亚全能干细胞专用培养基及其专用培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种亚全能干细胞培养。
【背景技术】
[0002]干细胞是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细胞。根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为胚胎干细胞、新生儿干细胞和成体干细胞，按照干细胞分化潜能的不同，可以分为全能干细胞、亚全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。目前，已有利用干细胞治疗心肌梗塞、红斑狼疮、类风湿性关节炎、神经损伤和肌肉萎缩等。
[0003]亚全能干细胞是指具有三胚层分化潜能的一类干细胞亚群，在特定环境下，理论上可以诱导分化为人体任何一种组织细胞，主要来源于人体中广泛存在的间充质组织，特别是骨髓、脂肪、脐带和胎盘等间充质组织，由于脐带和胎盘来源的亚全能干细胞具有更为原始和更为强大的增值能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。
[0004]作为要应用于临床细胞治疗的细胞产品，应当具有如下特点:组织取材方便，来源广泛，不受伦理限制；分离过程简单，无外源污染引入；外来添加物少，过程可控性强，重复性好；可获得足够细胞，细胞活力好；培养周期短，成本低。目前亚全能干细胞的制备过程中，获得的亚全能干细胞不稳定，且需要多次传代才可获得足够的干细胞，因此生长周期长。
[0005]现有培养基中含有血清等成分。
[0006]细胞冻存代数越早，细胞的增殖，活力，分化能力就越好，而现有技术(CN200810240040.8和CN103275926A)都需要至少扩增到两代以上才能后得足够的干细胞。。
【发明内容】
[0007]本发明的目的提供一种亚全能干细胞专用培养基及其专用培养方法，使细胞经过一次传代就可以获得足够的干细胞用于储存。并且不含血清方便使用。
[0008]根据本发明的一个方面，供一种亚全能干细胞专用培养基，包含95 %的DMEM/F12, 5 %血清替代物,5mg/ml人血白蛋白，5.5ug/ml亚油酸，10ng/ml碱性成纤维生长因子，2xl0-8mol/ml地塞米松，10ng/ml人血小板源生长因子，10ng/ml表皮生长因子，50umol/L β -巯基乙醇,2mmol/L L-谷氨酰胺。
[0009]该培养基不含血清，培养效果好，只需培养一代即可达到所需要冷冻的数量。
[0010]根据本发明的一方面，提供了一种亚全能干细胞培养方法，该方法包括如下步骤:
[0011 ] 取亚全能干细胞混匀后，加入到血细胞计数板，倒置显微镜下计数，根据计数结果调整细胞浓度。亚全能干细胞接种于培养瓶内，每瓶加所述亚全能干细胞专用培养；
[0012]将培养瓶放于37°C，5%的C02培养箱内培养，24h后首次换液；
[0013]待细胞生长至80%?90%的汇合度，加入胰蛋白酶消化，加入亚全能干细胞专用培养基终止消化将脱落的细胞和亚全能干细胞专用培养基转移到离心管内，1200?1800rpm,离心6?8min,将细胞沉淀用无血清培养基重悬，计数后以1?5X104/cm接种，进行一代培养得。该方法发培养效果好只需一代培养即可达到可观数量。
[0014]在一些实施方式中，入胰蛋白酶消化步骤为:加入0.05%?0.125%的胰蛋白酶，37°C消化1?3min。消化效果好。
[0015]在一些实施方式中，一代培养的亚全能干细胞可冷冻处理，所述冷冻处理的方法如下:血清替代物和二甲基亚砜按体积比9:1的比例缓慢混匀后配成冻存液，放于4°C预冷10?30min，同时将冻存管和不锈钢冻存管架放于_20°C预冷；收集一代培养的亚全能干细胞，将预冷的冻存液加入大离心管内重悬细胞，将细胞放入冻存管，加样时冻存管放于预冷的冻存管架上，将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，降至_90°C，取出冻存管，放入液氮储存箱长期保存。该方法保存效果好活力高。
[0016]在一些实施方式中，冷冻处理的亚全能干细胞进行复苏，方法如下:将冷冻的干细胞37°水浴快速化冻，孵育时间为2-5min，将细胞悬液转移到含5%人血白蛋白的复合氨基酸生理盐水中。该复苏方法复苏效果好恢复好。
【附图说明】
[0017]图1为24h后首次换液亚全能干细胞生长情况显微照片；
[0018]图2为细胞生长至80%?90%的汇合度时显微照片；
[0019]图3为第二天细胞生长情况显微照片；
[0020]图4为第三天细胞生长情况显微照片；
[0021]图5为冷冻复苏后细胞生长情况显微照片；
[0022]图6为冷冻复苏后贴壁，开始铺展细胞生长情况显微照片；
[0023]图7为冷冻复苏后第二天细胞生长情况显微照片；
【具体实施方式】
[0024]下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下面对本发明作进一步详细说明。
[0025]实验所需器具仪器等均可通过商业途径购得。
[0026]1.亚全能干细胞的培养
[0027]1.1将亚全能干细胞混匀后，取10ul加入到血细胞计数板，倒置显微镜下计数，根据计数结果调整细胞浓度为0.5?IX 104/cm，接种于T75瓶内，每瓶加亚全能干细胞专用培养基至15ml，亚全能干细胞专用培养基成分为:包含95%的DMEM/F12，5%血清替代物(市售本例用 KnockOut? Serum Replacement), 5mg/ml 人血白蛋白，5.5ug/ml 亚油酸，10ng/ml碱性成纤维生长因子，2x10 8mol/ml地塞米松，10ng/ml人血小板源生长因子，10ng/ml表皮生长因子,50umol/LP -巯基乙醇,2mmol/LL-谷氨酰胺。亚全能干细胞专用培养基为无血清培养基，剂型为培养液形态，。
[0028]1.2将培养瓶放于37°C，5%的C02培养箱内培养，24h后首次换液(图1)可见生长状况良好。
[0029]1.3每天观察细胞生长情况，待细胞生长至80%?90%的汇合度(图2)，加入10ml浓度为0.05%?0.125%的胰蛋白酶，37 °C消化1?3min，加入适量亚全能干细胞专用培养基终止消化，将脱落的细胞和亚全能干细胞专用培养基转移到离心管内，1200?1800rpm，离心6?8min，将细胞沉淀用本发明无血清培养基重悬，计数后以1?5X104/cm接种，第二天细胞可达到50%左右汇合度(图3)，第三天基本可以达到80%以上汇合度(图4)。可见融合速度快效率高且形态良好。
[0030]2 冻存
[0031 ] 将血清替代物和二甲基亚砜(DMS0)按体积比9:1的比例缓慢混匀后配成冻存液，放于4°C预冷10?30min，同时将冻存管和不锈钢冻存管架放于_20度预冷；收集P1代干细胞，将预冷的冻存液(4?7X106个干细胞/ml)加入大离心管内重悬细胞，将细胞放入冻存管，加样时冻存管放于预冷的冻存管架上，将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序第一步4°C等待，第二步1.0°C /min降至_4°C，第三步25.0°C /min降至_40°C，第四步
10.0°C /min 降至 _12°C,第五步 1.0°C /min 降至-40°C,第六步 10.0°C /min 降至 _90°C,取出冻存管，放入液氮储存箱长期保存。
[0032]3 复苏
[0033]将干细胞37°C水浴快速化冻，孵育时间为2_5min，将细胞悬液转移到含5%人血白蛋白的复合氨基酸生理盐水中，1200-1500rpm,离心6_8min，弃上清后，用培养基重悬细胞后，计细胞活力，细胞存活率高于80%，如图5，接种培养，30min贴壁，开始铺展(图6)，2天后细胞可达到85%的汇合度(图7)。可见本方法保存后复苏效果好。
[0034]以上所述仅是本发明的优选方式，应当指出，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干相似的变形和改进，这些也应视为本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.亚全能干细胞专用培养基，其特征在于，包含95%的DMEM/F12，5 %血清替代物，5mg/ml人血白蛋白，5.5ug/ml亚油酸，10ng/ml碱性成纤维生长因子，2xl0_8mol/ml地塞米松，10ng/ml人血小板源生长因子，10ng/ml表皮生长因子,50umol/L β -巯基乙醇,2mmol/LL-谷氨酰胺ο2.亚全能干细胞培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: 取亚全能干细胞混匀后，加入到血细胞计数板，倒置显微镜下计数，根据计数结果调整细胞浓度，亚全能干细胞接种于培养瓶内，每瓶加所述亚全能干细胞专用培养； 将培养瓶放于37°C，5%的C02培养箱内培养，24h后首次换液； 待细胞生长至80%?90%的汇合度，加入胰蛋白酶消化，加入所述亚全能干细胞专用培养基终止消化，将脱落的细胞和亚全能干细胞专用培养基转移到离心管内，1200?1800rpm,离心6?8min,将细胞沉淀用无血清培养基重悬，计数后以1?5X104/cm接种，进行一代培养。3.根据权利要求2所述亚全能干细胞培养方法，其特征在于，所述加入胰蛋白酶消化步骤为:加入0.05%?0.125%的胰蛋白酶，37°C消化1?3min。4.根据权利要求3所述亚全能干细胞培养方法，其特征在于，所述一代培养的亚全能干细胞可冷冻处理，所述冷冻处理的方法如下:血清替代物和二甲基亚砜按体积比9:1的比例缓慢混匀后配成冻存液，放于4°C预冷10?30min，同时将冻存管和不锈钢冻存管架放于-20°C预冷；收集一代培养的亚全能干细胞，将预冷的冻存液加入大离心管内重悬细胞，将细胞放入冻存管，加样时冻存管放于预冷的冻存管架上，将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，降至_90°C，取出冻存管，放入液氮储存箱长期保存。5.根据权利要求4所述亚全能干细胞培养方法，其特征在于，所述冷冻处理的亚全能干细胞进行复苏，方法如下:将冷冻的干细胞37°水浴快速化冻，孵育时间为2-5min，将细胞悬液转移到含5 %人血白蛋白的复合氨基酸生理盐水中。
【专利摘要】本发明提供一种亚全能干细胞专用培养基及其专用培养方法，使细胞经过一次传代就可以获得足够的干细胞用于储存。并且不含血清方便使用。亚全能干细胞专用培养基，包含95％的DMEM/F12，5％血清替代物，5mg/ml人血白蛋白，5.5ug/ml亚油酸，10ng/ml碱性成纤维生长因子，2x10-8mol/ml地塞米松，10ng/ml人血小板源生长因子，10ng/ml表皮生长因子，50umol/Lβ-巯基乙醇，2mmol/L？L-谷氨酰胺。该培养基不含血清，培养效果好，只需培养一代即可达到所需要冷冻的数量。
【IPC分类】C12N5/0775, A01N1/02
【公开号】CN105441387
【申请号】CN201410446098
【发明人】王军霞, 黄福来
【申请人】黄福来
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年9月3日