干的颗粒状细胞培养基的制作方法
【专利说明】干的颗粒状细胞培养基
[0001] 本申请是申请日为2011年11月18日、发明名称为"的颗粒状细胞培养基"的中 国专利申请201180060097.X(国际申请号PCT/EP2011/005830)的分案申请。
[0002] 本发明涉及不包含蛋白胨或胰蛋白胨的干的颗粒状细胞培养基，尤其涉及支持哺 乳动物和/或昆虫和/或植物细胞生长的干的颗粒状细胞培养基制剂。本发明还涉及这些 干的颗粒状细胞培养基的生产及其用途。
[0003] 发明背景
[0004] 细胞培养基在人工环境中支持并维持细胞的生长。
[0005] 取决于生长将受到支持的生物的类型，细胞培养基可以包含10种以上，有时100 种以上的不同组分。
[0006] 哺乳动物、昆虫或植物细胞的增殖所需的培养基通常比足以支持细菌和酵母生长 的基本培养基更复杂。
[0007] 细胞培养的早期研究使用由未确定成分的组分，例如血浆、血清、胚胎提取物、其 他未确定成分的生物提取物或蛋白胨组成的培养基。因此，在化学上确定成分培养基的发 展成为了主要的进步。在化学上确定成分的培养基通常包含但不是排他地限于氨基酸、维 生素、金属离子、抗氧化剂、螯合剂、生长因子、缓冲剂、激素、氯化物和本领域技术人员已知 的许多其他物质。
[0008] 将一些细胞培养基提供为无菌的水成液。液体细胞培养基的缺点是其货架期缩 短，并且运输和贮藏困难。因此，现在许多细胞培养基都提供为细磨干粉混合物。生产所述 细磨干粉混合物的目的是通常将其与其他补充物一起在水和/或水溶液中以所设计的溶 解状态溶解，以给生物细胞提供用于生长和/或从相同的所述细胞中产生生物药物的基本 营养基础。
[0009] 细磨粉末的处理具有明显的缺点。例如，处理它们时粉尘很大，量大时更是如此， 特别是在一些个别原料对健康有害的情况下，这可以导致处理该物质的工人的健康问题。 即使个别组分并非是直接有毒的，但通过可呼吸的空气本身中高的粉尘水平也可以引起工 人的健康问题，并且由于该问题，在许多国家中都严格规定了空气中的粉尘量。此外，如果 量过多，并且没有采取足够的警戒措施防止火花点燃，那么有机物质的粉尘，更特别地细粉 尘可以容易地导致爆炸。
[0010] 此外，在不利的运输条件下，例如在长期运输条件期间，干粉培养基的一种或多种 较轻的各个组分朝表面移动或者一种或多种较重的组分朝原包装的底部移动。这种局部较 高浓度或者在疏松材料的物理中心，某些个体组分消耗的结果会以许多方式负面地影响培 养基的产品质量。此外，分层对每批次的靶生物药物分子的产生量或者更精细地对生物药 物自身的寡糖模式的影响远远超过物理消耗和各个组分的浓度，使得培养基质量对直到患 者使用之前生物药物的质量绝对是关键的。
[0011]另一方面是当使用细磨干粉培养基时，难以在水溶液中溶解细粉末，来制备最终 的含水的细胞培养基。润湿细磨粉末并将其溶解在水成液中是非常困难的。因此，粉末培 养基的处理及其应用是相当复杂的。
[0012] 由于干粉培养基在稳定性、混合和溶解方面的局限，所以通常以干燥形式生产的 培养基不具有一些关键的补充物，例如碳酸盐、水解产物、生长因子和其他微量元素，当最 终用户将干粉培养基制备成液体时，他们将补充这些补充物。额外的处理和补充将增加发 生昂贵错误以及劳动力的可能性。
[0013] 已知通过将粉末挤压成小颗粒可以使粉末状细菌细胞培养基粒化。该结果是小颗 粒在安全性、处理和性能方面更有优势。对于细菌细胞培养基可以容易地实现该步骤，因为 它们包含在化学上成分不完全确定的蛋白胨或胰蛋白胨或者等同的肽组分，其支持通过自 身固有粘性粘附培养基组分。
[0014] 哺乳动物和/或昆虫和/或植物细胞培养基通常不含有蛋白胨或其等同物，因此 更难以该方式处理。
[0015] Invitrogen Corporation的US 6, 383, 810 B2公开了产生团集的真核细胞培养基 粉末的方法。该方法包括用溶剂润湿干粉细胞培养基，然后重新干燥湿润的培养基，以获得 干的团集细胞培养基。
[0016] 该方法的最大缺点是整个培养基组分都需要与水接触，并且然后需要将它们加热 以除去水的事实。这可能在培养基的组分之间引起相当多的副反应，或者破坏或修饰敏感 性组分，对培养基质量造成不可预测的结果。
[0017] 因此，存在发现哺乳动物和/或昆虫和/或植物细胞培养基的新形式的明确需求， 所述形式容易处理，并可以在培养基组分之间不引起破坏和/或副反应的情况下生产。
[0018] 发明简述
[0019] 已经发现，通过压实干燥培养基组分的混合的细磨粉末，可以以干的颗粒形式产 生无蛋白胨的在化学上确定成分的哺乳动物和/或昆虫和/或植物细胞培养基。通过在辊 式压制机中挤压团聚可以实现压实。不需要将任何添加剂用于辅助该处理。根据本发明的 干的颗粒状细胞培养基具有长的货架期、易于处理并可以在非常温和的条件下生产，以至 于在生产过程中，所述培养基组分不会由于被润湿或被加热而发生副反应。
[0020] 因此，本发明涉及产生并不包含蛋白胨或胰蛋白胨的干的颗粒状细胞培养基的方 法，其包括
[0021]a)以培养基组分的混合粉末形式提供细胞培养基，其中该混合的粉末不包含蛋白 胨或胰蛋白胨；
[0022] b)在辊式压制机中压实所述混合的粉末。
[0023]在优选的实施方案中，在步骤a)中提供的细胞培养基是哺乳动物细胞培养基。
[0024]在优选的实施方案中，在步骤a)中提供的细胞培养基包含一种或多种糖类组分、 一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种盐、一种或多种缓冲剂组分、一种或多 种辅因子以及一种或多种核酸组分。
[0025] 在非常优选的实施方案中，步骤b)通过如下步骤实施
[0026] bl)在辊式压制机中压实所述混合的粉末；
[0027] b2)将在步骤bl)中获得的具有小于0. 2_颗粒大小的经压实的细胞培养基的所 有部分，以待填充到辊式压制机中的培养基组分的混合粉末形式再引入到细胞培养基中。
[0028]在优选的实施方案中，辊式压制机的挤压能力在30至80kN/cm辊宽之间。
[0029]本发明还涉及可以根据本发明的方法制备的不含蛋白胨或胰蛋白胨的干的颗 粒状细胞培养基。在优选的实施方案中，颗粒状细胞培养基的80%以上的颗粒具有大于 0· 5mm的大小。
[0030] 在非常优选的实施方案中，颗粒状细胞培养基的90%以上的颗粒具有大于0. 5mm 的大小。
[0031] 在另一个优选的实施方案中，不含蛋白胨或胰蛋白胨的干的颗粒状细胞培养基是 在化学上确定成分的哺乳动物细胞培养基。
[0032] 在另一个优选的实施方案中，不含蛋白胨或胰蛋白胨的干的颗粒状细胞培养基包 含一种或多种糖类组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种盐、一种或多 种缓冲剂组分、一种或多种辅因子以及一种或多种核酸组分。
[0033] 本发明还涉及通过以下步骤将不含蛋白胨或胰蛋白胨的干的颗粒状细胞培养基 用于培养根据本发明的细胞的用途，所述步骤包括：
[0034] a)在溶剂中溶解不含蛋白胨或胰蛋白胨的干的颗粒状细胞培养基，以形成液体细 胞培养基；
[0035] b)将所述液体细胞培养基与待培养的所述细胞接触。
[0036] 在优选的实施方案中，待培养的所述细胞是哺乳动物细胞。
[0037] 在优选的实施方案中，步骤a)中的溶剂是水。
[0038] 除上述本发明的单个实施方案和方面外，本发明还实现并实践了两个或两个以上 所公开的实施方案或方面的每一组合。
[0039] 发明详述
[0040] 图1显示适合于本发明的干压实设备的示意图。
[0041] 根据本发明的干法制粒在不添加水或其他溶剂的情况下，通过在压力下压实粉末 产生颗粒或微粒。通常，根据本发明所使用的辊式压制机还产生了更大的压实物或薄片。通 常例如通过振动筛温和地打碎如此形成的这些压实物，以产生颗粒状的微粒（团块）。根 据本发明，粉末或细磨粉末是颗粒的组合物，其中80%以上的所述颗粒大小（直径）小于 0.2_。优选地，粉末是干的且自由流动的。表述"自由流动的粉末"指的是其中的颗粒并 不相互粘着的粉末（通过研磨、微制粒或相似的技术制备）。通常，表现出低于约50度静止 角的全部粉末都显示出合适的流动性质，但如本文中所用，术语干的且自由流动的还应当 指粉末的肉眼观（意为粉末看起来是干的且自由流动的）。
[0042] 根据本发明细胞培养基是维持和/或支持细胞体外生长的组分的任意混合物。细 胞培养基可以包含维持和/或支持细胞体外生长所需的全部组分或者仅一些组分，以便分 开地加入其它组分。根据本发明细胞培养基的实例是包含维持和/或支持细胞体外生长所 需的全部组分、培养基补充物或进料的完全培养基。在优选的实施方案中，细胞培养基是完 全培养基。
[0043] 通常，将根据本发明的细胞培养基用于维持和/或支持细胞在生物反应器中的生 长。
[0044] 哺乳动物细胞培养基是维持和/或支持哺乳动物细胞体外生长的组分的混合物。 哺乳动物细胞的实例是人类或动物细胞，优选地CH0细胞、C0S细胞、IVER0细胞、BHK细 胞、AK-1细