一种牙周膜干细胞体外扩增完全培养基及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞培养方法，尤其涉及一种牙周膜干细胞体外扩增完全培养基及方 法。
【背景技术】
[0002] 干细胞是一类具有自我复制、自我更新、多向分化潜能的细胞，可分为胚胎干细胞 和成体干细胞，可从脂肪、骨髓、脐带、胎盘等多种成体组织中分离获得。牙周膜是连接牙骨 质和牙槽骨之间的结缔组织，具有支持、感觉和营养等功能。近年的研究显示牙周膜中存在 未分化的间充质干细胞，参与牙周组织的再生。
[0003] 牙周病是人类口腔疾病中的常见病和多发病，常导致牙周支持组织的破坏或缺 损。目前，牙周支持组织重建主要依赖机械、药物和引导组织再生技术，随着分子生物学、组 织工程学和干细胞技术的飞速发展，牙周组织再生工程技术成为牙周病治疗研究的热点， 牙周膜干细胞是牙周组织再生工程的关键种子细胞之一。
[0004] 目前牙周膜干细胞的体外扩增方法仍以静置培养为主。该培养方式不仅劳动强度 大，易造成污染，而且单个平皿的培养面积有限，使扩增后收获的细胞数量有限。马兆峰等 采用旋转微重力细胞培养系统(rotarycellculturesystem，RCCS)运用含5%FBS的DMEM 培养牙周膜干细胞（马兆峰，李石，牛中英.模拟微重力培养环境下牙周膜干细胞生长状态 的研究.广东牙病防治，2011，19 (9): 451 -454)。但悬浮培养过程中，因为细胞在同一体积培 养基内的扩增的数量增加，对营养需求增加，培养基容易耗尽;此外该方法扩增得到的牙周 膜干细胞的含量仍然较低。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种牙周膜干细胞体外扩增完全培养基 及方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 一种牙周膜干细胞体外扩增完全培养基，包含FBS(胎牛血清）、L-谷氨酰胺、NEAA (非必需氨基酸)和基础培养基，所述基础培养基为高糖DMEM。
[0008] 优选地，所述L-谷氨酰胺的浓度为1 _5mM。
[0009] 优选地，所述FBS的含量为5-20v/v%。
[0010] 更优选地，所述FBS的含量为10-20v/v%。
[0011] 优选地，所述呢44包含甘氨酸(617〇;[116)、1^-丙氨酸(1^-41311；[116)、1^-天冬酰胺(1^- Asparagine)、L_天冬氨酸（L-Asparticacid)、L_谷氨酸（L-GlutamicAcid)、L_腫氨酸（L-Proline)和L_丝氨酸(L-Serine)，每种氨基酸的含量为0.5_3mM。
[0012] 更优选地，所述NEAA中每种氨基酸的含量为ImM，即为1XNEAA。
[0013] 优选地，所述牙周膜干细胞体外扩增完全培养基由下述含量的下述组分组成： 1Ov/v%FBS、2mML-谷氨酰胺、1XNEAA，余量为高糖DMEM。
[0014] -种牙周膜干细胞体外扩增方法，包括使用微载体和本发明完全培养基扩增牙周 膜干细胞的步骤。
[0015] 优选地，上述牙周膜干细胞体外扩增方法包括以下步骤：
[0016] 向培养袋中注入微载体和完全培养基，平衡培养系统，待培养系统平衡后接种牙 周膜干细胞，微载体终浓度为3-10g/L，培养0.5-2小时后调整温度至37°C，继续培养至细胞 爬满微载体80%以上；
[0017] 用滤网分离微载体和培养基，用PBS润洗微载体两次，用胰蛋白酶-EDTA溶液消化 微载体至细胞完全脱落，加入完全培养基终止酶解，用滤网分离微载体和酶解消化液，酶解 消化液在200-800g条件下离心5-10min;去除上清，得到牙周膜干细胞。
[0018] 进一步优选地，所述牙周膜干细胞体外扩增方法包括以下步骤：
[0019] 向培养袋中注入微载体和本发明完全培养基，培养系统按照以下参数设定进行平 衡:通气为95%无菌干燥空气和5%二氧化碳的混合气体，pH为7.00-7.20，温度为35°C，涌 动速度为5-20RPM;
[0020] 培养系统平衡后接种牙周膜干细胞，微载体终浓度为3-10g/L，培养0.5-2小时后 调整温度至37°C，连续培养至细胞爬满微载体80 %以上；
[0021] 用70μπι的滤网分离微载体和培养基，向微载体中加入3-10倍体积的PBS润洗后，用 70μι的滤网分离微载体和PBS，洗两次后，向微载体中加入1-3倍体积的胰蛋白酶-EDTA溶液 消化至细胞完全脱落，加入2-5倍体积的本发明完全培养基终止酶解，用70μπι的滤网分离微 载体和酶解消化液，酶解消化液在200-800g条件下离心5-10min，去除上清，得到牙周膜干 细胞;所述胰蛋白酶-EDTA溶液包含0.05-0.5m/v%胰蛋白酶和0.01 -0.05m/v%EDTA。
[0022]优选地，微载体在使用前进行预处理，预处理方法为:微载体用PBS浸泡过夜后用PBS洗两遍，高压灭菌，去除roS，加入1-5倍体积的高糖DMEM润洗一遍，后用1-3倍体积的高 糖DMEM浸泡置于4°C备用。
[0023]优选地，所述培养系统为波浪生物反应器，所述微载体为cytodex3。
[0024]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0025] 本发明完全培养基的组分包含NEAA、L-谷氨酰胺、FBS和高糖DMEM，提高了血清含 量，且使用高糖培养，添加NEAA，使本发明完全培养基的营养更佳丰富，可以有效克服现有 技术中培养基容易耗尽的问题。
[0026] 本发明牙周膜干细胞体外扩增方法使用微载体扩增牙周膜干细胞，增殖速度快， 扩增后获得的细胞数量多，而且劳动强度小，不易污染。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明实施例1中牙周膜干细胞的扩增曲线。
[0028] 图2为本发明实施例1中本发明样本的流式检测结果图。图2A为实施例1中本发明 阴性样本检测结果，图2B为实施例1中本发明样本检测结果.
[0029] 图3为本发明实施例1中阴性样本的流式检测结果图。图3A为实施例1中对照组阴 性样本检测结果，图3B为实施例1中对照组样本检测结果。
[0030] 图4为本发明实施例2中牙周膜干细胞的扩增曲线。
[0031]图5为本发明实施例3中牙周膜干细胞的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0032] 为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所 用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
[0033] 实施例1
[0034] 本实施例中牙周膜干细胞体外扩增完全培养基由下述含量的下述组分组成:5v/ v%FBS(GIBC0)、2mML-谷氨酰胺、1XNEAA，余量为高糖DMEM(GIBCO)。以马兆峰等人在《模拟 微重力培养环境下牙周膜干细胞生长状态的研究》文章中使用的培养基方案为对照组，即 对照组的完全培养基为含5 %v/vFBS的DMEM，采用使用GE-WAVE系统培养牙周膜间充质干细 胞，具体方法如下：
[0035] 称取cytodex3微载体1.5g两份，分别用50mLPBS浸泡过夜，充分膨胀后，用roS洗 两遍后，高压灭菌。分别用对照组及本发明的完全培养基润洗后，置于4°C下备用。
[0036] 使用的培养系统为波浪生物反应器(GEReadyToProcessWAVE25)，分别往两个 培养袋中注入预处理过的微载体和400mL完全培养基，按以下参数设定系统:通气为95%无 菌干燥空气和5 %二氧化碳的混合气体，pH为7.00-7.20，温度为35°C，涌动速度为5RPM。
[0037] 取P3代牙周膜干细胞，用胰酶消化离心后，用完全培养基重悬，调整浓度为1X 107cellS/L。待培养系统平衡稳定后，将细胞悬液分别注到对照组和本发明的培养袋中，每 袋10mL，用90mL润洗离心管和注射器，注到培养袋中，微载体终浓度为3g/L。培养2小时后， 将温度调整为37°C，继续培养，至第7天细胞爬满微载体80%以上。本发明先用较低温度(35 °C)平衡培养系统，接种后仍用同样的温度进行培养，可以使细胞在培养基和微载体中分散 均匀，之后再使用最适宜的温度(37°C)培养，使细胞贴服在微载体上，快速增殖。
[0038] 在培养过程中，根据细胞生长情况换液，每天取样计数，结果如表1和图1所示。
[0039] 表1本实施例中计数结果表单位为X108Cells
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