使用表达巢蛋白的干细胞显像新生血管的血管发生模型的制作方法

专利名称：使用表达巢蛋白的干细胞显像新生血管的血管发生模型的制作方法
技术领域：
公开的发明涉及这样的观察，即巢蛋白(nestin)表达是内皮细胞增殖的 标记。巢蛋白表达对血管发生而言是一种特别有效的标记物，特别是针对 与肺瘤相关的血管发生。具体地，巢蛋白可以作为一种针对诸如神经胶质 瘤、血管母细胞瘤、神经鞘瘤、髓母细胞瘤、和脑膜瘤的脑部肿瘤的极好 的内皮标记物。
背景技术：
巢蛋白和波形纤维蛋白(vimentin)与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)—样是一 种中间连丝(intermediate filament),并4皮4企测到大量存在于生长中的大鼠和 人的胚胎中枢神经系统中的神经上皮干/祖细胞中(Lendahl, U等人，Cell (1990) 60: 585-595; Messam， C A.等人，Exp. Neurol. (2000) 161: 585-596 ; Tohyama, T.等人，Lab. Invest. (1992) 66: 303-313; Tohyama, T，等人,Am. J PathoL (1993) 143:258-268))。巢蛋白也许和波形纤维蛋白一起，通过神经 上皮细胞中的共聚合作用形成中间连丝束(Eliasson, C.等人，J. Biol. Chem. (1999) 274: 23996-24006 ; Rutka, J, T.等人，Int. J. Dev. Neurosci. (1999) 17: 503-515)。
巢蛋白mRNA在处于胚胎发育期第15天(E15)的大鼠胚胎的大脑中高 度表达，然后下降直到产后第12天(P12)，并且从产后第18天到成体期消 失(Lendahl, U.等人，同上)。使用小鼠中巢蛋白转基因促进的P-半乳糖苷酶 表达分析，在神经管闭合(E9)后立即在神经上皮细胞和体节中检测到LacZ 活性(Zimmerman,L.等人，Neuron (1994) 12: 11-24)。在E14.5和E16.5 ， LacZ染色在小鼠胚胎紋状体和大脑皮层中增生的脑室区域变得更强，在成熟皮 层中表达水平下降，局限在室管膜细胞群中。
在人类神经胶质瘤和成胶质细胞瘤中也检测到基本的巢蛋白表达
(Dahlstrand, J.等人，CancerRes (1992) 52: 5334-5341)。同诸如纤维状细胞的 星形细胞瘤这样的次恶性形式相比，在高度恶性的神经胶质瘤尤其是成胶 质细胞瘤中频繁观察到巢蛋白的免疫染色。相反地，在非肿瘤的脑组织中 很少可通过免疫染色检测到巢蛋白，但巢蛋白有时在血管内皮中有微弱的显示。
巢蛋白mRNA大概长6.2千碱基，并且其基因包含三个内含子。有趣 的是，神经上皮细胞特异性的巢蛋白表达是由巢蛋白基因的第二个内含子 驱动的，而肌肉前体特异性表达却是由第 一个内含子驱动的(Lothian, C.等人: Eur. J. Neurosci. (1997) 9: 452-462; Zimmerman, L，等人，同上)。
先前在七种人类神经胶质瘤/成胶质细胞瘤衍生的细胞系中检验到了 巢蛋白的表达(Kurihara， H.等人.，Gene Cher. (2000) 7: 686-693)。根据 Northern印迹分析，表达水平从高(U251， KG-1C)到无法检测(NP-2， LN-Z308, T98G)之间变化。虽然恶性化的程度总体上反映了紳瘤在体内的倍 增时间，然而表达的水平并不和细胞系的生长速度平行。神经细胞特异性 的调节物，包括在基因5'上游区域之前的第二个内含子，驱动LacZ以和每 一细胞系中mRNA表达水平相应的程度表达(Kurihara,H.等人，同上)。这 种神经胶质瘤/成胶质细胞瘤细胞系中巢蛋白表达水平的可变性导致了对 从低度到高度恶性化过程中人类神经胶质瘤/成胶质细胞瘤中的巢蛋白表 达的重新评^\
虽然在结肠直肠癌内皮中报导了许多和血管发生相关的基因，但巢蛋 白并未包括在其中(Croix， B. S.等人，Science (2000) 289: 1197-1202)。在脑肿 瘤内皮中的与血管发生相关的基因可能与在结肠直肠癌内皮中的不同。值 得注意的是即使在脑肿瘤细胞中没有发现巢蛋白表达，在脑肿瘤内皮中也 发现了强烈的巢蛋白表达。
发明概述
表达巢蛋白的细胞，其由能在再生中的表皮和真皮中增殖的荧光蛋白 (FP)来标记，反映了巢蛋白阳性的细胞群体，这些细胞在应答于损伤时出现增殖并从靠近病灶位点的突起迁移。巢蛋白表达作为与肿瘤相关的血管发 生的标记特别有用。具体地，巢蛋白可以作为针对诸如神经胶质瘤、血管 母细胞瘤、神经鞘瘤、髓母细胞瘤、和脑膜瘤等脑部肿瘤的极好的内皮标 记物而起作用。因此，已描述的发明具有作为一种血管发生模型的用途。
在优选的实施方案中，公开的发明涉及一种监测血管发育的方法，包 括提供血管发生干细胞，其中所述干细胞包含表达盒，该盒编码在巢蛋白
调控元件遗传控制下的荧光蛋白(FP);在宿主中培养'所述干细胞；并且监测 导致血管发育的干细胞的血管发生活性。
在本发明的一方面，血管发生干细胞是表达巢蛋白的细胞，例如毛嚢 细胞或者肺瘤细胞。这些细胞能够在体外或者体内生长。肿瘤细胞的例子 包括黑色素瘤、神经胶质瘤、血管母细胞瘤、神经鞘瘤、髓母细胞瘤、和 脑膜瘤。
本发明的另 一方面利用了 一种或多种在巢蛋白调控元件控制下的荧光 蛋白。这些蛋白质的例子包括绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝 色荧光蛋白(BFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。优选地，巢蛋白调控元件是由人巢 蛋白基因第二内含子编码的。
本发明的另一方面涉及利用宿主生物体。宿主生物体优选是脊推动物。 特别优选的宿主生物体是哺乳动物或者鸟类。优选的哺乳动物宿主的例子 包括小鼠、大鼠、兔、犬和猫。优选的鸟类宿主的例子包括鸡和鸡卵。
在公开的本发明的一个实施方案中，血管发生干细胞包括巢蛋白调控 下的第一荧光蛋白，并且宿主生物体包含巢蛋白调控下的第二荧光蛋白， 其中第一荧光蛋白不同于第二荧光蛋白。
公开的本发明的另一个实施方案涉及筛选血管发生调节剂的方法，包 括提供血管发生干细胞，其中干细胞包含表达盒，该盒编码一种在巢蛋白 调控元件遗传控制下的荧光蛋白(FP);在血管发生调节试剂存在时于宿主中 培养这种干细胞；并且其中监测所述干细胞的血管发生活性。
本发明还涉及
1. 一种监测血管发育的方法，包括
提供血管发生干细胞，其中所述干细胞包含表达盒，该表达盒编码在 巢蛋白调控元件遗传控制下的荧光蛋白； 在宿主中培养所述干细胞；和监测导致血管发育的干细胞血管发生活性。
2. 项1的方法，其中所述血管发生干细胞是表达巢蛋白的细胞。
3. 项2的方法，其中所述表达巢蛋白的细胞是毛嚢细胞。
4. 项3的方法，其中所述毛嚢细胞生长在体外培养物中。
5. 项2的方法，其中所述表达巢蛋白的细胞是肿瘤细胞。
6. 项5的方法，其中所述肿瘤细胞来自选自黑色素瘤、神经胶质瘤、 血管母细胞瘤、神经鞘瘤、髓母细胞瘤和脑膜瘤组成的组的肿瘤类型。
7. 项1的方法，其中所述焚光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、红色焚 光蛋白(RFP)、蓝色焚光蛋白(BFP)和黄色荧光蛋白(YFP)组成的组。
8. 项1的方法，其中所述巢蛋白调控元件是由人巢蛋白基因第二内含 子编码的。
9. 项1的方法，其中所述宿主生物是脊推动物生物体。
10. 项9的方法，其中所述宿主生物体是哺乳动物或鸟类。
11. 项10的方法，其中所述哺乳动物宿主选自小鼠、大鼠、兔、犬和 猫组成的组。
12. 项9的方法，其中所述宿主生物体是鸡或者鸡卵。
13. 项1的方法，其中所述血管发生干细胞包含处于巢蛋白调节控制 下的第一荧光蛋白，并且宿主生物包含处于巢蛋白调节控制下的第二荧光 蛋白，其中的第一荧光蛋白不同于第二荧光蛋白。
14. 一种筛选血管发生调节剂的方法，包括
提供血管发生干细胞，其中所述干细胞包含表达盒，该表达盒编码在 巢蛋白调控元件遗传控制下的荧光蛋白；
在血管发生调节试剂存在下于宿主细胞中培养干细胞；和 其中监测所述干细胞的血管发生活性。
15. 项14的方法，其中所述血管发生干细胞是表达巢蛋白的细胞。
16. 项15的方法，其中所述表达巢蛋白的细胞是毛嚢细胞。
17. 项16的方法，其中所述毛嚢细胞生长在体外培养物中。
18. 项15的方法，其中所述表达巢蛋白的细胞是肿瘤细胞。
19. 项18的方法，其中所述肺瘤细胞来自选自黑色素瘤、神经胶质瘤、 血管母细胞瘤、神经鞘瘤、髓母细胞瘤和脑膜瘤组成的组的肺瘤类型。20. 项14的方法，其中所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、红色 荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)和黄色荧光蛋白(YFP)组成的组。21. 项14的方法，其中所述巢蛋白调控元件是由人巢蛋白基因第二内 含子编码的。22. 项14的方法，其中所述宿主生物是脊推动物生物体。23. 项22的方法，其中所述宿主生物体是哺乳动物或鸟类。24. 项23的方法，其中所述哺乳动物宿主选自包括小鼠、大鼠、兔、 犬和猫组成的组。25. 项23的方法，其中所述宿主生物体是鸡或鸡卵。26. 项14的方法，其中所述血管发生干细胞包含处于巢蛋白调节控制 下的第一荧光蛋白，并且宿主生物包含处于巢蛋白调节控制下的第二荧光 蛋白，其中的第一荧光蛋白不同于第二荧光蛋白。附图简述图la-e显示了来自ND-GFP转基因小鼠背侧皮肤真皮面的视图。图中 标尺代表100pm的距离。图2a-g显示了植入棵鼠皮下组织的ND-GFP触须毛嚢(vibrissa follicle) 图像(标尺，100pm)。图3a-c显示了在棵鼠肾嚢之下移植的ND-GFP触须毛嚢的图像(标尺， 100,)。图4a显示了移植前分离的ND-GFP触须毛嚢。图4b显示了移植后10 天棵鼠受创伤皮肤中的ND-GFP触须毛嚢图像。图4c和4d显示了来自图 4b区域的高放大倍数图像，显示为白色阴影框。图4e是ND-GFP触须毛嚢 移植进入创伤棵鼠皮肤的示意图。(标尺，100(im)实施发明的方式公开的本发明提供了研究血管发生的模型系统。在一个优选的实施方 案中，血管发生内皮干细胞由编码荧光蛋白的表达系统标记，所述荧光蛋 白的表达由已被公开为来自在血管发生内皮干细胞中优选表达的基因的调 控序列所控制。所述表达系统提供可视标记物用来观察血管发生过程。表优选用于控制标记蛋白的表达。因此，公开的模型系统使用编码一种或多 种巢蛋白调控序列控制下的荧光蛋白的血管发生干细胞来模拟血管发生。血管发生干细胞公开的模型系统使用标记的祖细胞或干细胞作为血管发生的标记物。 巢蛋白表达对于干细胞诸如中枢神经系统干细胞、神经上皮干细胞和毛嚢 鞘祖细胞是极好的的标记物。巢蛋白也是某些癌细胞的极好的标记物，如黑色素瘤(melanoma)和具体是脑肿瘤诸如神经胶质瘤(glioma)、血管母细胞 瘤(hemangioblastoma)、 神经鞘瘤(Schwannoma)、 髄母细胞瘤 (medulloblastoma)、 禾口月S月莫瘤(meningioma)。巢蛋白是一种中间连丝，它可作为中枢神经系统祖细胞的标记。具体 地，具有巢蛋白调控序列控制下的绿色荧光蛋白的转基因小鼠已经生成并 用于中枢神经系统干细胞的自我更新和多潜能的显示。虽然，在一个优选 的实施方案中，巢蛋白可能与检测试剂诸如绿色荧光蛋白连接以利于分离 过程，这些细胞的其它标记能用于分离毛嚢干细胞以及其它任何检测试剂。 例如，可以在体外或原位对细胞进行测定并4企测标记的结合伴倡、抗体、 或者结合的核酸。在将毛嚢干细胞(hair follicle stem cell)附着于固体支持物 上的实施方案中，测定可以采用其它类型的信号分子，其中未结合的信号 分子能与结合在细胞上的信号分子分离。例如，信号分子可用放射性同位 素(例如，125I， 131I， 35S, 32P， 14C或3H);光散射标签(Genicon Sciences Corporation, San Diego，CAand see等，美国专利号6,214, 560);酶或蛋白质 标签(例如焚光蛋白(FP)或过氧化物酶)；或另一种发色标记或染料(例如， 德克萨斯红)进行标记。此外，FACS或其它的细胞分离机制可以用于分离 细胞。毛嚢干细胞的定位根据毛发周期而变化。在巢蛋白-FP转基因小鼠的毛 发初始生长的早期，表达巢蛋白的细胞定位于位于毛嚢干细胞所在的毛嚢 突起中的皮脂腺正下方的永久上端毛嚢(permanent upper hair follicle)之中。 在突起部分的表达巢蛋白的细胞相对较小，呈卵形并通过小的树突相互连 接而围绕着发干(hair shaft)。图3显示了毛嚢中表达巢蛋白的细胞的定位是 依赖于毛发周期的。在毛发生长终期(telogen)和毛发初始生长初期，荧光蛋 白阳性的细胞，例如，表达巢蛋白的细胞，主要位于突起区域(bulgearea)。在毛发生长终期和毛发初始生长的早期已经看到表达荧光蛋白的毛嚢干细 胞。来自于毛发生长终期的毛嚢干细胞显示为是原始的并且已经定位，它 们优选进行收获，虽然这些细胞可以从毛发周期的任何阶段收获。申请号10/251，657,题为"巢蛋白表达的毛嚢干细胞"的美国专利探讨了收获的技术， 在此处引用作为参考。在毛发初始生长中期和晚期，表达荧光蛋白的细胞定位于上部外根鞘 和突起区域而不是毛发基质球中。这些观察结果提示表达巢蛋白的细胞形 成了外根鞘，其与观察到的毛嚢干细胞的行为一致。免疫组织化学染色的 结果显示巢蛋白、荧光蛋白、角蛋白5/8和角蛋白15共定位于毛嚢突起细 胞、外根鞘细胞和皮脂腺的基底细胞中。这些数据进一步表明在毛嚢突起 部中表达巢蛋白-荧光蛋白的细胞是毛嚢干细胞。巢蛋白驱动的绿色荧光蛋 白也一皮发现在嚢间神经状网络中高度表达。神经干细胞中、毛嚢干细胞中 和嚢间神经状网络中巢蛋白的普遍表达提示它们的共同起源。在一般应用中，将标记的细胞引入宿主生物体，在这里细胞生长并且 分化以形成新生血管。新生血管一般与宿主生物体中存在的血管交叉合流 (anastomosis)。利用标准的植入方法诸如移植、经皮注射和植入可以将标记 的细^^植入到任何合适的宿主中并且让其发展和发育。才直入可以以本领域已知的任何方式来实施。在一个实施方案中，将毛 嚢干细胞或由其分化的细胞经系统注入受试者体内。在另一方面，将毛嚢 干细胞或由其分化的细胞直接注入受试者的器官或组织中。优选地器官或 组织是视网膜、大脑、肝或与心血管相关的组织或肌肉，例如心脏或肺。 另外，也涉及附着或生长在合成支持物上然后进行植入的细胞或组织。与 由其源细胞而来的受试者相比，毛嚢干细胞或由其分化的细胞能够被异源 移植到不同受试者中。然而，由于毛嚢干细胞的可得性，在一个优选的实 施方案中细胞能够从待治疗的受试者体内获取并且如果需要，可以生长以 提供分化的细胞，并且可以对干细胞或分化的细胞进行自体移植。由于本 发明的干细胞足够原始因而当移植时宿主不太可能排斥所述细胞，所以还 考虑了毛嚢干细胞库的用途。将标记细胞移植入脊推动物中的技术包括通过在需要位置的进行手术 原位移植(SOI)的直接移植。肾嚢中的移植是优选的种植位点。当标记的细 胞是胂瘤细胞时，移植的位点一般是肿瘤细胞来源的位置。合适的位点包括肺、肝、胰腺、胃、乳房、卵巢、前列腺、骨髓、大脑和其它对恶性敏 感的组织。 一旦标记细胞已经移植，脊推动物就成为用于研究血管发生的 模型系统。标记的细胞于是可以发展发育并且在脊推动物远离种植位点的 位点监测FP标记细胞的出现。监测可以对脊推动物整体进行直接观察，例 如用荧光显微镜，或将组织切片进行显微检查。用作模型的合适的脊推动物受试者优选哺乳动物受试者，最优选诸如 兔、大鼠、小鼠、犬、猫等方便的实验动物。为了和人类受试者更接近的 相似性，应该使用灵长类动物。特别有用的受试者是对肺瘤发育敏感的受 试者，例如有受损免疫系统的受试者， 一般为棵鼠或SCID小鼠。任何适当 的脊推动物受试者都能使用，主要根据方便以及与最终目标系统的相似性 指导受试者的选择。体外系统如组织培养物也能作为合适的宿主。适合于 这种研究的系统包括固体支持的培养物诸如那些在胶原凝胶等上维持的培 养物。标记的细胞可以通过在体外使用标准的直接基因传递方法或者在体内 从转基因宿主中收获标记的细胞而制备。直接的基因传递方法包括使用脂质体、磷酸4丐沉淀、电穿孔和基因枪。优选脂质体转染。例如，优选地使用编码在巢蛋白调控元件控制下的荧光蛋白或其它标记的逆转录病毒载体 制备标记的癌症细胞。优选地荧光蛋白标记的毛嚢干细胞从转基因动物源 中收获。巢蛋白表达调控元件用于区别性地驱动血管发生干细胞中编码荧 光蛋白的序列的表达，由此制成干细胞标记物用于血管发生。荧光蛋白所述模型通常涉及产生一种或多种荧光蛋白标记的细胞。荧光蛋白标 记的细胞是通过将表达系统导入宿主细胞而制得，其中表达系统包括在一 种或多种巢蛋白调控序列控制下的荧光蛋白。在一个优选的实施方案中， 对脊推动物宿主生物体优选哺乳动物或鸟类宿主进行修饰以包含一种或多 种荧光蛋白标记的细胞。对这些细胞进行培养或让其在宿主生物体内生长。多年来多种焚光蛋白已经被用作标记。最初分离的蛋白发射绿色波长并且被称作绿色焚光蛋白(GFP)。因此，尽管包括红色荧光蛋白、蓝色荧 光蛋白和黄色荧光蛋白等的多种颜色蛋白已经得到制备，通常绿色荧光蛋 白仍成为这些荧光蛋白的通用标记。这些蛋白的性质已经在下述文献中探讨过，例如美国专利6，232, 523; 6, 235， 967; 6, 235，968和6,251,384,在此 将其全部引用作为参考。这些专利描述了使用各种颜色的荧光蛋白监测转 基因鼠中细胞生长和肺瘤转移。另外，在美国专利申请号09/812,710中这 些荧光蛋白已经用于监测由启动子介导的表达；在美国专利申请号 10/192,7400中用于监测细菌感染并且在美国临时申请号60/425， 776中用 于监测细胞分离。在美国临时申请号60/404,005和60/427,604中披露了 使用不同颜色的荧光蛋白标记细胞的细胞核和细胞质，由此在美国临时申 请号60/445， 583中描述了相同颜色的一致荧光。在此引用所有这些文献作 为参考。巢蛋白巢蛋白是一种可作为祖细胞或干细胞标记物的中间连丝基因。(智人属 (//omo ^p/ms)巢蛋白(NES)， mRNA (NM-OOMH))。巢蛋白的表达将干 细胞和更加分化的细胞区分开来。神经上皮干细胞表达巢蛋白并且当它们 由增殖性干细胞分化成有丝分裂后的神经元时强烈下调巢蛋白(Lendahl，等 人，(1990) Cell 60: 585-595.)。巢蛋白也在肌肉前体中表达但不在成熟肌肉 细胞中表达。在转基因动物中，巢蛋白基因第一和第二内含子中独立的细 胞类型特异性元件分别一致地将报告基因的表达指向发育中的肌肉和神经 前体。巢蛋白第二内含子包含一个在中枢神经系统干细胞中行使功能的增 强子(Zimmerman，等人，(1994)N euron 12: 11-24; (//owo s，.em nestin gene, intron2 (AF004335))。这些元件的鉴定有利于对发生在某些祖细胞或干细胞 最终分化时，对基因表达转换控制机制的分析。下列实施例意在说明公开发明的范围，并不以任何方式对其进行限制。实施例1增殖性上皮细胞表达巢蛋白如由在静态培养的牛主动脉内皮细胞中表达的高水平巢蛋白所表明 的，增殖性上皮细胞表达巢蛋白。在下面讨论的实施例中使用牛主动脉内 皮细胞(BAECs)以检查内皮巢蛋白的表达。内皮巢蛋白在静态培养中通过细胞分裂而增殖，而增殖在生理层流(大约15 dyn/cm2)下降低(Malek， A. M.等人，JAMA (1999) 282 : 2035-2042)。通 过Northern印迹分析和免疫染色检测到巢蛋白在静态培养的BAECs中强烈 表达。为了检查巢蛋白表达是否是增殖依赖的，对BAECs进行15 dyn/cm2 的切变压力流测试持续12小时。将用剃刀从牛胸主动脉内表面刮下的牛主动脉内皮细胞(BAECs)用于 后面实验中。随后将BAECs在含有具有20%胎牛血清的RPMI 1640的6孔 板里进行培养。当BAECs形成了直径3到6 mm的集落时，将细胞转移到 新的6孔板中，其中胎牛血清减少到10%。通过7到12次传代对生长在卵 石状片层构造中的培养细胞系进行选择并保存在液氮中备用。在0.5mm厚的石英盖玻片上培养BAECs。翻转盖玻片并放置于平行平 板式流动槽中(内部尺寸16 mm宽x35mm长x200mm深)，正如先前描 述的(Negishi， Y.等人，XPterioscler. Shromb. Vasc. Biol. (2001) 21: 785-790)。将 此装置于37。C放置在C02培养箱中。在先前描述过的方程的基础上计算切 变压力强度(Negishi, Y.等人，同上)。流速调整到15 dyn/cm2，和生理流速相 适应。接下来在pH 7.4的含4%聚曱醛的0.1 M磷酸緩冲液中固定BAECs持 续24小时(组织)或1小时(培养的细胞)。使用含50mMNH4Cl的PBS 处理BAECs以淬灭任何游离的曱醛，接着在第一抗体温育前通过0.1%皂苷 和0.4%牛血清白蛋白处理使其具有通透性。首先将BAECs和1: 5000稀释 的抗巢蛋白的第一抗体一起温育。对于BAECs,第二抗体使用吲哚二羧基 氰(indodicarbocyanide)偶联的亲和纯化的驴抗兔IgG (红色)(Jackson hnmunoresearch, West Grove, Peimsylvania)。 纟田月包才亥通过4 ， 6- 二氛基 (diamidino)-2-苯基吲哚复染为蓝色。为了 Northern印迹分析，从BAECs中提取总RNA，通过6. 3%曱醛/ 50%曱酰胺变性，在含6.6°/。曱醛的1.0%琼脂糖凝胶上电泳，随后印迹到尼 龙膜上(Amersham Life Science, Tokyo, Japan)。使用来自人巢蛋白DNA片段 (560 bp)的探针进行杂交，该才果针通过随机引发法(random priming procedure) 用"P脱氧-CTP标记。甘油醛-3-磷酸脱氪酶探针用作对照。为了进行Western印迹，在裂解緩沖液(70 mM Tris-HCl, pH 6.8， 11.2% 甘油，3% SDS, 0.01%溴酚蓝，5% 2-巯基乙醇)中溶解U251人成胶质细胞瘤细胞获得细胞裂解物。随后将细胞裂解物在还原条件下于7.5%聚丙烯酰胺
凝胶上电泳，随后印迹到硝酸纤维素膜上用l:7500稀释的兔抗人巢蛋白抗 血清进行探测。巢蛋白印迹使用ECL探测系统(Amersham, Buckinghamshire, United Kingdom)进行检测。
通过Northern印迹分析发现巢蛋白mRNA的表达随切向压力流而显著 减弱。而且，通过免疫染色确认了流动依赖性(flow-dependent)巢蛋白表达下 降。
实施例2
对于大脑肿瘤的巢蛋白免疫染色
通过注射合成的覆盖人巢蛋白序列c末端n个氨基酸的寡聚肽在家兔
中激发针对巢蛋白的多克隆抗体。通过Western印迹发现此抗体与从U251 细胞提取的210到240kD蛋白质反应，正如先前报道的一样(Messam, C. A. 等人，同上；Tohyama, T.等人，同上(1992))。免疫印迹显示为双重体 (doublet),可能因为碳水化合物的修饰差异导致，正如先前报道的那样 (Messam,C.A.等人，同上)。当合成的寡聚肽加入到U251细胞裂解物中时免 疫印迹消失，表明免疫印迹代表巢蛋白。
使用包括波形纤维蛋白、GFAP、角蛋白和肌间线蛋白(desmin)的其它 中间连丝进一步检验这种抗体的交叉反应性。针对人波形纤维蛋白的抗体 和U251与HeLa细胞提取物的反应都显示出略超过50-kD分子量标记位置
的条带，但和HeLa细胞提取物的反应则没有。使用合并的小鼠单克隆抗体， 抗细胞角蛋白AE1/AE3检测角蛋白，所述抗细胞角蛋白AE1/AE3识别酸性 和碱性角蛋白的广泛亚家族。所述抗细胞角蛋白AE1/AE3识别来自HeLa 细胞提取物中大约50kD的蛋白，但与U251细胞提取物反应微弱。针对人 肌间线蛋白的抗体与U251和HeLa细胞提取物的反应没有显示任何条带。 非免疫的(nonimmune)兔血清与U251和HeLa细胞提取物反应没有显示任何 人工(artifactual)条带。因此，针对巢蛋白的抗体显示出与先前报道的巢蛋白 分子大小的蛋白质相应的大条带(Messam, C. A.，等人,同上；Tohyama, T.等 人，同上(1992))，但其并不与其它中间连丝发生交叉反应。随后用这种抗体对71个脑肿瘤样本进行免疫染色。71个人脑肿瘤样本
包括57个神经胶质瘤和14个其它脑肿瘤。神经胶质瘤包括6个世界卫生 组织(WHO)—级肿瘤、11个二级肿瘤、18个三级肿瘤和22个四级肿瘤。 其它脑肺瘤包括4个血管母细胞瘤、3个脑膜瘤、2个非典型脑膜瘤和两个 神经鞘瘤。全部71个脑肺瘤都在Gunma大学医学院 (Gunma University School of Medicine )神经外科切除。这些诊断建立在依据位于Gunma大学 医学院(Gunma University School of Medicine )病理学系的修订版WHO分 类的常规病理检验的基础上。
在含4。/。聚曱醛的0.1 M磷酸緩沖液、pH7.4中固定人脑肿瘤和肺瘤组 织持续24小时(组织)或1小时(培养的细胞)。小片的组织样本包埋入 优化的切片温度化合物中以进行显微切片。组织切面首先和1: 5000稀释的 针对巢蛋白的第 一抗体一起温育。对于大脑或肿瘤组织，可使用LSAB2/HRP 染色试剂盒作为第二抗体反应系统。步骤包括第二抗体反应然后是和辣根 过氧化物酶标记的《连霉亲合素系统的酶反应。在酶反应中，过氧化物酶催 化3-氨基-9-乙基咔唑(ethylcarbazole)成为可溶的棕色产物。
尽管如前所述(Dahlstrand， J.，等人,同上)一些血管内皮细胞显示出偶然 的微弱染色，但正常大脑皮层组织不会被这种抗体免疫染色。在胶质母细 胞瘤(glioblastoma)(WHO IV级)中， 一般的巢蛋白染色随着肿瘤细胞发育进 程呈纤丝分布。在这种肺瘤中染色的强度被分类为4+。巢蛋白染色也在圆 形肺瘤细胞中以钮状(button-like)簇的形式明显存在(恶性寡聚星形瘤细胞 (anaplastic oligoasgrocytoma),染色强度3+)。在一些III级和IV级的神经胶 质瘤中，染色局制在增殖的内皮，(胶质母细胞瘤，IV级)(恶性寡聚突胶质 细胞瘤，III级)。在低等级的神经胶质瘤中，在相当数量的肿瘤中染色微弱 到可以忽略，但沿着肺瘤的内皮可以注意到清晰的染色，(寡突胶质细胞瘤, II级)。在其它脑肿瘤(神经鞘瘤和脑膜瘤)中这种趋势更明显，它们的内皮有 针对巢蛋白的强烈阳性免疫染色然而肿瘤细胞却一点也没有染色。因此， 肿瘤内皮细胞表达巢蛋白与恶性的WHO等级无关。
实施例3
血管母细胞瘤中的巢蛋白表达由于巢蛋白在增殖中的内皮细胞中表达，怀疑它甚至在血管母细胞瘤 中表达，这是因为成血管母细胞被认为是造血细胞和成血管细胞的前体
(Eichmann， A.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. UNA (1997) 94: 5141-5146)。为了
检查这种组织，检测了四种人血管母细胞瘤。 一种内皮细胞标记，von Willebrand因子，可以沿着血管母细胞瘤的内皮和孩支细管进行阳性免疫染色 (Bohling， T.,等人.，IARC Press (2000), Lyon, France, 223-226)。
巢蛋白也主要地在血管母细胞瘤的微细管中进行免疫染色。然而包含 稀薄细胞质和突起状(convex-shaped)细胞核的常见内皮细胞不是巢蛋白染 色阳性的。因为内皮细胞的外形类似于普通脉管，这种类型的内皮细胞可 以被很好的区分并且缺失了巢蛋白表达。包含血管母细胞瘤的巢蛋白阳性 细胞可以反应真正转变的血管母细胞瘤。因此，巢蛋白不仅是针对神经上 皮干细胞与神经胶质瘤也是针对血管母细胞瘤和正在增殖的内皮细胞的标 记蛋白质。
实施例4
血管母细胞瘤中的巢蛋白免疫染色
中间连丝蛋白质，巢蛋白，标记中枢神经系统的祖细胞。 通过将绿色荧光蛋白放置于巢蛋白调控序列的控制之下来选择性标记 祖代(progenitor)中枢神经系统干细胞。先前已经披露了在毛发初始生长早期 或毛嚢生长阶段、在巢蛋白-绿色荧光蛋白转基因小鼠中由绿色焚光蛋白荧 光标记的表达巢蛋白的细胞，出现在位于毛嚢干细胞所在的毛嚢突起中的 皮脂腺的正下方的永久上端毛嚢里。这就是毛嚢外根鞘干细胞的定位位点。 位于突起部分的表达巢蛋白的细胞相对较小，呈卵形并通过小的树突相互 连接围绕着发干。表达巢蛋白的细胞在毛嚢中的精确定位随毛发周期而变 化。
这些观察结果显示表达巢蛋白的细胞对皮肤的再生发挥作用。这些数 据显示在毛嚢突起部位的由绿色荧光蛋白标记的表达巢蛋白的细胞确实不 仅是毛囊外根鞘的而且也是表皮的祖细胞。
目前使用了皮肤创伤的几种不同模型并且每一种模拟了.临床情况的不 同方面且准确性的程度不同。经过穿孔活体检查损伤后在第1、 3、 5、7和 9天测定皮肤伤口的巢蛋白-绿色荧光蛋白表达。在第5天表达巢蛋白的细胞更广泛地散布于真皮和表皮的基底层之中。到了第3天，检测到了巢蛋
白-绿色荧光蛋白表达细胞的增加，并在损伤后第5到9天达到了最大的免
疫强度。
近来，Taylor, G.等人在Cell (2000) 102: 451-461中报导毛囊突起干细胞 具有潜在的双能性，这是因为它们不仅能生成毛嚢细胞也能生成上皮细胞。 其它的实验也提供了成年小鼠触须(触须线)毛嚢上端外根鞘中包含多潜 能干细胞的证据，此干细胞可以分化成为毛嚢基质细胞、皮脂腺基底细胞 和上皮。
近来，有报道说从哺乳动物皮肤真皮中分离到的多功能成熟干细胞， 其称作皮肤衍生前体，能够在培养物中增殖并且分化以产生神经元、神经 胶质、平滑肌细胞和脂肪细胞。然而，这些干细胞在皮肤中确切定位还是 未知的，它们的功能仍然是不清楚的。
本文公开了在毛嚢细胞中作为神经祖细胞标记物的巢蛋白的表达。巢 蛋白连接在荧光蛋白上(GFP)，这样可以观察到每个周期中表达巢蛋白的细 胞形成了毛嚢的主要部分。神经干细胞蛋白质一巢蛋白一在毛嚢干细胞中 的表达提示了 一种可能的联系。
多潜能、巢蛋白阳性、纤维结合素阳性的干细胞(SKPs)能够从新生的和 成熟的皮肤中生成，这些前体源于真皮，它们与间叶干细胞有所不同。单 个的SKPs克隆能够分化成为神经外胚层和中胚层语系，包括(但可能不限 于)神经、神经胶质、平滑肌细胞和脂肪细胞。研究表明SKPs能够经过至 少一年的时间而不会丧失产生这些分化细胞类型的能力。最后，人类研究 显示相似的前体可能出现在成人皮肤中。因此，SKPs显然代表了一种新的 多潜能成熟干细胞，它可能比其它成熟干细胞有更少的"偏向"。从可得到 的、潜在自体组织来源如哺乳动物皮肤中分离并且扩展得到这种干细胞的 能力具有重要的治疗用途。
这些发现显示GATA-3为特异反应性皮炎(AD)的关键决定因素。因此， 巢蛋白调控的FP转基因鼠科动物模型与理解在过敏性皮肤疾病如AD中 Th2细胞和Th2细胞因子的作用的生理意义相关。
实施例5
巢蛋白-FP转基因小鼠巢蛋白是一种中间连丝(IF)基因，它是中枢神经系统祖细胞和神经上皮
干细胞的标记物。将携带有在巢蛋白第二内含子增强子控制下的EGFP的增 强GFP(EGFP)的转基因小鼠用来研究和目测检验CNS干细胞的自更新和多 能性。如由巢蛋白调控的EGFP表达所证明的，下面讨论的工作显示毛嚢干 细胞强烈地表达巢蛋白。
毛发初始生长期的诱导
用热的松香和蜂蜡混合物对的6-8个星期大、处于毛发生长终期的巢蛋 白调控的GFP转基因小鼠进行脱毛。在脱毛(毛发生长终期)前和脱毛后 第1-5天(毛发初始生长早期)、第8和10天(毛发初始生长中期(catagen) )、第14和15天(毛发初始生长晚期)以及第19和20天(毛发生长中期 )从背部皮肤切下样本(5x5mm2)。将皮肤样本分成两部分， 一部分用于焚 光显微检查而另一部分用于冷冻切片。简单的说，将皮肤样本包埋入组织 冷冻包埋培养基中并在-8(TC冷冻过夜。使用LeicaCM1850恒冷切片机切出 8pm厚的切片。冷冻切片进行空气干燥和二碘化丙锭复染用于荧光显微检 查。
荧光和共聚焦显微检查
切去s. c.组织后，在配备了 GFP光学配件的Nikon焚光显微镜下直接 观察巢蛋白-GFP皮肤样本的真皮上部分和表皮下部分。同时也使用了安装 在具有10倍PlanApo物镜的Nikon Optiphot上的MRC-600共聚焦成像系 统(Bio-Rad)。
免疫组织化学染色
通过使用DAKO ARK动物研究试剂盒(巢蛋白和角蛋白)并按照制造商 说明书的DAKO EnVision双染色系统来检测石蜡包埋的C57B16小鼠和巢 蛋白-GFP转基因小鼠皮肤切片中巢蛋白、角蛋白5、 8和15、和GFP的共 定位。简单地说，通过在过氧化物酶封闭溶液中温育5分钟来淬灭皮肤样 本中内源过氧化物酶的活性。载玻片随后和预备好的生物素标记的第一抗 体(GFPmAb, 1: 100;巢蛋白mAb， 1: 80;角蛋白5/8 mAb, 1: 250;和角蛋白 15 mAb, 1: 100)—起温育15分钟，然后和链霉亲合素过氧化物酶一起温育15分钟。通过和底物发色团3, 3'-二氨基联苯胺(diaminobenzidine)(DAB)或 者快速核酸红一起温育5分钟以完成染色。棕色(DAB)或樱桃红(快速 核酸红)染色用于抗原染色。巢蛋白mAb(大鼠401)由Iowa大学购得(Iowa City )。角蛋白5 / 8 mAb (MAB3228)和角蛋白15 mAb (CBL 272)由Chemicon购得。
具有巢蛋白控制的GFP表达的细胞位于处于毛嚢干细胞所在的毛嚢突 起中皮脂腺的正下方的毛发生长终期毛嚢的永久上部区域中。这些细胞相 对较小，呈卵形或圓形并通过小的树突相互连接。
表达巢蛋白的细胞的定位和数量是依赖于毛发周期的。通过脱毛诱导 小鼠(6-8周大)毛发生长终期毛嚢的毛发生长初期后，接下来在发育的毛 嚢里进行GFP标记的巢蛋白生产细胞的发育和增殖。正如先前对毛嚢干细 胞的描述，在毛发生长终期毛嚢中的绿色荧光、巢蛋白表达细胞只位于上 端永久突起区域。脱毛后2到3天，表达巢蛋白的毛嚢细胞已经增殖并从 突起向下迁移。在毛发初始生长的中期和晚期阶段，表达巢蛋白的毛嚢细 胞占据了外根鞘的上2/3，而从毛嚢下1/3以及毛发基质球中消失。在毛 发生长中期，当毛发球基质细胞经历退化和变性时，外根鞘中表达巢蛋白 -GFP的细胞的数量随着毛嚢皱缩一起减少。最终，到下一个毛发生长终期 这些细胞只位于突起处。
所述数据显示表达巢蛋白的细胞包括毛嚢外根鞘的真性祖细胞或干细 胞。在毛发初始生长的高峰，整个毛嚢外根鞘2/3长度由表达巢蛋白的细 胞组成。这显然是发源于处于毛发生长终期表达巢蛋白的细胞簇中并且随 毛发周期同步增殖。大多数毛发初始生长期的毛嚢外根鞘一定是由这些推 定的干细胞衍生而来，因为考虑到物理、生理和时间障碍从周围组织中大 量募集细胞是不太可能的。这些结果提供了关于活干细胞形成新毛嚢结构 重要部分的描述。
这些结果得到了其它发现的有力支持。近来，Oshima， H.等人在Cell (2001) 104: 233-245中报道成体大鼠触须毛嚢外根鞘的上端区域包含有多能 干细胞，其响应形态发生信号从而生成多种毛嚢、皮脂腺和真皮。这些发 现和我们观察到的外根鞘中的巢蛋白-GFP表达相一致。
这些巢蛋白-GFP表达的毛嚢祖细胞或干细胞也表达角蛋白5/8和角 蛋白15,其是毛嚢干细胞的潜在标记物。免疫组织化学染色的结果显示巢蛋白、GFP、角蛋白5/8和角蛋白15共定位于毛嚢突起细胞、外根鞘细胞 和皮脂腺基底细胞中。这些数据进一步支持了在毛嚢突起中的表达巢蛋白 -GFP的细胞是外根鞘的祖代细胞。
最近的对于毛嚢生物学的关注潮已经揭示了除了在形成发干中明显的 作用之外，功能和细胞类型的令人惊讶的复杂性。这里报道的观察结果显 示在毛嚢里的外根鞘祖细胞分享了先前在神经干细胞中发现的巢蛋白标 记。这一发现暗示了毛嚢细胞和神经干细胞之间可能的联系。这些数据也 证实了先前所怀疑的情形，即，已经显示出在毛发初始生长阶段能够表达 巢蛋白-GFP的突起细胞可增殖以形成大量的外根鞘。当然，表达巢蛋白的 细胞可能发挥了更广泛的作用并且可作为整个毛嚢的干细胞而起作用。在 本案中，毛嚢的保留部分，例如，内层根鞘和基质，能够从表达巢蛋白的 细胞中发源但随着分化进程可能会丢失巢蛋白的表达。
实施例6 分离毛嚢干细胞
分离表达巢蛋白-GFP的毛嚢突起干细胞并在体外培养。切除毛发生长 终期的巢蛋白-GFP转基因小鼠皮肤样本并切碎。随后将切碎的组织在胰蛋 白酶(0.25 %)，胶原酶(0.4 %)和分散酶(l.O %)的混合物中、37。C消化两小 时。在装配了荧光光学配件的解剖显微镜下分离突起区域中有表达巢蛋白 -GFP细胞的单个毛嚢。接着在焚光解剖显微镜下使用精细注射器进一步分 离在毛嚢突起区域表达巢蛋白-GFP的细胞。
实施例6 生长的干细胞
把来自于毛嚢突起区域的表达巢蛋白-GFP的细胞转移到不含生长因子 添加物的M21培养基中，这是一种用于神经球生长的典型神经维持培养基 (Uchida， N.,等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 14720-14725)。 12天 后，神经球状集落出现。在另一个实验中，从毛嚢突起区域分离的表达巢 蛋白-GFP的细胞以10细胞/證2的密度生长在包含曱基纤维素(1.2 %)的神 经干细胞培养基中，每两天向该培养基中添加生长因子(EGF) (20 ng/ml)、 成纤维细胞生长因子(FGF) (20 ng/ml)和白血病抑制因子(Lif) (10 ng/ml)。当球体在培养基中出现时，将它们转移到不含曱基纤维素的新平板上。次级 球体也是从一级球体产生的。接着分析这些球体的分化潜能。
实施例7
B16F10鼠科动物黑色素瘤细胞和巢蛋白表达
下面显示用B16F10鼠科动物黑色素瘤细胞在体内和体外模拟内皮细 胞的行为和血管发生过程。在体外肿瘤细胞的索形成(cord formation)是由缺
体(VEGF受体2)的抗体所抑制。
B16F10鼠科动物黑色素瘤细胞系(B16F10)生长在DMEM培养基、10% FCS、 37 °C、 5。/。C02的条件下。将DsRed-2基因(CLONTECH)插入到基于 逆转录病毒的哺乳动物表达载体pLNCX (CLONTECH)中以形成pLNCX DsRed-2载体。逆转录病毒的生产是通过将pLNCX DsRed-2转染进入PT67 包装细胞进行的，这种包装细胞产生包含DsRed-2基因的逆转录病毒上清 液。
B16F10在包含15%FCS的RPMI 1640培养基(GIBCO)中培养。感染前 24小时，将70%的融合PT67/RFP细胞转移到含7% FBS培养基的新鲜 DMEM中。耙标细胞在感染前以1-2 x105每60 mm平4反的纟田月包密l,甫才反 生长18小时。
把感染的B16F10细胞移植到宿主nu/nu小鼠中并且允许肿瘤细胞生 长。定位肿瘤样本并将其与正常组织一起切除以进行荧光显微观察。通过 包含荧光蛋白的血管的出现，显微图像表明出血管发生活性的存在。
实施例8
皮肤中来自表达巢蛋白的毛囊细胞的新生血管
携带处于巢蛋白第二内含子增强子控制下的GFP的转基因小鼠 (ND-GFP)被用于对自更新和多能CNS干细胞的研究和显影。如由巢蛋白调 控的GFP表达所证明的，毛嚢干细胞强烈表达巢蛋白。
对于下面讨论的结果，使用装配了汞灯动力电源的Olympus IMT-2反转 显微镜(Melville, NY)进行焚光显微观察。荧光显微镜有一套GFP滤光镜 (Chroma Technology, Rockingham, VT)。同时也使用了安装在具有Plan ApoIO倍物镜的Nikon Optiphot上的MRC-600共聚焦成像系统(Bio-Rad)直接观 察具有GFP表达的皮肤组织。
依照制造商的说明书，在空气干燥的皮肤和冷冻切片中进行了针对 CD31和von Willebrand因子(VWF)的免疫组织化学染色，其中对于CD31 使用抗大鼠Ig辣根过氧化物酶(HRP)检测试剂盒(BD Biosciences)或对于 VWF使用抗兔Ig (HRP)检测试剂盒(BD Biosciences)。 CD31 mAb (CBL1337) 从Chemicon购得。VWF多克隆抗体(A0082)从DAKO购得。底物发色团 3， 3'-二氨基联苯胺染色被用于进行检测。
毛发初始生长期小鼠皮肤巢蛋白表达的显影
使用转基因ND-GFP小鼠(6-8周大具有几乎专一的毛发生长终期(静止 期)毛嚢)进行毛发初始生长期小鼠皮肤中巢蛋白表达的显示。使用三溴乙醇 (tribromoethanol)(i. p.注射量，0.2mll.2%溶液/10g体重)麻醉小鼠。使用 用热的松香和蜂蜡混合物对小鼠进行脱毛以诱导毛发初始生长。
当毛嚢处于毛发初始生长早期时，脱毛前和脱毛后第48和72小时在 麻醉状态下切除背部皮肤样本。皮肤样本分成3部分， 一部分用于荧光显 微检测而其它的用于冷冻切片或者空气干燥片段。用于冷冻切片的样本包 埋入组织冷冻包埋培养基(DAKO)中并冷冻在-80。C过夜。用Leica CM1850 (Leica, Deerfield， IL)低温切片机切出5pm厚的切片并进行空气干燥。


图1显示了从ND-GFP转基因小鼠的背侧皮肤真皮侧的视图。图IA显 示了来自转基因小鼠背部皮肤的相差显微图像。皮脂腺体(向下的箭头)位于 发干(向上的箭头)周围。图IB显示了相差显微图像加上GFP的荧光。 ND-GFP细胞在毛嚢突起区域中是可见的并且也可以看见血管。毛嚢突起区 域位于皮脂腺下方。
图1C显示了 GFP的荧光。可以看见ND-GFP血管连 接于ND-GFP毛嚢。图ID表示毛发生长终期毛嚢的示意图，其中显示了 ND-GFP毛嚢突起区域和血管网络的位置。
图1E也显示了 GFP的焚光。可 见ND-GFP血管与ND-GFP毛嚢突起区相联系。本图中标尺代表100pm的 距离。
如
图1A-D中所见，表达巢蛋白的毛嚢和ND-GFP-标记的皮肤脉管网络 相互连接。免疫组织化学染色显示脉管展示(display)CD31抗原和VWF，表
明它们是血管。ND-GFP触须毛嚢到棵鼠创伤皮肤的移植
为了移植目的，通过手术获得ND-GFP转基因小鼠的触须毛嚢。麻醉 转基因小鼠并在无菌环境下进行所有的手术过程。切下包含触须垫的上唇， 暴露其内表面。在双目显微镜下切分毛嚢并使用精细镊轻轻的沿着颈口从 垫上拔起以摘下毛嚢。随后将所有的毛嚢保存在包含B-27添加物 (GIBCO/BRL)的DMEM/F-12培养基中。
如上所述，用三溴乙醇麻醉受体棵鼠。将完整厚度的皮肤样本进行折 叠并且使用2-mm活检穿孔器产生两个分开约15mm的相邻完整厚度伤口。 随后移植ND-GFP触须毛嚢。使用尼龙线(6-0)缝合切口。进一步切割移植 后小鼠的皮下组织样本并通过荧光显微镜直接观察，并且进行空气干燥或 者准备冷冻切片以用于免疫组织化学染色。创伤后IO天麻醉小鼠并切下创 伤皮肤样本进行分析。
图2A-G显示了移植到棵鼠的皮下组织的ND-GFP触须毛嚢图像。图 2A显示了移植28天后毛嚢的相差显微图像。预先存在的血管显示在图像 的底部。图2B显示了相同毛嚢的相差显微图像加上GFP的焚光。在这张 图像中显示出巢蛋白阳性血管和预先存在的血管相互连接。图2C显示了移 植后毛嚢的GFP荧光的图像。在图2B和2C中，可以看见ND-GFP血管从 移植后的ND-GFP毛嚢中生长出来并且和棵鼠皮肤中预先存在的血管联系 在一起。图2D和2E显示了图分别来自2B和2C的高放大倍数图像。(f和 g)图2F和2G显示共定位的GFP信号和内皮细胞标记物CD31的图像。图 2F是荧光图像，图2G显示空气干燥并用CD31进行免疫组织化学染色的相 同视野的图像。(标尺，100pm)
到第3天从移植后4果鼠皮肤的ND-GFP毛嚢中探测到了 ND-GFP脉管 的生长。正如在上面关于图2所讨论的，到28天，表达巢蛋白-GFP的脉管 已经发育成广泛的分支网络并且与受试棵鼠中存在的脉管交叉合流。免疫 组织化学染色显示CD31抗原和GFP荧光共定位在新生血管中。
在棵鼠肾嚢下方移植ND-GFP触须毛嚢细胞
按上述方式收获触须毛嚢。接着将所有的毛嚢保存在包含B-27添加物 的DMEM/F-12培养基中并置于冰上，直至将它们移植到6-8周大的"w/做 小鼠的肾嚢下方，这些小鼠按照上述方法麻醉。在受试小鼠的左侧腹肋切 开，暴露出肾脏。将两个毛嚢插入到肾嚢下方。再将肾脏放回原位，并且使用尼龙线(6-0)缝合切口 。在14天将每个移植鼠的肾脏切下并使用荧光显
微镜直接观察。
图3A-C显示了移植的ND-GFP触须毛嚢在棵鼠肾嚢下的图像。可以看 到移植后14天ND-GFP脉管形成了网络，这可通过相差显微图像(图3A)、 相差显微图像加上GFP荧光(图3B)和GFP荧光图像(图3D)看到。(标 尺，100pm)。 ND-GFP脉管显示出与预先存在的血管发生交叉合流。
将ND-GFP触须毛嚢移植到棵鼠肾嚢下方之后，第14天被观察到围绕 着移植的毛囊的ND-GFP血管网络。ND-GFP脉管显示出与预先存在的血管 发生交叉合流。
创伤皮肤中来自移植毛囊的ND-GFP脉管的增强生长
收获包含移植的ND-GFP触须毛发嚢的受创伤皮肤样本用于荧光显微 观察。图4A显示了移植前分离的ND-GFP触须毛嚢。图4B显示了移植后 10天棵鼠受创伤皮肤中的ND-GFP触须毛嚢图像。可以看见ND-GFP脉管 从ND-GFP触须毛嚢向正在愈合的伤口的生长。图4C和4D显示了来自图 4B区域的高放大倍数图像，显示为白色阴影框。图4E是ND-GFP触须毛 嚢移植进入创伤棵鼠皮肤的示意图。(标尺，lOOpm)
图4的影像显示出ND-GFP脉管从毛嚢向伤口生长。在移植的毛嚢附 近出现的伤口显著地增强了脉管的生长。显然，起源于毛嚢的脉管能够响 应于伤口附近产生的血管发生信号。免疫组织化学染色显示出CD31在生长 到伤口里的表达ND-GFP的脉管中表达。
讨论
血管发生，毛细血管高度活跃的生长与破坏，已经在理解组织维持、 创伤修复和恶性肿瘤生长中占据了日益重要的角色。识别新血管的细胞来 源已经在学术上和治疗方案中越来越重要。已经有大量的关于内皮细胞由 骨髓来源的干细胞生成的最近报道。这也是内皮干细胞可以从脂肪组织中 衍生的证据。然而，由于皮肤独特的结构，这些先前确认的内皮干细胞的 来源可能不能用于提供皮肤血管。上面提供的结果显示出先前未认识到的 毛嚢干细胞的重要功能是提供能在皮肤中形成血管的内皮细胞。
毛嚢干细胞的全部潜能可能比这里报道的更加广泛。 一些调查发现从 哺乳动物真皮层分离出的成熟多潜能干细胞一称作由皮肤衍生的前体一可 以在培养中增殖并分化成神经元、神经胶质、平滑肌细胞和脂肪细胞。然而，这些干细胞在皮肤中的确切定位还是未知的，它们的功能也是不清楚 的。本篇报道指出毛嚢是用于皮肤血管的干细胞的重要来源并且很可能也 可以用于其它组织。这些结果支持了毛嚢细胞对创伤修复和皮肤移植物的 存活有重要意义的报道。
实施例9
用于筛选血管发生促进复合物的血管发生模型
为了实现移植目的，如实施例8所述，手术收获来自ND-GFP转基因 小鼠的触须毛嚢。随后将所有毛嚢保存在含有B-27添加物(GIBCO/BRL)的 DMEM/F-12培养基中。
麻醉受试棵小鼠，将一个完整厚度的皮肤样本进行折叠并且使用2-mm 活检穿孔器产生两个分开约15 mm的相邻完整厚度伤口 。随后移植ND-GFP 触须毛嚢。使用尼龙线(6-0)缝合切口。
小鼠分为实验组和对照组。实验组接受了一系列的处理，包括血管内 皮生长因子、包含在可药用载体中的已知的血管发生促进复合物。对照组 小鼠只接受载体。
处理后，继而切下移植小鼠的皮下组织样本并直接在荧光显微镜下观 察，并且进行空气干燥或准备进行用于免疫组织化学染色的冷冻切片。从 实验组和对照组中获得样本中血管发生活性的程度。同对照组样本相比实 验组样本显示了基于GFP活性总量的高度的血管发生活性。
本实施例显示出披露的模型系统具有筛选血管发生试剂的用途。
实施例10
用于筛选血管发生移植复合物的血管发生模型
为了移植目的，如实施例8所述，通过手术获得来自ND-GFP转基因 小鼠的触须毛嚢。随后将所有毛嚢保存在含有B-27添加物(GIBCO/BRL)的 DMEM/F-12培养基中。
麻醉受试棵鼠，将完整厚度的皮肤样本进行折叠并且使用2-mm活检穿 孔器产生两个分开约15 mm的相邻完整厚度伤口。随后移植ND-GFP触须 毛嚢。使用尼龙线(6-0)缝合切口。小鼠分为实验组和对照组。实验组接受了 一系列的处理包括血管抑制 素、包含在可药用载体中的已知的血管发生抑制复合物。对照组小鼠只接
受载体。
处理后，继而切下移植小鼠的皮下组织样本并直接在荧光显微镜下观 察，并且进行空气干燥或准备进行用于免疫组织化学染色的冷冻切片。从 实验组和对照组中获得样本中血管发生活性的程度。同对照组样本相比实
验组样本显示了基于GFP活性总量的降低程度的血管发生活性。
本实施例显示出披露的模型系统具有筛选抗血管发生试剂的用途。
实施例11
将表达FP的毛嚢细胞移植入FP转基因宿主
在转基因小鼠中制备表达ND-GFP的触须毛嚢细胞。将转基因宿主生 物，履/歷小鼠进行改造以便表达巢蛋白调控下的RFP。如实施例8所讨论 的，将表达ND-GFP的触须毛嚢细胞移植到在ND-RFP转基因宿主生物体 中制造的皮肤伤口中。
收获包含移植的ND-GFP触须毛嚢细胞的创伤皮肤样本用于荧光显微 观察。移植前对分离的ND-GFP触须毛嚢进行显微观察。移植10天后显示 受创伤的nu/nu ND-RFP小鼠皮肤中的ND-GFP毛嚢的图像。可以看见 ND-GFP脉管从ND- GFP触须毛嚢向正在愈合的伤口生长。还能看见从伤 口中伸出的ND-RFP脉管。
权利要求
1.一种监测血管发育的方法，包括提供血管发生干细胞，其中所述干细胞包含表达盒，该表达盒编码在巢蛋白调控元件遗传控制下的荧光蛋白；在宿主中培养所述干细胞；和监测导致血管发育的干细胞血管发生活性。
2. 权利要求1的方法，其中所述血管发生干细胞是表达巢蛋白的细胞。
3. 权利要求2的方法，其中所述表达巢蛋白的细胞是毛嚢细胞。
4. 权利要求3的方法，其中所述毛嚢细胞生长在体外培养物中。
5. 权利要求2的方法，其中所述表达巢蛋白的细胞是肿瘤细胞。
6. 权利要求5的方法，其中所述肿瘤细胞来自选自黑色素瘤、神经胶 质瘤、血管母细胞瘤、神经鞘瘤、髓母细胞瘤和脑膜瘤组成的组的肿瘤类 型。
7. 权利要求l的方法，其中所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、 红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)和黄色荧光蛋白(YFP)组成的组。
8. 权利要求l的方法，其中所述巢蛋白调控元件是由人巢蛋白基因第 二内含子编码的。
9. 权利要求l的方法，其中所述宿主生物是脊推动物生物体。
10. 权利要求9的方法，其中所述宿主生物体是哺乳动物或鸟类。
11. 权利要求10的方法，其中所述哺乳动物宿主选自小鼠、大鼠、兔、 犬和猫组成的组。
12. 权利要求9的方法，其中所述宿主生物体是鸡或者鸡卵。
13. 权利要求l的方法，其中所述血管发生千细胞包含处于巢蛋白调 节控制下的第一荧光蛋白，并且宿主生物包含处于巢蛋白调节控制下的第 二荧光蛋白，其中的第一荧光蛋白不同于第二荧光蛋白。
全文摘要
本发明涉及使用表达巢蛋白的干细胞显像新生血管的血管发生模型。公开的发明涉及这样的观察结果，即巢蛋白表达是内皮细胞增殖的标记。巢蛋白表达作为标记对于血管发生，特别是对于与肿瘤相关的血管发生特别有用。具体地，巢蛋白可以作为针对诸如神经胶质瘤、血管母细胞瘤、神经鞘瘤、髓母细胞瘤、和脑膜瘤的脑部肿瘤的极好的内皮标记物而起作用。因此，公开的发明涉及这种标记作为模型化血管发生活性的基础的用途。
文档编号A01K67/027GK101514356SQ200910133849
公开日2009年8月26日 申请日期2004年10月28日 优先权日2003年10月28日
发明者天羽康之, 平 姜, 李玲娜, 萌 杨 申请人:抗癌公司