进行重组，形成重组团块；将重组团块置于37℃5％CO
文档编号A61K6/02GK1587393SQ20041007172
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月15日 优先权日2004年7月15日
发明者张彦定, 陈一平, 黄义德 申请人:福建师范大学