专利名称：巢式一步法rt-pcr从单个b细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种巢式一步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列的方法。
背景技术：
单克隆抗体药物具有特异性强、副作用小等临床优势，抗体药物直接与靶标结合，靶向特异性强，同时，抗体识别目标的灵敏度很高，用药量少；再加上抗体药物本身属于蛋白质，其在体内代谢与其他内在抗体和蛋白质过程相同，不会额外对肝肾造成负担，因而一般副作用很小，具有广阔的应用前景，目前主要用于肿瘤、自身免疫等疾病的治疗。抗体分子的基因结构较复杂，抗体的轻链L由C、V和J 3个基因簇编码，抗体的重链H由C、V、D和J 4个基因簇编码。V是抗体基因编码可变区，人的Svh基因数量约为100个，D基因片段为10-20个，Jh基因片段有9个；小鼠Vh的基因片段的数目约为250-1000种，D基因片段有12个，Jh基因片段有4个；抗体轻链分为K和λ 2个亚型，正常人血清免疫球蛋白K链:λ链约为2:1，Vk基因的数量约为100个；而小鼠95%的抗体轻链是K型，小鼠Vk基因片段约有250个，这些基因片段通过多种多样的重排，合成出的肽段再进一步进行L和H链组合，从而生成众多的抗体种类。目前，人们已经开发出多种抗体药物筛选的方法，如杂交瘤融合技术，噬菌体展示技术和酵母展示技术等。与传统的杂交瘤融合技术相比，抗体的体外表达技术具有效率高，操作简单，实 验周期短等优点(Clackson T, Nature, (1991) 352:624-628; Boder E,Nature Biotechnol, (1997) 15:553-557)，其逐渐成为功能强大的抗体药物开发工具。从单个B细胞中扩增得到抗体基因的Vh和\的全序列是其中的关键步骤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种巢式一步RT-PCR从单个B细胞中扩增抗体基因重链可变区Vh和轻链可变区\的方法。本发明根据NCBI和VBASE的小鼠免疫球蛋白重链和轻链的V基因序列设计兼并引物，可以特异性地扩增得到囊括所有V基因种类的DNA序列。然后通过特定的接头DNA片段(Linker接头)将重链和轻链的可变区基因序列连接在一起，再通过巢式PCR进行扩增，并带入酶切位点，可以克隆到特定的双向表达载体，进行真核表达。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种巢式一步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列的方法，所述的方法步骤如下:
(I)寡聚脱氧核糖核酸引物和接头设计
根据NCBI和VBASE上已报道的小鼠免疫球蛋白重链和轻链的V基因序列设计兼并引物，根据小鼠抗体重链和轻链的家族分类，重链可变区上游引物命名为VH1-VH13 (长度为41-46bp)，下游引物命名为CHl ;轻链可变区上游引物命名为VK1-VK19 (长度为41_46bp)，下游引物命名为CKl ;上述上游引物起始于小鼠重链和轻链可变区5’末端，下游引物终止于小鼠重链和轻链的恒定区；重链可变区上游引物和轻链可变区上游引物的5’端分别带入linker接头，重链可变区上游引物带入的linker接头和轻链可变区上游引物带入的linker接头互补；
重链可变区上游引物和轻链可变区上游引物的5’端分别带入的linker接头序列如
下:
重链 linker:5，-TCGGCCGTAGCTTGCGCGCCTCCA~3，
轻链 linker:5，-QGCGCGCkkQCTKCGGCCGkTQT- ,，；
加粗斜体标注部分为加入的Eag I和BssH II的酶切位点，下划线所示为重链linker与轻链linker的互补区。(2)—步法 RT-PCR
以单个B cell为模板通过逆转录酶将重链、轻链可变区基因的mRNA逆转录为cDNA，然后以cDNA为模板，重链可变区上游引物VH1-VH13，下游引物CHl和轻链可变区上游引物VK1-VK19，下游引物CKl为引物，扩增出重链、轻链可变区基因；扩增出重链和轻链可变区基因的上游引物带入互补的Linker接头，通过PCR产物的退火互搭，重链和轻链的可变区基因连接在一起，形成V11-1inker-VL的DNA片段。(3)巢式 PCR
以VirIinker-'的DNA片段为模板，采用巢式PCR进行扩增，扩增得到可以连接到双向表达载体中的V11-1inker-'的PCR产物。
重链可变区上游引物及下游引物的序列如下:
权利要求
1.一种巢式一步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列的方法，其特征在于:所述的方法步骤如下: (O寡聚脱氧核糖核酸引物和接头设计 根据NCBI和VBASE上已报道的小鼠免疫球蛋白重链和轻链的V基因序列设计兼并引物，根据小鼠抗体重链和轻链的家族分类，重链可变区上游引物命名为VH1-VH13，下游引物命名为CHl ;轻链可变区上游引物命名为VK1-VK19，下游引物命名为CKl ;上述上游引物起始于小鼠重链和轻链可变区5’末端，下游引物终止于小鼠重链和轻链的恒定区；重链可变区上游引物和轻链可变区上游引物的5’端分别带入linker接头，重链可变区上游引物带入的linker接头和轻链可变区上游引物带入的linker接头互补； 重链可变区上游引物和轻链可变区上游引物的5’端分别带入的linker接头序列如下:重链 linker:5，-TCGGCCGTAGCTTGCGCGCCTCCA-3’轻链 linker:5，-GGCGCGCAAGCTACGGCCGATGT-3，； (2)一步法 RT-PCR 以单个B cell为模板通过逆转录酶将重链、轻链可变区基因的mRNA逆转录为cDNA，然后以cDNA为模板，重链可变区上游引物VH1-VH13，下游引物CHl和轻链可变区上游引物VK1-VK19，下游引物CKl为引物，扩增出重链、轻链可变区基因；扩增出重链和轻链可变区基因的上游引物带入互补的Linker接头，通过PCR产物的退火互搭，重链和轻链的可变区基因连接在一起，形成V11-1inker-VL的DNA片段； (3)巢式PCR 以VirIinker-'的DNA片段为模板，采用巢式PCR进行扩增，扩增得到可以连接到双向表达载体中的V11-1inker-'的PCR产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述linker接头内包含EagI和BssH II的酶切位点。
3.根据权利要求1或2所述 的方法，其特征在于:步骤(3)中巢式PCR使用的引物两端带入了 Sfil的酶切位点。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，目的在于提供一种巢式一步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列的方法。本发明根据NCBI和VBASE的小鼠免疫球蛋白重链和轻链的V基因序列设计兼并引物，可以特异性地扩增得到囊括所有V基因种类的DNA序列。然后通过特定的接头DNA片段(Linker接头)将重链和轻链的可变区基因序列连接在一起，再通过巢式PCR进行扩增，并带入酶切位点，可以克隆到特定的双向表达载体，进行真核表达。本发明优点为覆盖面广，灵敏度高，效率高，通量大，步骤简单，简化劳动，降低成本，应用范围广，结果可靠。
文档编号C12N15/10GK103074349SQ20121043881
公开日2013年5月1日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者张 成, 药晨江, 景书谦 申请人:杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司