一种培养基质及其应用与培养牙髓干细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及干细胞培养领域，尤其设及一种培养基质及其应用与培养牙髓干细胞 的方法。
【背景技术】
[0002] 牙髓干细胞（dentalpulpstemcells,DPSCs)是存在于牙齿牙髓组织中的一类 具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。对牙髓干细胞的研究显示， 牙髓干细胞可应用于牙髓再生、牙本质再生、骨骼再生、神经细胞再生、屯、肌和血管再生等。 牙髓干细胞的应用于牙科诊疗，可W促进牙本质再生，从单一牙齿分离获取大量的牙髓干 细胞可W应用牙科进行大量的牙齿修复。有数据显示，体外培养的牙髓干细胞，无论是细胞 增殖能力还是克隆形成率都要强于骨髓来源的间充质干细胞。
[0003] 在牙髓干细胞临床应用过程中，目前突出的问题是一次成功的治疗需要一定数量 的细胞，运意味着如何在短时间内获得大量有效高活性的细胞W提供给病人使用是一个很 关键的问题。因此，体外大量扩增牙髓干细胞的研究越来越受到研究人员和临床医生的重 视。
[0004] 现有的对DPSCs扩增培养方法大多添加胎牛血清，但临床使用含动物源的培养基 不仅会引起免疫排斥反应，异源病毒感染，而且采用运种培养基培养的牙髓干细胞，生长比 较缓慢，在传代超5次之后其干细胞特性会大大降低。
【发明内容】
阳〇化]有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种培养基质及其应用与培养牙髓 干细胞的方法。本发明提供的培养基质能够维持DPSCs在传代过程中的稳定性。
[0006] 本发明提供的Ξ维培养基质，包括I型胶原水凝胶和培养液；培养液中包括基础 培养液、bFGF和BMP-2。
[0007] 在本发明的实施例中，培养液中bFGF和BMP-2的质量比为（8~12) : (8~12)。
[0008] 在一些实施例中，培养液中bFGF和BMP-2的质量比为1 :1。
[0009] 在本发明的实施例中，培养液中bFGF的浓度为lOng/mL;BMP-2的浓度为long/ mL；
[0010] 本发明提供的培养液中添加bFGF和BMP-2因子，其中，碱性成纤维细胞生长因子 化FGF)。骨形态发生蛋白-2度MP-2)是促进骨形成和诱导成骨细胞分化的的信号因子，研 究表明，BMP-2在牙髓Ξ维培养中发挥着重要的作用。 W11] 在本发明的实施例中，I型胶原水凝胶中I型胶原的浓度为5mg/mL~15mg/mL。
[0012] 在一些实施例中，I型胶原水凝胶中I型胶原的浓度为5mg/血。
[0013] 在本发明的实施例中，I型胶原水凝胶的网孔直径为40μπι~70μπι。
[0014] I型胶原是支持细胞核组织生长的重要外基质蛋白，本发明WI型胶原水凝胶作 为载体，使细胞能够在I型胶原水凝胶提供的的Ξ维立体空间结构中与胶原蛋白的充分接 触，保证了细胞间信息信号的传递，使得牙髓干细胞更容易在胶原凝胶内的分裂增殖。由于 载体创建的细胞生长环境能够最大程度地模拟体内环境，因此细胞的生长更加健康。本发 明所采用的I型胶原可为市场购得，也可自行提取获得，其实施皆在本发明的保护范围之 内。
[0015] 本发明所采用的I型胶原水凝胶的制备方法为：将I型胶原溶解后-80°c静置化 后，冷冻干燥制得I型胶原水凝胶。
[0016] 在一些实施例中，冷冻干燥的时间为16h。
[0017] I型胶原溶解具体为：将I型胶原W乙酸溶液溶解后，于4°C下调节抑值为7. 2。 阳01引在一些实施例中，乙酸溶液中乙酸的浓度为lOmmol/L。
[0019] 在一些实施例中，调节抑采用1M的化OH溶液。
[0020] W本发明提供的方法制备的I型胶原载体的网孔直径为40μm~70μm，孔隙均匀 呈丝状交织，保持良好的Ξ维网络结构。
[0021] 在本发明的实施例中，基础培养液包括DMEM/F12无血清培养液和血清替代物。 阳022] 基础培养液中，血清替代物的体积分数为5 %。
[0023]本发明提供的Ξ维培养基质中，培养液采用无血清培养液，避免了异源病毒感染 或免疫排斥反应。且DMEM/F12培养液营养全面，适宜牙髓干细胞的培养。
[0024] 本发明提供的培养基质中WI型胶原水凝胶作为载体，WbFGF和BMP-2维持牙髓 干细胞的稳定性，实验表明，经6天培养，DPSCs细胞的增殖稳定且保持良好的活力，细胞数 目扩大4倍。经免疫细胞化学染色，培养6天后的细胞干性维持良好，且具有较强的增殖能 力。
[0025] 本发明提供的Ξ维培养基在牙髓干细胞传代培养中的应用。
[00%] 本发明还提供了一种牙髓干细胞的培养方法，包括：将原代培养的牙髓干细胞W 本发明提供的Ξ维培养基质传代培养。
[0027] 在本发明的实施例中，传代培养具体为将牙髓干细胞接种于I型胶原水凝胶后， 置于培养液中培养；培养液中包括基础培养液、bFGF和BMP-2。 阳02引在本发明的实施例中，接种的密度为1X1〇8个/mL。
[0029] 在本发明的实施例中，传代培养的条件为5%C02、37°C、湿度95%。
[0030] 在本发明的实施例中，传代培养的时间为7d。
[0031] 在本发明的实施例中，原代培养具体为：将牙髓组织经I型胶原酶消化后W原代 培养液培养至细胞80 %~90 %汇合；所述原代培养液中包括基础培养液、bFGF和EGF。
[0032] 在本发明的实施例中，I型胶原酶的质量分数为0.1 %~0.25%。
[003引在本发明的实施例中，经I型胶原酶消化后，细胞经70μm细胞筛过滤。
[0034] 现有技术中，对牙髓干细胞的原代培养采用含有胎牛血清的液体培养基。然而，含 有胎牛血清的培养液不仅易引起免疫反应且提高病毒感染的风险，其培养原代细胞的效果 也不佳，所得细胞的数量较低。 阳03引在本发明的实施例中，原代培养液中bFGF和EGF的质量比为（8~12) : (8~12)。
[0036] 在本发明的实施例中，原代培养液中bFGF和EGF的质量比1:1。
[0037] 在本发明的实施例中，原代培养液中bFGF的浓度为lOng/mL;EGF的浓度为long/ mLo 阳03引在本发明的实施例中，原代培养的条件为5%C02、37°C、湿度95%。
[0039] 在本发明的实施例中，原代培养每3天换液一次。 W40] 在本发明的实施例中，当原代培养的细胞80%~90%回合后，W膜蛋白酶消化 后，传代培养。
[0041]本发明提供的提供一种培养基质及其应用与培养牙髓干细胞的方法。本发明提供 的Ξ维培养基质中WI型胶原水凝胶作为载体，WbFGF和BMP-2维持牙髓干细胞的稳定 性，经6天培养，DPSCs细胞的增殖稳定且保持良好的活力，细胞数目扩大4倍。经免疫细 胞化学染色，培养6天后的细胞干性维持良好，且具有较强的增殖能力。并且，本发明采用 EGF和bFGF对牙髓干细胞进行原代培养，使原代细胞活性得到提高。
【附图说明】 阳0创图1示浓度为5mg/mL的I型胶原水凝胶电镜观察效果（100X);
[0043] 图2示实施例3培养细胞的免疫细胞化学染色检测结果。
【具体实施方式】
[0044] 本发明提供了一种培养基质及其应用与培养牙髓干细胞的方法，本领域技术人员 可W借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对 本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已 经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本 文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。 W45] 本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0046] 其中，I型胶原购自sigma,其为鼠尾胶原蛋白I型。
[0047] 血清替代物购自肥LI0S。
[0048] 本发明提供的I型胶原蛋白水凝胶的制备方法为： W例步骤1 : W lOmmol/L乙酸溶液溶解I型胶原蛋白（浓度为5mg/血~15mg/血）后， 于4°C下用Imol/L化0H溶液调节抑值至7. 2 ;
[0050] 步骤2:瞬时离屯、脱泡后W100μ L/孔的体积接种到预先冷却的96孔板内，-80°c 静置化后冻干16h。
[0051] 制得的浓度