耐受性和固定率的微藻选育方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于微藻培育技术领域，涉及一种微藻的选育培育方法，特别是一种具有 高C02耐受性和固定率的微藻选育方法，能够培养选育出高C0 2耐受性和固定率的微藻。
【背景技术】：
[0002] 自工业革命以来，人类向大气中排入的二氧化碳等吸热性强的温室气体逐年增 加，大气的温室效应也随之增强，其引发的一系列问题已引起了全世界各国的关注。如何在 现有的燃料和能源结构条件下，采取经济有效的方法控制co2的排放，是研究者多年来重点 研究的课题；根据众多科学家的研究经验和申请人近几年的研究成果分析，微生物法是一 种行之有效的减排法，但是这其中所需的氢化细菌培养需要通入氢气，实际工程应用中技 术复杂性较高，且微藻耐高温性差，通常当〇) 2浓度大于5 %时生长就会受到抑制，固碳效率 也较低。因此选育出一种或几种合适的微生物不仅能实现对高浓度co2高效减排以突破生 物法的技术瓶颈，而且所获得的生物质还可通过质能转化开发出新能源，以减少对化石燃 料的需求同时也减少了因化石燃料燃烧而引起的〇) 2的排放。
[0003] 查阅国内外典型研究成果发现，大部分微生物研究或是因为最适C02浓度和最高 耐受浓度较低、或是因为低固定率等原因都未取得满意的结果；例如虽然刘玉环等人研究 的Scenedesmusdimorphus最适C02浓度和最高耐受浓度较高，但其在最佳浓度时的固定率 仅达0. 99gAL·d);黄和等人研究的"一株小球藻及其应用"（专利号为ZL201019026021. X)，其分离的小球藻M209256最高C02耐受浓度仅为24. 5 % (v/v)，最佳C0 2固定浓度为 5% (v/v)，15天最佳生物量为2. 23g/L，按通常的小球藻的含碳量50%计算，最佳C02固定 率为4.0888/1(折合0.2738八1^(1))，在0) 2浓度为24.5%&八）时0)2固定率为2.058/ L(折合0. 137gAL·(!));刘君寒等人研究的"一株小球藻及其培养方法和应用"（专利号为 ZL201110145547. 7)，该方法重点是获得具有多功能的小球藻，其中所涉及的小球藻M4653 最高C02耐受浓度为30% (v/v)，优选在5% (v/v)C02时油脂含量为33. 5%和产量1.518/ 1^，在20%时仅为24.7%和0.798/1，显然该小球藻不适宜在高〇) 2浓度环境下生存，且该方 法中也未对小球藻的适宜C02浓度和最佳C0 2固定情况进行阐述；李福利等人研究的"一株 栅藻及其培养方法和应用"（专利号ZL201110144545. 6)，该方法中仅仅阐述了栅藻M4653 可用于空气（30% (v/v)C02环境），研究重点在于含氨氮等废水的净化及其油脂含量，但对 C02固定及去除情况未有提及，并且最佳生物质生长量出现在5% (v/v)C0jP最佳蛋白量出 现在3%(>八)〇)2时，可以理解为最高(1) 2耐受浓度为30%(>八)，最佳固定浓度仅为5% (v/V);因此需要研究设计一种新的具有较高C02耐受浓度和固定浓度的微藻，本发明的申 请人于2012年2月13日申请的专利号为ZL201210030297. 8中公开了一株具有高0)2耐 受性和固定率的微藻，并在说明书中给出了该株微藻的选育过程；但是该专利技术虽然公 开了具有高C02耐受性和固定率的微藻的选育试验过程，但是其涉及的选育步骤过于简单， 各种偶然因素过多，成功选育出稳定性较高的藻株几率较低；因此本发明设计出一种能够 选育出具有高〇) 2耐受性和固定率的微藻的方法，以便于产量化生产培育出具有高C〇2耐受 性和固定率的微藻，实现对烟道气等高浓度复杂环境下C02的有效固定，对解决温室效应问 题具有良好的应用价值和实际效益。
【发明内容】
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[0004] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，设计一种专门用于选育高C02耐受 性和固定率微藻的方法，以实现高C02耐受性和固定率的微藻的量化选育培养。
[0005] 为了实现上述目的，本发明涉及的具有高C02耐受性和固定率的微藻选育方法具 体包括以下步骤：
[0006] (1)样品的采集与预培养：
[0007] 采集土壤、池塘、自然河流、排污塘、电厂水塘中的水样作为试验样品，培养前将上 述各水样在光学生物显微镜下进行观察，分别记录所含微藻的种类；在反应器6中按1 :3 的容量比例加入所取样品及已灭菌的BBM培养基，将微藻混合试样接种到该培养基里，在 光照培养箱中进行培养，控制培养条件为：25°C±2°C，光照强度25000LUX，光暗比12 :12， 培养液初始pH值为6 ;预培养3周待明显变绿后，按上述步骤继续进行扩大培养，培养方法 同上；
[0008] ⑵模拟烟气驯化培养
[0009] 将预培养后的微藻试样装入新的反应器6内进行驯化培养，将配制的含有体积比 为C0215 %、N283 %和022 %的模拟烟气通入反应器中，控制气流速度大于60mL/min，光照强 度为llOOOLux，光照周期为10h:14h，驯化培养4天；取驯化后的藻液接种到新的反应器6 的培养基中，依照上述方法反复驯化培养三次得高密度藻液，然后采用平板分离法进行微 藻分离试验；
[0010] ⑶平板分离
[0011] 将上述高密度藻液接种在平板上，控制温度21°C-25°C，光照强度25000LUX，光照 周期12:12,培养6-8天并观察藻落生长情况；待单藻落形成时，挑取部分藻落在显微镜下 观察，选取较多同一种属的进行分离和采集；
[0012] (4)获得纯种群并进行保存
[0013] 将步骤（3)反复多次进行多代培养，直至单菌落特征一致，且显微镜下观察为唯 一种属时确定为纯菌落藻种而进行保存；将纯菌落藻种接种于斜面培养基中，放置于恒温 培养箱中控温4°C保存，1-2个月转接一次，直至长出清晰藻落；
[0014] (5)培养特性测定
[0015] 按体积比1:9取对数生长期藻液接种到新的反应器6内已灭菌的BBM培养基中， 设置不同温度、气体流速、光照条件和培养基初始pH值一系列培养条件进行寻优试验以得 出最佳培养条件；
[0016] (6)高强度驯化培养
[0017] 按体积比1:9取对数生长期藻液接种到新的反应器6内已灭菌的MBM培养基中， 分别在C02浓度为3%、5%、10%、15%、20%、30%、60%和80%及普通空气条件下培养6天 时间，观察微藻的生长情况，考察并记录微藻对高浓度〇) 2的耐受性，以筛选获得耐受性相 对高的菌株；
[0018](7)基因诱变育种
[0019] 根据致死率为70-80%有利于正向突变的原则，通过预实验确定适合的诱变剂量 后进行紫外线诱变选育；选择诱变剂量为紫外线照射30min，处理0D680nm分别为0. 020、 0. 031、0. 035、0. 046、0. 055和0. 088的藻液，并根据细胞致死率确定初始藻细胞浓度；上述 不同取值下〇D680nm的每个诱变试验做3个平行样后取其平均值，诱变后预培养同步骤（1) 的预培养过程，然后按照步骤（3)和（4)筛选出单株优良藻株；
[0020] (8)传代稳定性测定
[0021] 将筛选得到的单株优良藻株分别接种入新的反应器6内新鲜培养液中连续培养 四代，并对第四代藻株测其生长曲线与第一代藻株比较，得到稳定突变株后再进行下个步 骤，否则重复步骤（7)和（8)直至得到稳定突变株；
[0022] (9)基因克隆和测序
[0023] ①菌液与质粒
[0024] 将得到的生长稳定的稳定突变株制成菌液，以大肠杆菌和PMG为质粒载体；
[0025] ②缓冲液及试剂
[0026] TAE：40mMTris-acetate, 10mMEDTA,
[0027] EB:lgEB溶于100ml蒸馏水中，放于棕色瓶中避光保存，
[0028] 试剂：植物基因组DNA提取试剂盒PlantGenomicDNAKit，普
[0029]通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgelMidiPurificationKit;
[0030] ③藻细胞DNA的提取
[0031] 取15ml对数生长期的菌株，在4300g下离心15min后转接到离心管在-20°C条 件下冻结；取出离心管在室温条件下溶解，在12000rmp离心30s，对沉底的组织进行物理 破碎；将65°C预热的700μ1缓冲液GP1转入离心管中迅速颠倒混匀后，放在65°C水浴中 20min，该过程中多次颠倒摇晃以混合样品；加入700μ1氯仿充分混勾，在12000rmp下离心 5min;将所得上层水相转入新的离心管中，加入700μ1缓冲液GP2充分混匀；将混匀的液 体转入吸附柱CB3中，12000rmp下离心30s后弃掉废液；向吸附柱CB3中加入500μ1缓冲 液⑶，12000rmp下离心30s后倒掉废液，将吸附柱CB3中放入收集管中；向吸附柱CB3中加 入700μ1漂洗液PW，12000rmp下离心30s后倒掉废液，将吸附柱CB3中放入收集管中；向 吸附柱CB3中加入500μ1漂洗液PW，12000rmp下离心30s后倒掉废液；将吸附柱CB3中放 回收集管中，12000rmp下离心2min后倒掉废液；将吸附柱CB3置于室温放置，以彻底晾干 残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入新的干净离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μ1 pH值在7. 0-8. 5之间的水，室温放置2-5min，12000rmp离心2min，将溶液收集到离心管中； 将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rmp离心