牙髓干细胞的规模化生产工艺的制作方法

牙髓干细胞的规模化生产工艺的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种牙髓干细胞的规模化生产工艺，包括以下步骤：（1）牙髓干细胞的分离提取；（2）牙髓干细胞的二维培养扩增；（3）牙髓干细胞的检测；（4）牙髓干细胞的大规模培养；（5）牙髓干细胞的冷冻保存；（6）牙髓干细胞的长期冷冻保存。本发明提供了一种牙髓干细胞的体外规模化培养扩增方法，建立了高质量高活性牙髓干细胞的长期、标准化、系统化冻存体系，以便为临床及科研提供足够高质量的干细胞资源，成本低廉，应用前景广阔。
【专利说明】牙髓干细胞的规模化生产工艺
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学工程领域，具体涉及干细胞的培养扩增及冷冻保存方法，更具体涉及牙髓干细胞的规模化生产工艺。
【背景技术】
[0002]1999年，《Science》将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界十大科技进展之首，2000年，《Time》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首，并认为胚胎干细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。至此干细胞研究成为近年来生物学以及医学领域中最引人注目的热点之一。干细胞是在生物个体的生长和发育中起“主干”作用的原始细胞，是一种具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。虽然胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但这种分化是"非定位性"的，而且存在伦理道德等方面的问题。成体干细胞则不存在着伦理、法律、免疫排斥反应等问题，同时具有取材方便、来源广等优点，因而，成体干细胞在组织工程、基因治疗及个体化治疗的研究中具有较好的临床应用前景。
[0003]由于各种原因导致的牙体缺损和牙齿缺失已成为危害口腔乃至人体健康的一种普遍存在的疾病，其发病率呈逐年增加的趋势。目前主要借助于各种牙科材料填充来应对牙齿缺损疾病，虽然在一定程度上能阻止病变的继续发展，但不能解决根本问题。对于牙齿缺失，尽管解决途径很多，但最有效和最根本的办法还是牙齿的生物性再生。
[0004]随着组织再生医学的快速发展，为牙体缺损和牙齿缺失的有效治疗带来了希望。目前已有许多研究利用牙源性上皮和牙源性间充质的相互作用再生出了牙齿组织。常用的牙源性间充质包括牙乳头细胞和牙髓组织细胞。由于牙乳头细胞在临床上难以获得，因此目前用于牙体及牙齿再生的种子细胞首选牙髓组织来源的细胞，其中最主要的是牙髓干细胞。
[0005]2000 年首次发现了牙髓干细胞(S.Gronthos, M.Mankani, J.Brahim, P.GehronRobey, and S.Shi, Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs)invitro and invivo, Proc Natl Acad Sci USA.2000 December 5; 97 (25): 13625-13630.)。牙髓干细胞是一类具有高增殖能力、高度自我更新能力、多向分化能力等干细胞特性的细胞，因此是构建牙体及牙齿组织的理想种子细胞。已有研究利用该细胞构建牙髓、牙本质以及牙齿组织。
[0006]牙髓干细胞的发现，为牙齿组织工程学带来了突破性的进展。但同其它组织的工程学一样，作为种子细胞的牙髓干细胞的快速获取和快速扩增，是牙齿组织工程学发展的一个瓶颈。
[0007]在牙髓干细胞临床应用过程中，目前突出的问题是一次成功的治疗需要一定数量的细胞，这意味着如何在短时间内获得大量有效高活性的细胞以提供给病人使用是一个很关键的问题。因此，体外大量扩增牙髓干细胞的研究越来越受到研究人员和临床医生的重视。目前已经出现了一些扩增干细胞的方法和装置，但是传统的二维平面扩增干细胞方法，较难在短时间内得到足够的细胞量，而且多次的传代次数会造成干细胞质量降低，相对于强大的临床需求，其数量也远远不够。
[0008]而另一方面，从乳牙到恒牙替换，阻生牙、多生牙的拔除及畸牙校正，大量的牙齿被废弃，其中的牙髓干细胞资源白白流失。因此，发明一种牙髓干细胞长期冷冻保存的方法同样具有重要意义。
[0009]传统的贴壁依赖性细胞的培养采用静止或者转瓶等培养方法，操作复杂，耗费空间及人力。1967年，Van Wezel首次提出了“微载体系统”的概念，为贴壁依赖性细胞的高密度培养提供了思路，并创建了生物反应器微载体培养细胞工艺，使动物细胞培养进入高密度培养阶段微载体是指由交联葡聚糖或者其他聚合物组成微珠，直径一般在60-200 μ m之间，适用于贴壁依赖性细胞的生长。使用此类小球为细胞提供贴附面积，通过轻轻搅拌使载体悬浮于培养液中，细胞也成为了悬浮状态，这种培养方式被称为微载体培养技术。目前使用的微载体有商业化的 Cytodex l/3、Cultispher G/S、Biosilon、Hillex 和 HyQSp,以及自制的纤维素、陶瓷、壳聚糖、胶原、明胶、PCL、PLA、PLGA等。由于微载体本身所占体积和质量不大，但有很大的有效面积可供细胞附着，因而大大提高了生产效率。比如5mg CytodexI表面积能达到30cm2/mL，而传统的单层培养难以达到如此高的表面积/容积比。IL微载体培养生产的细胞相当于50个转瓶所生产的细胞。这种培养方式对劳动力的需求也下降了许多，省却了玻璃容器等的清洗和准备工作；细胞与培养液的分离简单，一旦搅拌停止，3min后细胞即能依靠其重力而沉降，无需进行离心操作，减少了复杂的操作步骤。而且，细胞生理活性培养参数等容易控制，污染概率也大大降低。
[0010]大规模干细胞培养过程中的主要障碍包括供养限制，副产物积累，更加智能的过程控制，动物细胞对机械剪切力的极度敏感等问题。
[0011]干细胞临床治疗需要大量高活性的干细胞，所以如何在体外短期内培养足够数量的高质量的治疗用细胞以及提供一个规模化、标准化、系统化的细胞储存系统成为了学术界和产业界密切关注的焦点，目前关于这一方面的研究也刚刚起步。
[0012]发明概述
[0013]本发明针对现有作为种子细胞的牙髓干细胞的快速获取、扩增与长期保存难等问题，寻找一种更为高效的培养扩增及长期保存方法。本发明使用生物反应器微载体培养牙髓干细胞技术大量扩增干细胞，并建立了牙髓干细胞的标准化，系统化冻存体系，解决了这类资源得不到重复利用的现状，并建立了长期高质量储存牙髓干细胞的细胞库以方便为临床以及科研提供足够高质量的干细胞资源，成本低廉，应用前景广阔。
[0014]本发明提供的牙髓干细胞的规模化生产工艺包括如下步骤:
[0015](I)牙髓干细胞的分离提取:将牙髓组织用胶原酶消化后，在含胎牛血清细胞培养液的培养器皿中进行，于37°C、5% CO2条件下培养，3天换液；
[0016](2)牙髓干细胞的培养扩增:将步骤(1)培养所得的原代细胞以
0.1X IO5-L OX IO5个细胞/cm2的密度接种于二维培养器皿中，加入新鲜细胞培养液，于37°C>5% CO2条件下培养，3天换液；
[0017](3)牙髓干细胞的检测:进行细胞活性检测、无菌性检测和流式细胞检测；
[0018](4)牙髓干细胞的大规模培养:采用转瓶培养或生物反应器培养，将牙髓干细胞接种在转瓶或生物反应器中后，调整溶解氧浓度、PH值、搅拌转速和通气量，根据取样分析细胞计数、存活率、营养成分和代谢物的结果更换培养基，从而达到细胞的高密度大规模培养;
[0019](5)牙髓干细胞的冷冻保存:将检测合格的细胞冻存于管内，细胞的详细信息扫描入数据管理系统，自动化系统根据液氮情况自动寻找空缺位置，将细胞冻存于相应的空格中；
[0020](6)根据需要，进行牙髓干细胞的长期冷冻保存，保存期间定期从冻存环境中取出细胞进行复苏检测。
[0021]步骤(1)中，牙髓组织是在无菌条件下挑选的，用缓冲液冲洗后剪碎；牙髓组织的消化采用5~10倍体积的0.1%~0.6%胶原酶，于37°C培养箱中振荡培养3(Tl80min后用含胎牛血清的细胞培养液终止消化，所述细胞培养液商品化的含10-20%胎牛血清的α -MEM、DMEM培养基及无血清培养基。这些细胞培养液中含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。
[0022]步骤(1)中的培养步骤包括将经消化的牙髓组织在80(Tl500r/min离心3~10min后弃上清、加5~10倍体积细胞培养液重悬细胞，转入培养器皿中进行培养，所述细胞培养液商品化的含10-20%胎牛血清的a-MEM、DMEM培养基以及无血清培养基。这些细胞培养液中含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。
[0023]步骤(2)中，原代细胞在长满培养器皿底部80%_90%时用胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱离原代培养器皿后接种于二维培养器皿。所述二维培养器皿可选自细胞培养孔板、培养皿和组织培养方瓶。
[0024]步骤(4)中所述的转瓶培养按以下过程进行:将微载体经预处理、转瓶硅化、121°C高温灭菌后，接种细胞，微载体加入量为2-10g/L，大小范围为60-300 μ m,接种密度为3X 104-3X 105个细胞/ml，转瓶的大小范围为25ml_500ml，转速范围50_75rpm。
[0025]步骤(4)中所述·的生物反应器选自细胞培养生物反应器，包括搅拌式生物反应器、固定床生物反应器、WAVE生物反应器等。
[0026]本发明的生产工艺中，所使用的搅拌式生物反应器、WAVE生物反应器按以下过程进行细胞培养:将微载体用PBS冲洗2次，第三次加入PBS放入4°C冰箱内平衡水化过夜，高压蒸汽灭菌后，接种牙髓干细胞，微载体的加入量为3-10g/L，接种密度为I X IO5-1O6个细胞/mL，细胞扩增至密度为5X 105-2X 107个细胞/mL。本发明的生产工艺中，所使用的固定床生物反应器按以下过程进行细胞培养:在生物反应器中加入经表面处理切割好的聚酯切片作为细胞载体，并加入磷酸缓冲液，高温蒸汽灭菌后加入细胞培养液，接种牙髓干细胞，其中聚酯纤维载体的使用量为每升罐体积25-45g，接种密度为IXlO5-1O6个细胞/mL，细胞扩增至密度为5 X 105-2 X IO7个细胞/mL。上述生物反应器培养条件所述溶解氧浓度为 40%-60%、pH 值为 7.0-7.2、搅拌转速为 50_100rpm。
[0027]本发明的生产工艺中，步骤(5)中输入的细胞详细信息包括供者姓名、细胞代数、细胞培养液成分和浓度、细胞接种密度、冻存液成分和冻存日期；所述冷冻保存包括将所获得的牙髓干细胞按I X IO6^l X IO7个/ml细胞密度在冻存液中重悬，分装入冻存管，经过程序降温后，将冻存管转移至_196°C液氮中冷冻保存。所述冻存液包含DMS0、胎牛血清和a -MEM培养液1:2:7 (体积比)。
[0028]根据需要，进行牙髓干细胞的长期冷冻保存，保存期间定期从冻存环境中取出细胞进行复苏检测。[0029]发明详述
[0030]下面详细描述本发明的牙髓干细胞规模化生产工艺。
[0031]一、牙髓干细胞的分离提取
[0032]将供体新鲜牙齿组织采用含抗生素的缓冲盐溶液完成转移，在无菌条件下挑选牙髓组织并用缓冲液冲洗；将挑选出的牙髓组织剪碎，加入5^10倍的0.1%~0.6%胶原酶作为消化液，用吸管吹散均匀，置于37°C培养箱中振荡培养3(Tl80min。消化完成后，在悬液中加入含15%胎牛血清的a -MEM培养液终止消化，在80(Tl500r/min离心5~lOmin，弃上清后，加入5^10倍体积的含15%胎牛血清的a -MEM培养液重悬细胞，转入培养器皿中进行原代培养。
[0033]二、牙髓干细胞的培养扩增
[0034]当原代细胞长满器皿底80~90%，用含0.25%EDTA的胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱离后，采用不同的培养方式重新接种，并加入细胞培养液，在恒温培养箱中培养扩增。
[0035]当采用二维培养器皿进行牙髓干细胞培养扩增时，根据培养容器的底部表面积及原代细胞的数量，将原代细胞以0.1 X IO5-L O X IO5个细胞/cm2的密度接种于二维培养器皿中，加入细胞培养液(例如含15%胎牛血清的a -MEM培养液)于37°C、5%C02条件下培养，3天换液。
[0036]二维培养器皿常见的有各种细胞培养孔板、Petri培养皿、组织培养方瓶等。
[0037]三、牙髓干细胞的检测
[0038]在牙髓干细胞 提取之后，进行细胞活性检测、无菌性检测、流式细胞检测等。
[0039]细胞活性检测，包括在显微镜下观察细胞生长情况，将细胞接种于24孔板内，用cck-8法制作细胞生长曲线。
[0040]无菌性检测，收集培养过细胞的培养液，在25°C、37°C的生化培养箱内培养后在显微镜下观察进行真菌、细菌检测。
[0041]流式细胞检测，检测细胞的特异性，包括间充质干细胞特异性表面标志物StiO-1、⑶29、⑶44、⑶71、⑶90、⑶106、CD 120等，以及其它系细胞表面标志物，如如⑶14、⑶34、CD45 等。
[0042]四、牙髓干细胞的大规模培养
[0043]采用转瓶培养或生物反应器进行牙髓干细胞的大规模培养，在培养过程中，应调整溶解氧浓度、PH值、搅拌转速和通气量，根据取样分析细胞计数、存活率、营养成分和代谢物的结果更换培养基，从而达到细胞的高密度大规模培养。
[0044]反应器培养的一个主要问题就是溶氧限制，培养基中的氧气的溶解度很低(7.6 μ g/ml)，典型密度2X 106/ml培养的细胞在不到Ih的时间内就会耗尽培养基中的氧气，因此必须在培养周期内不断向培养基中通入氧气。通过控制空气、氮气、二氧化碳、氧气的比例维持培养液中的溶解氧在一个合适的水平供细胞消耗。培养过程中通过搅拌一方面使细胞悬浮于培养基中，另一方面可以促进液体混合传质，提高供氧能力。细胞代谢的副产物积累会影响培养液的PH值从而影响到细胞生长，所以需要通过分析培养基成分控制添加新鲜培养基的速率，以提供给细胞一个良好的营养环境。
[0045]转瓶培养扩增的过程包括:将微载体经预处理、转瓶硅化、121°C高温灭菌后，接种细胞，微载体加入量为2-20g/L，接种密度为3X 104-3X IO5个细胞/ml，转瓶的大小范围为25ml-500ml，微载体的大小范围为60-300 μ m，转速范围50-75rpm/min，培养方式是分批培养。
[0046]生物反应器培养扩增的过程包括:①微载体的预处理:将微载体用PBS冲洗2次，第三次加入PBS放入4°C冰箱内平衡水化过夜，高压蒸汽灭菌；②将转瓶或大量二维平皿扩增培养的牙髓干细胞用含15%胎牛血清的a-MEM培养液制成细胞悬液，接种在微载体上，反应器的体积为3-10L，微载体的加入量为3-10g/L，接种密度为I X IO5-1O6个细胞/mL，细胞培养扩增至密度为5X 105-2X IO7个细胞/mL ;③用含EDTA的胰酶收获所扩增的牙髓干细胞，进行后续检测。
[0047]生物反应器培养扩增可以是一级生物反应器培养，也可以是多级培养。在一级生物反应器中细胞生长到一定程度时，根据对细胞数量的要求可进行下一级细胞放大培养，即将微载体上的细胞完全消化之后作为种子细胞接种下一级生物反应器或者直接添加新的微载体进行球转球放大培养。
[0048]生物反应器可选自搅拌式生物反应器、固定床生物反应器、波浪式(wave)生物反应器等，以及其他各种形式和基于各种原理的细胞体外大规模培养系统或装置。
[0049]搅拌式生物反应器主要是通过搅拌器转动来搅动培养液以增加传质能力，确保细胞培养的氧浓度和营养物质的均一性，达到大规模培养细胞的目的，同时使培养液对细胞施加一定的剪应力。目前在医学组织工程研究中最常用的是搅拌瓶反应器。其主要特点是采用磁力转子搅动培养液，把干细胞接种在磁力搅拌的培养液中，细胞在持续搅动的培养液中生长。搅拌式生物反应器的最大优点是，能培养各种类型的动物细胞，培养工艺容易放大，产品质量稳定，非常适合于工厂化生产。
[0050]固定床生物反应器内部填充片状载体，使细胞贴服生长，通过连续灌注新鲜培养液使细胞达到较高密度，培养过程中，细胞营养充足，代谢废物能及时去除，为细胞生长提供一个良好的环境。使用的片状载体包括NBS公司的聚酯纤维等一切可以利于细胞贴服生长的材料。
[0051]WAVE生物反应器是一次性使用的波浪袋生物反应器，用以替代传统的不锈钢发酵罐。一次性反应器适用于各种类型的细胞培养。温和的波浪式运动可以起到良好的供氧和混合的目的，同时，这种运动方式所产生的剪切力也很小，远远小于传统罐体中用搅拌或者气升式方法所产生的剪切力；能够支持高密度大规模细胞培养，并且不会形成泡沫和剪切力的破坏作用。
[0052]采用以上生物反应器进行细胞培养的模式包括分批培养模式、间歇式培养模式和连续灌注式培养模式。
[0053]分批培养模式是将压碎干细胞和培养液一次性装入生物反应器内进行培养，细胞不断生长、大量扩增，经过一段时间之后，将这个反应系统取出，消化得到高质量的牙髓干细胞。
[0054]间歇式培养模式采用间歇式生物反应器，在反应器中加入培养液，进行灭菌后，接入细胞株，在维持适合细胞生长和产物生成的条件下进行细胞培养，反应过程中除需要通入一定量的无菌空气、消泡剂和酸碱外，一般不再加入培养基和培养物，也不取出产物，只有等反应进行到一定程度后，才全部将培养液放出，进行后处理。[0055]连续灌注式培养模式，在连续灌注式生物反应器系统中安装细胞微载体截留装置，将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养。一方面新鲜培养液不断加入反应器内；另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。连续灌注式生物反应器可以对细胞的微环境进行更为精确的监测和控制，既省时省力，又减少了细胞发生污染的机会，培养细胞的密度及质量可以得到很大提高。
[0056]五、牙髓干细胞的冷冻保存
[0057]细胞收获之后，用培养液反复吹打细胞，混匀，送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测，支原体检测，病毒检测，免疫表形检测，细胞技术和活力测定，生物学效力检测，细胞分化能力检测以确定其是否到达合格标准。经过检测符合标准的牙髓干细胞按I X IO6~I X IO7个细胞/ml的密度在冻存液DMS0、胎牛血清和a-MEM培养液1:2:7中重悬，分装入冻存管。
[0058]填写细胞的详细信息，包括供者姓名、细胞代数、细胞培养液成分和浓度、细胞接种密度、冻存液成分和冻存日期等，完整记录每一样本的真实冷冻状况，冻存管上的信息感应部位对准扫描仪器，将信息准确无误地扫描入数据管理系统，完成细胞库信息录入和构建。
[0059]各冻存管经过程序降温后，转移至_196°C液氮中冷冻保存。系统根据液氮情况自动寻找空缺位置，将细胞冻存于相应的空格中。
[0060]冻存空间应符合国家相关文件规定，具有良好的卫生环境，包括洁净区、通风、采光环境。
[0061]冻存期间定期从冻存环境中取出细胞进行检测。定期检测的内容包括细胞复苏、细胞活性检测。
[0062]本发明提供的牙髓·干细胞规模化生产工艺建立了牙髓干细胞大量扩增方法，并建立了牙髓干细胞的标准化、系统化冻存体系，建立了长期高质量储存牙髓干细胞的细胞库，以便为临床及科研提供足够高质量的干细胞资源，成本低廉，应用前景广阔。
[0063]本发明的牙髓干细胞规模化生产工艺中尤其使用了生物反应器微载体培养技术大量培养干细胞。与传统的培养方法相比，本发明的方法具有以下优点:
[0064](I)微载体表面积/体积比大,单位体积培养细胞的产率高。较传统的单层细胞培养面积大大增加，可以在短期内大量得到牙髓干细胞；
[0065](2)微载体悬浮于培养基中，牙髓干细胞生长环境均一，简化了培养条件的监测和控制，同时培养基利用率高；
[0066](3)采样重演性好，细胞最终收获过程不复杂，劳动强度小，占用空间小，操作简便，所需人员少，工艺容易放大生产，可以保证细胞质量；
[0067](4)细胞培养系统符合最新的法规标准，安全性更好。
[0068]同时，本发明的牙髓干细胞规模化生产工艺中尤其采用了标准化、系统化的牙髓干细胞长期冻存方法。干细胞通过体外大规模扩增后，按照标准化流程冻存，冻存空间具有良好的卫生环境，包括洁净区，通风，采光环境，符合国家相关文件规定。同时，详细记录的细胞信息以备未来科研和临床使用。
[0069]本发明的牙髓干细胞规模化生产工艺不仅能大大增加牙髓干细胞作为种子细胞的数量，而且能够长期保持其生长与分化的能力，冷冻复苏后也能够保持其干细胞的基本特性，经过冷冻保存后能够为未来的临床以及科研提供大量的牙髓干细胞资源。
【专利附图】

【附图说明】
[0070]图1是本发明牙髓干细胞规模化生产工艺的流程图。
【具体实施方式】
[0071]以下用实验例对本发明作进一步阐述。本【技术领域】普通技术人员应当认识到，这些实验例仅仅用于举例说明本发明而不对本发明的范围构成任何限制，对本发明所作的任何改变，只要不违背本发明的精神实质，都将落在权利要求范围内。
[0072]实例中的操作均在严格无菌环境下进行，为保证细胞不受污染，在所有使用的磷酸盐缓冲液、细胞培养液中均加有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。
[0073]实施例1、牙髓干细胞分离提取[0074]将供体新鲜牙齿组织采用含抗生素的PBS溶液完成转移，在无菌条件下挑选出牙髓组织并用PBS缓冲液冲洗；将挑选出的牙髓组织剪碎，加入10倍体积的0.3% I型胶原酶，用吸管吹散均匀，置于37°C振荡培养箱中振荡培养120min ;完成消化后，在悬液中加入含15%胎牛血清的a -MEM培养液，终止消化，在1000r/min离心5min，弃上清后，加入5倍体积的含15%胎牛血清的a -MEM培养液重悬细胞，转入6孔板中进行，于37°C、5%C02条件下培养，3天换液。
[0075]实施例2、牙髓干细胞的二维培养器皿培养扩增(二维培养器皿包括细胞培养孔板、培养皿、组织培养方瓶)，本实施例采用的是平皿培养。
[0076]当细胞长满平皿的80%时，弃去原培养液，用PBS洗涤2遍，加入覆盖皿底量的
0.25%含有EDTA的胰蛋白酶，消化3-4min，期间不间断用倒置显微镜观察，见胞质回缩，细胞间隙增大，细胞变圆，立即加入与胰酶等体积的细胞培养基终止消化，用吸管反复吹打贴壁细胞，将细胞吹打下来，1000r/min离心5min，再用细胞培养液重悬细胞，按照密度为6X IO4个细胞/ml，接种到平皿中，加入新鲜细胞培养液于37°C、5%C02条件下培养，3天换液。即可得到2 X IO5个细胞/ml细胞，细胞数量扩增3倍。
[0077]实施例3、牙髓干细胞在含微载体的转瓶中培养扩增
[0078]在本实施例中使用的是含有微载体的转瓶培养扩增细胞，转瓶工作体积为125ml，微载体为Cytodex-3。
[0079]①转瓶预处理:125ml转瓶清洗干净，烘干至完全干燥，20ml加入硅化液(Sigmacote, Sigma)于转瓶中，缓慢旋转转瓶使娃化液浸润瓶壁，吸去娃化液后，将转瓶置于通风处风干12h，蒸馏水冲洗备用；
[0080]②微载体预处理:本实施例中微载体密度定为2g/L，由于培养体积为50ml，因此称取0.lgCytodex-3转瓶中，加入20ml PBS浸泡3h，吸去后加入20ml新的PBS，121 °C高压蒸汽灭菌20min，吸去PBS并加入20ml含15%胎牛血清的a -MEM培养液，37°C浸泡过夜；
[0081]③牙髓干细胞的接种:取4平皿生长至80%融合的牙髓干细胞，0.25%胰酶-EDTA消化后，以15%胎牛血清的培养液终止消化，1000rpm离心5min，新鲜培养液重悬，以4X IO4个细胞/ml的密度接种在三维微载体上。将含有8 X IO6个细胞的悬液加入含有Cytodex-3的转瓶中，再分别补足培养液至25ml，置于Wheaton磁力搅拌器上间歇搅拌，间歇搅拌条件为45rpm搅拌2min，停止13min，如此循环3h，37°C，5%C02。接种结束后，分别补入25ml培养液至50ml最终工作体积，转速调整为55rpm，每2天更换2/3培养液直至培养结束。
[0082]④牙髓干细胞的获取:停止转瓶内的搅拌，弃去上清液，0.25%胰酶-EDTA消化后，以15%胎牛血清的培养液终止消化，1000rpm离心5min，新鲜培养液重悬，可得到5.8 X IO5个细胞/ml密度的细胞，细胞数量扩增14.5倍。
[0083]实施例4、搅拌式生物反应器培养扩增牙髓干细胞
[0084]用平皿或转瓶小规模培养扩增牙髓干细胞，达到足够的细胞数量。
[0085]连接反应器气路管，进液管，出液管等管路，121°C高压湿热灭菌40min，打入新鲜的细胞培养液，搅拌2天进行培养液检菌。
[0086]微载体的水化过程:称取15g微载体置一干净容器，使用无Ca2+，Mg2+的PBS在室温下水化过夜并不时温和搅拌。弃去上清，加入新鲜的无Ca2+，Mg2+的PBS，温和搅拌后洗涤2次，弃去洗涤的PBS，加入PBS，121 °C高压湿热灭菌20min。
[0087]将预先水化、灭菌的微载体接种到3L培养液中。
[0088]挑选形态健康，生长良好的平皿生产细胞用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，按照6 X IO5个/mL制成细胞悬液，半量接种至反应器中，调节反应器的温度，培养液pH，溶氧等参数，是细胞生长于最适宜环境进行细胞培养。80rpm转3min,静置12min,如此重复12个循环，结束后接种剩余细胞，以IOOrpm的转速连续培养。
[0089]采用灌注模式进行培养，溶氧是细胞代谢中的重要参数，它可以影响细胞的产率，所以需要时时观测调节溶氧量维持在50%，此过程可通过计算机有序定量地控制加入动物细胞培养罐内的空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体的流量使其保持最佳的比例来实现。
[0090]计算机实时自动将反应器温度控制在37±0.2°C,pH:7.0-7.2。
[0091]细胞接种第2天，根据细胞的生长汇合情况判断是否进行灌注培养及灌注体积，一般灌注体积为反应器I个工作体积，之后可控制在l_2vvD。
[0092]每天取样观察拍照，计算细胞数目。当细胞长满微载体表面，数目达到约5.4 X IO6个/mL时，停止培养。
[0093]通过反应器的微载体/细胞截留装置将高压液体排出，加入500mLPBS冲洗2_3次，IOOmL胰酶/EDTA加入罐子，消化20min，加入等体积培养液终止消化，收获细胞，细胞数量扩增9倍。
[0094]实施例5、固定床式生物反应器培养扩增牙髓干细胞
[0095]①米用美国BBA Fiberweb的Reemay公司(Old Hickory, TN, USA)生产的无纺布聚酯类纤维(Non Woven Polyester Fabric), N0.2214型,经表面处理并切割成直径为6mm的圆形小片体。
[0096]②细胞生物反应器选择的是购买自美国NBS公司的5L生物反应器CelligenPlus,工作体积3.5L，采用固定床篮式搅拌系统。在生物反应器中加入上述处理切割好的直径为6mm的圆形聚酯切片作为细胞载体，并加入磷酸缓冲液，121°C灭菌30min。灭菌后，排空磷酸缓冲液，加入含15%胎牛血清的a -MEM培养液，并开始控制细胞生物反应器条件。
[0097]③挑选形态健康，生长良好的牙髓干细胞用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，作为细胞生物反应器的种子细胞，以3Χ IO5个细胞/mL的密度接种到生物反应器中的无纺布/聚酯纤维圆形小片载体上，用细胞 培养液进行扩增培养。其中聚酯纤维圆形小片载体的使用量为每升罐体积35g，所使用的细胞培养液为a-MEM培养基加15%胎牛血清。细胞生物反应器培养条件为酸碱度(pH)值7.2，温度37°C，溶氧浓度(DO)为空气饱和的50%，搅拌速度80rpmo
[0098]④每天通过生化分析仪检测葡萄糖和乳酸含量等参数，接种后培养约8天，排空培养液，加入500mLPBS冲洗2_3次后，加入IOOmL胰酶/EDTA，消化20min，加入等体积培养液终止消化，收获细胞，可得到3.8 X IO6个细胞/ml的细胞，细胞数量扩增12.6倍。
[0099]实施例6、WAVE生物反应器
[0100]①采用GE的WAVE Bioreactor系统，它由一个带有一次性塑料细胞培养袋的摇动平台组成，配备CO2气体混合器(C02MIX20)或WAVEP0D?控制塔用于控制pH、温度、氧气和混合。牙髓干细胞在Cellbag-2L的生物反应器中培养。
[0101]②微载体预处理:在用不含Ca2+和Mg2+离子的PBS中洗涤3次后，微载体在121°C高压灭菌15min，并在4°C下无菌保存。微载体先用培养基洗涤并在接种前24h转移到Cellbag中进行平衡。所使用的Cytodex 3量为3g/l。
[0102]③挑选形态健康，生长良好的牙髓干细胞用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，作为细胞生物反应器的种子细胞，以2 X IO5个细胞/ml的密度接种到微载体上，用细胞培养液进行扩增培养。所使用的细胞培养液为a-MEM培养基加15%胎牛血清。细胞生物反应器培养条件为酸碱度(pH)值7.2，温度37°C，溶氧浓度(DO)为空气饱和的50%。
[0103]④每天通过生化分析仪检测葡萄糖和乳酸含量等参数，接种后培养约7天，排空培养液，加入500mLPBS冲洗2_3次后，加入IOOmL胰酶/EDTA，消化20min，加入等体积培养液终止消化，收获细胞。可得2.2 X IO6个细胞/ml密度的细胞，细胞数量扩增11倍。
[0104]实施例7、牙髓干细·胞的冷冻保存
[0105]将平皿中长满至80-90%的牙髓干细胞，去除旧的培养液，用PBS清洗2遍，接着加Λ 0.25%含有EDTA的胰酶37°C消化3min，待细胞全部脱落后，加入等体积的牙髓干细胞培养液终止消化，1000rpm/min离心5min，去除上清，再用干细胞冻存液(含有DMS0、胎牛血清和a -MEM培养液，1:2:7)将细胞重悬，获得的牙髓干细胞悬液加入到细胞冻存管中，置于含异丙醇的程序式降温盒中-80°C过夜，第二天转移到_196°C的液氮中长期保存。
【权利要求】
1.一种牙髓干细胞的规模化生产工艺，包括如下步骤: (1)牙髓干细胞的分离提取:将牙髓组织用胶原酶消化后，在含胎牛血清细胞培养液的培养器皿中，于37°c、5% CO2条件下培养，3天换液； (2)牙髓干细胞的培养扩增:将步骤(1)培养所得的原代细胞以0.1 X IO5-L O X IO5个细胞/cm2的密度接种于二维培养器皿中，加入新鲜细胞培养液，于37°C、5% CO2条件下培养，3天换液； (3)牙髓干细胞的检测:进行细胞活性检测、无菌性检测和流式细胞检测； (4)牙髓干细胞的大规模培养:采用转瓶培养或生物反应器培养，将牙髓干细胞接种在转瓶或生物反应器中后，调整溶解氧浓度、PH值、搅拌转速和通气量，根据取样分析细胞计数、存活率、营养成分和代谢物的结果更换培养基，从而达到细胞的高密度大规模培养； (5)牙髓干细胞的冷冻保存:将检测合格的细胞冻存于管内，细胞的详细信息扫描入数据管理系统，自动化系统根据液氮情况自动寻找空缺位置，将细胞冻存于相应的空格中； (6)根据需要，进行牙髓干细胞的长期冷冻保存，保存期间定期从冻存环境中取出细胞进行检测。
2.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述步骤(1)中，所述牙髓组织是在无菌条件下挑选的，用缓冲液冲洗后剪碎；所述胶原酶消化是用5~10倍体积的0.1%~0.6%胶原酶，于37°C培养箱中振荡培养3(Tl80min，然后用含胎牛血清的细胞培养液终止消化，所述细胞培养液选自商品化的含10-20%胎牛血清的a -MEM、DMEM培养基及无血清培养基。
3.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述步骤(1)的培养步骤包括将经消化的牙髓组织在80(Tl500r/min离心3~IOmin后弃上清、加5~10倍体积细胞培养液重悬细胞，转入培养器皿中进行培养，所述细胞培养液选自商品化的含10-20%胎牛血清的a -MEM,DMEM培养基及无血清培养基。
4.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述步骤(2)中，所述原代细胞在长满培养器皿底部80%-90%时用胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱离原代培养器皿后接种于二维培养器皿，所述二维培养器皿选自细胞培养孔板、培养皿、组织培养方瓶。
5.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述步骤(4)中，所述溶解氧浓度为40%-60%、pH值为7.0-7.2、搅拌转速为50-100rpm。
6.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述步骤(4)中的所述转瓶培养按以下过程进行:将微载体经预处理、转瓶硅化、121°C高温灭菌后，接种细胞，微载体加入量为2-10g/L，大小范围为60-300 μ m，接种密度为3 X 104-3 X IO5个细胞/ml，转瓶的大小范围为25ml-500ml，转速范围 50_75rpm。
7.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述步骤(4)中的所述生物反应器选自细胞培养生物反应器，包括搅拌式生物反应器、固定床生物反应器和WAVE生物反应器。
8.如权利要求7所述的生产工艺，其中所述搅拌式生物反应器、WAVE生物反应器按以下过程进行细胞培养:将微载体用 PBS冲洗2次，第三次加入PBS放入4°C冰箱内平衡水化过夜，高压蒸汽灭菌后，接种牙髓干细胞，微载体的加入量为3-10g/L，接种密度为IXlO5-1O6个细胞/mL，细胞扩增至密度为5X 105-2X IO7个细胞/mL ;其中所述固定床生物反应器按以下过程进行细胞培养:在生物反应器中加入经表面处理切割好的聚酯切片作为细胞载体，并加入磷酸缓冲液，高温蒸汽灭菌后加入细胞培养液，接种牙髓干细胞，其中聚酯纤维片状载体的使用量为每升罐体积25-45g，接种密度为I X IO5-1O6个细胞/mL，细胞扩增至密度为4X 106-2X IO7个细胞/mL。上述生物反应器培养条件所述溶解氧浓度为40%-60%、pH 值为 7.0-7.2、搅拌转速为 50_100rpm。
9.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述步骤(5)中，所述细胞的详细信息包括供者姓名、细胞代数、细胞培养液成分和浓度、细胞接种密度、冻存液成分和冻存日期；所述冷冻保存包括将所获得的牙髓干细胞按I X IO6^l X IO7个/ml细胞密度在冻存液中重悬，分装入冻存管，经过程序降温后，将冻存管转移至_196°C液氮中冷冻保存。
10.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述牙髓干细胞的冷冻保存使用的冻存液包含体积比为1:2:7的DMSO、 胎牛血清和a -MEM培养液。
【文档编号】C12N5/02GK103849595SQ201210514497
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月5日 优先权日:2012年12月5日
【发明者】傅强, 陈彦田, 冯见, 齐瀚实 申请人:上海坤爱生物科技有限公司