人脂肪间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于干细胞技术领域，涉及一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 人脂肪间充质干细胞（adipose-derivedstemcells，ADSCs)是从脂肪组织中分 离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖，同 时具有来源丰富，体内储备量大，取材比骨髓等容易，少量组织即可获取大量干细胞，衰亡 率低等优点。成体脂肪组织来源的间充质干细胞在临床上具有很高的应用价值，广泛应用 于组织工程及再生医学领域。
[0003] 1，2, 3, 4, 6-0-五没食子酰葡萄糖（1，2, 3, 4, 6-Pentagalloylglucose，PGG)是 从药用植物余甘子中提取得到的化合物，CAS登录号为14937-32-7。中国专利申请 200910040157. 6公开了 1，2, 3, 4, 6-0-五没食子酰葡萄糖的抗流感病毒方面的用途。
[0004] 传统的含动物血清的干细胞培养基给干细胞的生产与科研带来多种不利因素。血 清能为干细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但其存在诸 多缺点：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确，不利于疫 苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。
[0005] 无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入成分明确的血清替代成分，既能满 足干细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因此，发展无血清培 养基是干细胞走向临床应用的重要条件。目前已有一些市售干细胞无血清培养基，但是现 有市售无血清培养基存在细胞增殖不够理想、价格昂贵等缺陷。
[0006] 中国专利申请201210197360. 6公开了一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基， 该培养基以高糖型DMEM为基础培养基，添加了牛磺酸、还原型谷胱甘肽和铜蓝蛋白等组 分，但存在细胞贴壁性差，增殖缓慢的缺陷。
[0007] 中国专利申请201310134502. 9公开了一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基， 该培养基以低糖型DMEM为基础培养基，虽然添加了碱性成纤维生长因子、肝素和谷氨酰胺 等组分，但脂肪间充质干细胞的生长增殖效果不够理想。
[0008] 因此，现有技术存在细胞贴壁性差，细胞增殖速率不够理想等问题。
【发明内容】
[0009] 为解决现有技术中存在的细胞贴壁性差，细胞增殖速率不够理想等问题，发明人 通过大量试验筛选，得到一种新的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，该培养基的使用 无需培养瓶进行包被，细胞贴壁性良好，细胞增殖速率高，保持良好的干细胞幼稚形态和干 细胞特性，降低了成本。
[0010] 本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。
[0011] 本发明提供一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括DMEM基础培养基， 还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺胰岛素样生长因子5~100ng/mL、表皮生 长因子l~50ng/mL、转化生长因子1~10ng/mL、血小板源性生长因子l~10ng/mL、成纤维 细胞生长因子l~50ng/mL、转铁蛋白0. 5~10yg/mL、维生素C5~50yg/mL、人血清白蛋白 0? 2~3mg/mL和 1，2, 3, 4, 6-0-五没食子酰葡萄糖 1. 25~15yM。
[0012] 上述组分及其浓度是发明人经大量试验筛选确定的。上述组分中，DMEM基础培养 基提供氨基酸、无机盐、糖类等基本物质；L-谷氨酰胺作为一种必需氨基酸，在细胞培养过 程中起到重要作用，可作为细胞新陈代谢的二次能量来源；转铁蛋白是血浆中主要的铁传 递蛋白，为细胞内化和细胞代谢提供所需的铁；维生素C是维持细胞生长的生物活性物质， 在细胞代谢中起调节及控制作用，还可抗氧化；人血清白蛋白能提供细胞生长所需的营养 物质，还可调节渗透压，保护细胞免受机械损伤；胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生 长因子、血小板源性生长因子和成纤维细胞生长因子则起到间充质干细胞生存维持和增殖 刺激的作用；1，2, 3, 4, 6-0-五没食子酰葡萄糖（1，2, 3, 4, 6_Pentagalloylglucose，PGG)促 进了人脂肪间充质干细胞的快速贴壁和快速增殖，并能够维持脂肪干细胞的干细胞幼稚形 态和干细胞特性。
[0013] 优选地，本发明提供的无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分 及其浓度：L-谷氨酰胺]~10mM、胰岛素样生长因子5~20ng/mL、表皮生长因子l~20ng/ mL、转化生长因子1~10ng/mL、血小板源性生长因子l~10ng/mL、成纤维细胞生长因子 l~20ng/mL、转铁蛋白 0.5~10iig/mL、维生素C5~50iig/mL、人血清白蛋白 0.2~3mg/mL和 1，2, 3, 4, 6-0-五没食子酰葡萄糖5~12. 5yM。
[0014] 优选地，本发明提供的无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及 其浓度：L-谷氨酰胺5mM、胰岛素样生长因子10ng/mL、表皮生长因子10ng/mL、转化生长 因子5ng/mL、血小板源性生长因子5ng/mL、成纤维细胞生长因子10ng/mL、转铁蛋白5yg/ mL、维生素C25yg/mL、人血清白蛋白lmg/mL和1，2, 3, 4, 6-0-五没食子酰葡萄糖10yM。
[0015] 优选地，本发明提供的无血清培养基，还包括0.l~10ng/mL的干细胞生长因子 (SCGF)。干细胞生长因子可以进一步促进人脂肪间充质干细胞的增殖并维持干细胞特性。 当然，本发明提供的无血清培养基还可以进一步包括链霉素，链霉素的浓度为100yg/mL。
[0016] 优选地，所述干细胞生长因子的浓度为0. 2~0. 4ng/mL。
[0017] 优选地，所述DMEM基础培养基为高糖型DMEM基础培养基或低糖型DMEM基础培养 基。
[0018] 优选地，所述成纤维细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)，所述血小 板源性生长因子为roGF，所述胰岛素样生长因子为胰岛素样生长因子-1 (IGF-1 )，所述转 化生长因子为转化生长因子(TGF-0)。
[0019] 相应地，本发明还提供人脂肪间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，包括如 下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入L-谷氨酰胺、胰岛素样生长因子、表皮生长 因子、转化生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、维生素C、人血 清白蛋白和1，2, 3, 4, 6-0-五没食子酰葡萄糖，混匀，过膜除菌即得。
[0020] 此外，本发明还提供人脂肪间充质干细胞的无血清培养基在人脂肪间充质干细胞 培养中的用途。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种新的人脂肪间充质干 细胞的无血清培养基，与传统的含血清培养基相比，本发明提供的培养基促进了人脂肪间 充质干细胞的快速贴壁，培养的人脂肪间充质干细胞能够保持较好的干细胞幼稚形态，具 有更好的细胞增殖速率和细胞干性，降低了成本。本发明提供的制备方法简单，制得的人脂 肪间充质干细胞的无血清培养基用于人脂肪间充质干细胞的培养，培养获得的细胞表现出 优异的细胞性能。
【附图说明】
[0022] 图1含不同浓度PGG的培养基对人脂肪间充质干细胞增殖的影响。
[0023] 图2含不同浓度干细胞生长因子的培养基对人脂肪间充质干细胞增殖的影响。
[0024]图3人脂肪间充质干细胞在不同培养基中的增殖曲线。
[0025] 图4培养基1和培养基2培养P10代人脂肪间充质干细胞的形态图。
[0026] 图5人脂肪间充质干细胞在不同培养基中培养后的干性基因表达结果图。
[0027] 图6人脂肪间充质干细胞在不同培养基中培养后的诱导分化结果图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0029] 本发明中的各组分均为常规市售产品，例如1，2, 3, 4, 6-0-五没食子酰葡萄糖购 自成都普瑞法科技开发有限公司，货号BP0001。本发明中，培养基1 :本发明实施例三提供 的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基；培养基2 :高糖型DMEM基础培养基+10%体积百分 比的胎牛血清。
[0030] 实施例一含不同浓度PGG的培养基对细胞增殖的影响 发明人进行大量试验筛选得到本发明提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基配 方，并进一步对PGG的浓度影响进行了考察。将PGG粉末用DMS0溶解成100mM母液，分别 用高糖型DMEM基础培养基将PGG母液稀释成20yM、15yM、12. 5yM、10yM、7. 5yM、5yM、 2. 5yM、1. 25yM、0. 63yM与 0? 31yM的PGG溶液。
[0031] 将PI代人脂肪间充质干细胞以104个/mL的密度接种于96孔板中，分别用含不同 浓度PGG的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基(与实施例三提供的人脂肪间充质干细胞 的无血清培养基的区别在于PGG浓度不同)培养，每孔100yL，以不加PGG的人脂肪间充质 干细胞的无血清培养基为对照组。置于37°C、5%C02的细胞培养箱中继续培养，分别于24h、 48h与72h之后，用MTT检测方法，测定每孔的吸光值，将加入PGG处理组的吸光值与不加 PGG的对照组的吸光值相对比，求算添加不同浓度PGG后的细胞增殖率，结果如图1所示。 从图1可知，当PGG浓度达到1.25yM时，存活率呈现显著升高的趋势，并随着浓度的增加 而升高；当PGG浓度达到10yM时，存活率达到峰值，并随着浓度的增加而降低。
[0032] 实施例二含不同浓度干细胞生长因子的培养基对细胞增殖的影响 将P1代人脂肪间充质干细胞以1〇4个/mL的密度接种于96孔板中，分别用含不同浓 度干细胞生长因子的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基(与实施例六提供的人脂肪间充 质干细胞的无血清培养基的区别在于干细胞生长因子浓度不同)培养，每孔100yL，以不加 干细胞生长因子的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基为对照组。置于37°C、5%C02的细 胞培养箱中继续培养，于24h之后，用MTT检测方法，测定每孔的吸光值，将加入干细胞生长 因子处理组的吸光值与不加干细胞生长因子的对照组的吸光值相对比，求算添加不同浓度 干细胞生长因子后的细胞增殖率，结果如图2所示。从图2可知，当干细胞生长因子浓度达 到0.Ing/mL时，增殖率呈现显著升高的趋势，并随着浓度的增加而升高；当干细胞生长因 子浓度达到0. 3ng/mL时，存活率达到峰值，并随着浓度的增加而降低。
[0033] 实施例三人脂肪间充质干细胞的无血清培养基 人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分 及其浓度：L-谷氨酰胺5mM、胰岛素样生长因子-1 10ng/mL、表皮生长因子10ng/mL、转化 生长因子5ng/mL、血小板源性生