一种制备动物和人类原始多潜能干细胞的方法，试剂盒及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备动物和人类原始多潜能干细胞的方法，试剂盒及用途。
【背景技术】
[0002] (一）多潜能性干细胞的两种多潜能性状态：
[0003] 在啮齿类动物（如小鼠和大鼠）上的研究表明，多潜能干细胞可以分为截然不同 的两种多潜能性状态：以从着床前小鼠胚胎内细胞团建立的小鼠胚胎干细胞为代表的内细 胞团样多潜能干细胞和以从着床后小鼠胚胎原始外胚层建立的小鼠原始外胚层干细胞为 代表的原始外胚层样多潜能干细胞。这两种多潜能干细胞在基因表达谱，维持所需信号通 路，以及嵌合能力上都有很多不同。例如：内细胞团样多潜能干细胞依赖LIF和抑制MAPK/ ERK信号通路来维持其多能性，而原始外胚层样多潜能干细胞则依赖bFGF和TGF-β信号通 路来维持其多能性。在多潜能性方面，原始外胚层样多潜能干细胞具有明显的胚层分化倾 向性且不具备嵌合能力，而内细胞团样多潜能干细胞则没有明显的胚层分化倾向性且具备 高嵌合能力。此外，在体外培养中，原始外胚层样多潜能干细胞会形成扁平形态的克隆，增 殖缓慢且很难单细胞传代；而内细胞团样多潜能干细胞在体外会形成隆起形态的克隆，增 殖迅速而且可以单细胞传代。而这些特性也使得内细胞团样多潜能性干细胞在研究转基因 以及嵌合动物模型上具有得天独厚的优势。同时在小鼠和大鼠上发现的这两种多潜能性状 态也催生出了干细胞与再生医学领域上的一个悬而未决的问题：那就是，除了啮齿类物种 之外，在其它动物物种上是否在也存在这两种多潜能性状态，尤其是内细胞团样多潜能性 状态。因为一旦这个问题得到解决，人类就有能力根据需求改造各种动物物种。
[0004] 尽管这两种多潜能性状态在啮齿类动物（如小鼠和大鼠）上的研究比较清楚， 但是之前已报道的其他动物的胚胎干细胞，尤其是以人和恒河猴为代表的灵长类胚胎干细 胞，在性质上都与原始外胚层样多潜能干细胞接近。例如在体外会形成扁平的二维形式的 克隆，其增殖速率为36小时左右，体外维持自我更新需要bFGF和TGF0信号通路，而且不 能嵌合到早期囊胚中。随着培养条件的进一步改进，干细胞体外建系上一个重要的里程碑 式工作便是2008年由应其龙等人发现的通过结合LIF及两条信号通路GSK和MAPK的抑制 剂，可以将小鼠多潜能性干细胞稳定在胚胎内细胞团样状态（Ying Q L et al.，2008)。而 这个条件也同样可以获得大鼠胚胎内细胞团样多潜能干细胞系。然而尽管利用这个方法可 以在啮齿类动物，如小鼠和大鼠上实现体外胚胎内细胞团样多潜能干细胞建系，它却无法 广泛适用于其它物种的体外内细胞团样多潜能干细胞建系。所以到目前为止，只有在小鼠 和大鼠上真正实现了体外内细胞团样多潜能干细胞建系。
[0005] (二）体细胞重编程技术：
[0006] 要想在体外获得多潜能干细胞，除了直接从早期胚胎建系之外，另一种方法就是 将体细胞利用重编程的技术在体外转变为多潜能性干细胞。简单来说，就是先将供体体细 胞细胞核从细胞中取出，随后将这个细胞核植入一个去核卵细胞中，再将这枚卵细胞移植 入代孕受体的子宫中进行发育，从而得到与供体体细胞来源个体一样的子代。这种技术 又被称之为生殖性克隆。最早的体细胞重编程技术是在两栖动物中上进行的核移植实验 (Gurdon J B，1995)。随后第一只克隆羊多利的诞生（Campbell K H S et al·，1997)，标 志着核移植技术在动物上的成功实现。而在治疗性克隆中，通常得到的胚胎不会移回代孕 母体中，而是经由体外发育并在饲养层细胞上建立多潜能干细胞系。通过这种方法理论上 可以建出病人特异的多潜能干细胞系。而且这种方法已在小鼠和非人灵长类动物中实现 (Wakayama T et al·，2001和Byrne J et al·，2007)。但在人上直到前不久才实现治疗 性克隆（Tachibana M et al. ,2013)。另一种有别于利用卵细胞重编程的方法是通过将已 建立的多潜能干细胞系同体细胞进行细胞融合从而将体细胞转变成多潜能状态（Miller， R. A. and Ruddle，F. Η·，1976，Tada，M et al.，1997 和 Cowan，C. A et al.，2005)。虽然融 合后的细胞为多倍体，但它们的确具有多潜能性。
[0007] 上述这些研究充分提示了在卵细胞或是多潜能性干细胞中存在着某些可以将体 细胞重编程的物质，但是具体是什么还仍然不清楚。许多人尝试在这些细胞中寻找可以将 体细胞重编程的物质，这其中就包括后来因可诱导多潜能干细胞技术获诺贝尔生理及医学 奖的Yamanaka。Yamanaka早期的研究思路现在看起来非常简单和直接，首先他们根据之前 的研究报道，判断这种重编程因子存在于多潜能细胞的细胞核中。随后他们筛选了 24个在 维持体内外多能性中起重要作用的转录因子，并在接下来的实验中将筛选范围最终缩小到 4个转录因子：0CT4，S0X2，KLF4，cMYC。过表达这四个转录因子的组合可以将小鼠的成纤维 细胞成功逆转为胚胎干细胞状态（Takahashi and Yamanaka, 2006)。早期的报告体系是基 于一个名为Fbxl5的基因表达，但这个基因并不是关键的多潜能干细胞决定因子，因此早 期获得的可诱导多潜能干细胞并不是真正意义上的多能性干细胞，在体内它们无法整合进 宿主的囊胚中去（Takahashi and Yamanaka, 2006)。接下来Yamanaka他们所选用的报告体 系则是基于内源基因0CT4的启动表达，因为这个基因是一个不可或缺的关键多潜能干细 胞决定因子（Nichols et al.，1998)。在重编程过程中内源基因0CT4的启动表达是成功与 否的一个主要标志，通过这个报告体系建立的小鼠可诱导多潜能干细胞同小鼠胚胎干细胞 性质非常接近。更重要的是它们可以在体内发育成为三个胚层的组织并且可以整合进生殖 系统中。另外由于用逆转录病毒介导的4个因子在重编程过程中会随机整合到基因组中， 而体外多潜能干细胞会使这些逆转录病毒表达沉默，随后也有直接通过克隆形态和外源基 因沉默两项指标进行多潜能性判读，这一点在人体细胞重编程上尤为重要（Takahashi and Yamanaka,2006)。
[0008] 由于考虑到介导外源基因的逆转录病毒存在着很大安全隐患，随后人们研发出诸 如外源基因可诱导表达系统（Sommer, C. A et al· ,2009)，转座子技术（Kaji，K et al·， 2009 和Woltjen，K et al.，2009)，非整合腺病毒技术（Stadtfeld，M et al.，2008)，表达外 源基因的mRNA和蛋白技术（Kim，D et al.，2009)或借助化学小分子促进重编程效率。最 终对体细胞重编程技术的改良发展到完全利用化学小分子即可高效安全实现小鼠体细胞 的重编程（Hou et al.，2013)，这一里程碑式的研究也为体细胞无外源转录因子重编程开 启了新的篇章。小鼠成纤维细胞是第一个被用来进行可诱导多潜能干细胞重编程的细胞， 随后很快利用同样的4个转录因子：0CT4, S0X2，KLF4, cMYC可以在人和大鼠体细胞上实 现可诱导多潜能干细胞重编程。而这些通过体细胞重编程得到可诱导多潜能干细胞同这些 物种的胚胎干细胞在外观形态，基因表达和表观遗传修饰上基本毫无差别（Li W et al.， 2009 和 Takahashi and Yamanaka，2007)。此外 James Thomson 等人通过另外 4 个转录因 子0CT4, S0X2, NANOG，LIN28同样可以将人体细胞通过体细胞重编程得到可诱导多潜能干 细胞，并且这些细胞与用Yamanaka的4个因子得到的可诱导多潜能干细胞无异。但是这些 可诱导多潜能干细胞的多潜能性究竟如何并无定论，因为目前为止只有极少数建立的小鼠 多潜能干细胞可以通过最严格的四倍体嵌合实验检测（Boland M J et al.，2009)。近年 来有一些实验室对此进行了进一步的深入研究，结果发现印记基因的不正常表观遗传修饰 是导致可诱导多潜能干细胞的多潜能性下降的一个重要因素 （Stadtfeld et al.，2010)。 筛选那些印记基因表观遗传修饰正常的细胞系可以提高四倍体嵌合成功率（Stadtfeld et al.，2010)。此外在人体细胞重编程的过程中，人们还发现体外获得的人可诱导多潜能干细 胞在分子水平具有其初始来源细胞的记忆性，在体内和体外分化过程中，这些可诱导多潜 能干细胞具有明显的分化倾向性，即更易于分化成为初始细胞来源的组织类型（Polo J Μ et al·，2010和Kim et al·，2010)。但是如果将这些可诱导多潜能干细胞进行体外长期传 代则可以在一定程度上消除这种分化倾向性，从而使其更接近真正意义上的多潜能干细胞 (Polo J M et al. ,2010)〇
[0009] 尽管随后越来越多其他动物物种的可诱导多潜能干细胞被人们建立出来，其中包 括由我们实验室首次建立的恒河猴可诱导多潜能干细胞（Liu H et al.，2009)。但是这 些可诱导多潜能干细胞除了啮齿类动物的以外，无一例外都和它们的胚胎干细胞一样，与 小鼠胚胎着床后原始外胚层（Epiblast)相近，而不具备胚胎内细胞团性质。而这也说明， 如果没有一个合适的体外培养条件，除了啮齿类动物其它动物无论是从胚胎直接建系还是 从体细胞重编程得到的多潜能干细胞，其体外既定命运是一种原始外胚层样多潜能状态 (Ezashi et al·，2009，Han X et al·，2011 和 Koh S et al·，2012)。因此如何在体外获得 其它物种的内细胞团样多潜能干细胞便成了干细胞研究领域最热门的问题之一。
[0010] (三）体外建立动物和人类内细胞团样干细胞研究现状
[0011] 从2008年由应其龙等人在小鼠体系上发现LIF/2i这一内细胞团样多潜能干细 胞体外维持条件后，人们一直好奇这个条件能否应用在体外建立其它动物物种的内细胞 团样多潜能干细胞上。尽管之前在小鼠体系上积累了很多线索。例如，小鼠原始外胚层样 多潜能干细胞在体外长期用 LIF/2i (Bao S et al·，2009)，或 Kenpaullone/CHIR99021 处 理（Hanna J et al·，2009)，亦或是过表达 Nanog，Klf2，Klf4，Stat3，Nr5a，cMyc，Tcfp211 等转录因子的情况下可以转变为内细胞团样多潜能干细胞（Hanna J et al. ,2009, Silva J et al. ,2009, Hall J et al. ,2009, Guo G et al. ,2009, Yang J et al. ,2010, Guo G &11(13111；[1:114,2010和1&11^61106 6七31.，2013)。而小鼠内细胞团样多潜能干细胞也可 以在bFGF/Activin A/TGF-β的作用下转变为原始外胚层样多潜能干细胞（Brons I G M et al.，2007)。此外用bFGF/Activin A/TGF-β的条件也可以直接从小鼠胚胎内细胞团 建立原始外胚层样多潜能干细胞，或者将小鼠体细胞重编程为原始外胚层样多潜能干细胞 而不是内细胞团样多潜能干细胞（Brons I G M et al. ,2007)。这些研究结果充分说明了 胚胎内细胞团样多潜能性状态和原始外胚层样多潜能性状态是受外界培养环境所调控的。 但是当人们花费了大量精力，尝试了种种条件，希望能在体外建立其它动物物种的内细胞 团样多潜能干细胞，尤其是以人类为代表的灵长类物种内细胞团样多潜能干细胞时，结果 却都以失败告终。例如一些实验室将人的着床前胚胎直接用LIF/2i体系进行体外培养， 希望能够建立像小鼠胚胎干细胞一样的内细胞团样多潜能干细胞。然而简单的LIF/2i体 系在人胚胎中并不能维系其多能性状态。尽管如此，人们仍试图通过将人的体细胞经由体 外重编程，或是将已建立的人原始外胚层样多潜能干细胞直接转变为内细胞团样多潜能性 状态（Hanna J et al.，2009)。在这些努力中，有的通过过表达更多的内细胞团样多潜能 性相关基因，如KLF4, KLF2, NANOG等（Hanna J et al.，2009)，并结合一些化学小分子，如 A-83-01，f0rsk0lin等将人的体细胞或原始外胚层样多潜能干细胞转变为内细胞团样多潜 能性状态（Hanna J et al.，2009)。另外在同时加强RA信号通路下游RAR-γ，和一个核受 体信号Nr5a2后，也可以使人的体细胞经重编程直接到达内细胞团样多潜能性状态（Wang W et al.，2011)。还有些研究尝试避免引入外源转录因子，建立稳定的人内细胞团样多潜 能干细胞系，这些研究中所使用的小分子诸如Η)0325901和SB203580, 丁酸钠，NM23-H1， Dzn印等等，对维持内细胞团样多潜能性状态都有一定的效果（Hanna J et al.，2009，Xu Y et al·，2010, Ware C B et al·，2009 和 Smagghe B J et al·，2013)。另外还有利用一些 如低氧等物理条件进行尝试的（Lengner C J et al.，2010)。但是所有以上尝试都无法在 体外建立一个确定的培养方式来获得真正意义上的人内细胞团样多潜能干细胞。对外源基 因的持续性依赖，分化缺陷，缺乏像小鼠胚胎干细胞一样的性状，以及重复性差都是体外建 立真正意义上的人内细胞团样多潜能干细胞需要克服的障碍（Hassani S N et al.，2013)。 直到最近，一些最新的研究结果使得在体外利用小分子建立稳定的不依赖外源基因的人内 细胞团样多潜能干细胞系成为可能。但是这些研究中所使用的小分子条件与在小鼠内细胞 团样多潜能干细胞上的条件差异很大，也给寻找从其它动物物种上建立体外内细胞团样多 潜能干细胞的条件带来了困扰（Gafni 0 et al·，2013, Chan Y S et al·，2013 和 Ware C B et al.，2013)。目前人们急需建立动物物种体外内细胞团样多潜能干细胞来帮助理解体 外动物内细胞团样多潜能干细胞的建立及维持条件。
[0012] 参考文献：
[0013] Aruga, J. , Minowa, 0. , Yaginuma, Η. , Kuno, J. , Nagai, Τ. , Noda, Τ. , and Mikoshiba,Κ· (1998) · Mouse Zicl is invol