受体选择性淋巴毒素衍生物的制作方法

专利名称：受体选择性淋巴毒素衍生物的制作方法
技术领域：
本发明属蛋白质工程和制药领域，具体涉及一种受体选择性淋巴毒素衍生物及其 制法和用途。
背景技术：
淋巴毒素a (LTa)，也被称为TNFii，是TNF超家族成员之一，是一类重要的细胞因 子。与TNF相比，LT α的结构和功能与TNF相似，具有相同的受体TNFRI、TNFRII, LTa的 抑制的肿瘤细胞类型略少于TNF，对某些肿瘤细胞的杀伤作用也不尽相同。LT α由有活性的淋巴细胞产生，是25KD的分泌型糖蛋白，LT前体含有205个氨基 酸残基，其中34个氨基酸残基编码信号肽，成熟的LT有171个氨基酸残基(18kD) (SEQID NO 3)，没有二硫键，第62位为N-连接的糖基化位点(糖基化对其细胞毒活性是非必要 的)，LTa与TNFRI、TNFRII的作用位点集中在三聚体底端的两个套索区。LTa同三聚体 与TNFRI和TNFRII作用，从而引发信号传导。TNFRI和TNFRII在细胞分布、分子量、结合配基的亲和力和介导的生物学活性等 方面都不相同。TNFRI和TNFRII存在于除红细胞外的所有类型的细胞中，TNFRI的存在更 普遍。TNFRI受体主要表达于上皮细胞，TNFRII受体主要表达于骨髓细胞，大多数的细胞都 表达这两种受体，但比例有所不同。TNFRI由455个氨基酸组成，TNFRII由461个氨基酸组 成，都是I型跨膜糖蛋白，均由信号肽、胞外结构区、跨膜结构区和胞浆结构区组成。TNFRI 胞浆区326-413位为死亡区域(death domain，DD)。TNFRI可通过DD结合TNFR相关蛋白， 传导细胞毒信号，引发细胞调亡。TNFRII的胞浆结构区没有DD，TNFRII所传递的信号主要 局限于免疫系统细胞中，与病毒感染的免疫反应高度相关。TNFRI和TNFRII的胞内部分的 同源性极低，也说明它们有着不同的信号转导路径，有着不同的生物功能。两种受体介导的TNF的生物活性有很大的差异。鼠的TNFa与鼠的TNFRI和TNFRII 的结合力相似，然而人的TNFa只结合鼠的TNFRI，不结合鼠的TNFRII。在致死实验中，人的 TNFa比鼠的TNFa显示了较低的致死率，这提示TNFRII对全身毒性有很大的影响。研究证明TNFRII信号对胰岛素信号传导有抑制作用，用抗TNFRII抗体阻断 TNFRII信号会缓解该信号对胰岛素信号传导的抑制作用。TNFRII信号还在调节血管通透性方面有重要作用。抗TNFRII抗体可以抑制成神 经细胞瘤细胞的增殖，同时对TNF的细胞杀伤活力无影响。在鼠实验中发现，TNFRII参予 顺钼介导的肾损伤。通过改造TNF与受体的结合区域，获得对TNFRI具有选择性的TNF突变体，从而即 保持其对肿瘤细胞的细胞杀伤活性，同时减轻了 TNFRII引起的毒副作用，得到了很好的效 果。LT与TNF体内、体外的抗肿瘤活性不相上下，且毒性更小，半衰期更长，此外LT还有明 显的化疗增敏和放疗增敏作用。因此，LT治疗肿瘤的临床应用前景可能会比TNF更好。缺失LT α的N端序列1-27的淋巴毒素衍生物LT α 28_171，目前处于II期临床阶段，显示出明 确的抗肿瘤作用。然而LT仍然具有一定的毒副作用，治疗指数不高，而且对某些肿瘤细胞 的杀伤活力不高，这些都限制了淋巴毒素在医药领域的应用。研究证明LT的毒副作用与TNFRII信号相关，TNFRII信号可以激活NFk B，而 NF κ B是重要的炎症因子，直接引起炎症反应，同时还能够激活多重耐药基因，影响药物对 肿瘤细胞的疗效。TNFRII也能够与TNFRI竞争配体，导致LT对TNFRII高表达的肿瘤细胞 不敏感，抑制了 LTa的细胞毒活性。目前，临床上迫切需要具有TNFRI选择性的淋巴毒素，即保持了淋巴毒素的肿瘤 细胞杀伤活性，同时降低了 LT的毒副作用；使得LT对TNFRII高表达的肿瘤细胞敏感度提 高，能够应用于更多种类的肿瘤治疗；在LT与化疗药物联合治疗中，会有更好的治疗效果， 更低的毒副作用。然而，目前尚无令人满意的对TNFRI具有高选择性的淋巴毒素。因此，本领域迫切 需要开发新的对TNFRI具有高选择性且对TNFRII的选择性极低的淋巴毒素突变体。

发明内容
本发明的目的就是提供一种TNFRI具有高选择性且对TNFRII的选择性极低的淋 巴毒素突变体。在本发明的第一方面，提供了一种受体选择性淋巴毒素突变体，所述突变体在对 应于淋巴毒素天然序列中106-113位的106-113套索结构中，第106、107、109、110、111、 112、或113位氨基酸残基至少一个氨基酸被替换，和/或在106-113套索结构中插入至少
一个氨基酸，附加条件是108位Y残基不变；并且所述淋巴毒素突变体与人TNFRI的结合能力与所述淋巴毒素突变体与人 TNFRII的结合能力之比大于10。在另一优选例中，该淋巴毒素突变体与TNFRI的结合能力与野生型LT与人TNFRI 的结合能力之比大于0.1。在另一优选例中，该淋巴毒素突变体与人TNFRII的结合能力与野生型LT与人 TNFRII的结合能力之比小于0. 01。在另一优选例中，所述的氨基酸替换是106、107、109、110、111、112或113位氨基
酸被其它氨基酸所替换。在另一优选例中，在106-113位插入1-3个氨基酸(优选酸性或 碱性氨基酸)。在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的突变Q107E ；Q107D ；S106E ；S106D ；Q107R ；Q107N ；Q107E/S106E ；Q107E/S106D ；Q107D/ S106E ；或 Q107D/S106D。在另一优选例中，所述淋巴毒素突变体与人TNFRI的结合能力与所述淋巴毒素突 变体与人TNFRII的结合能力之比大于100，更佳地大于200。在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它包含安全有效量的人淋巴毒素 突变体和药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的药物组合物还含有选自下组的化疗剂⑶DP、5_FU、ADM、
4VCR或其组合。在本发明的第三方面，提供了本发明人淋巴毒素突变体的用途，用于制备治疗以 下疾病的药物(a)肿瘤；(b)体内寄生虫病。在本发明的第四方面，提供了一种制备TNFRI受体选择性人淋巴毒素突变体的 方法，在天然淋巴毒素序列108位残基不变，替换106-113位中至少一个氨基酸；或者在 106-113位插入1-3个氨基酸。在本发明的第五方面，提供了一种分离的DNA序列，它编码本发明的淋巴毒素突 变体。还提供了一种含有所述的DNA序列的表达载体。还提供了所述表达载体或所述的 DNA序列所转化的宿主细胞。在本发明第六方面，还提供了一种生产本发明的淋巴毒素突变体的方法，该方法 包括步骤(a)在适合表达的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的淋巴毒素突变 体；(b)分离纯化出所述的淋巴毒素突变体。在本发明的第七方面，提供了一种治疗肿瘤或体内寄生虫病的方法，包括步骤给 需要治疗的对象施用安全有效量的本发明的淋巴毒素突变体。


图1显示了 rhLT突变体LT008体外杀伤Jurkat (白血病)细胞。图2显示了 rhLT突变体LT008体外杀伤Lovo (结肠癌)细胞。图3显示了 rhLT突变体LT008体外杀伤MCF-7 (乳腺癌)细胞。图4显示了 rhLT突变体LT008体外杀伤A549 (肺癌)细胞。图5显示了 rhLT突变体LT008体外杀伤A375 (黑色素瘤)细胞。图6显示了 rhLT突变体LT008体外杀伤Hela(宫颈癌)细胞。图7显示了 rhLT突变体LT008体外杀伤U937 (组织细胞淋巴瘤)细胞。图8显示了 rhLT突变体LT008体外杀伤HL-60 (白血病)细胞图9显示了 rhLT突变体对化疗药物⑶DP的增敏作用。图10显示了 rhLT突变体对化疗药物5_FU的增敏作用。图11显示了 rhLT突变体对化疗药物ADM的增敏作用。图12显示了 rhLT突变体对化疗药物VCR的增敏作用。
具体实施例方式本发明人借助分子模拟技术研究LT与TNFRI、TNFRII的作用。经过广泛而深入的 研究发现，LT序列106-113位套索结构是LT与其受体TNFRI、TNFRII作用紧密但有差异的 结构区域，通过在该套索结构区引入突变，可获得具有TNFRI选择性的LT突变体，受体阻断 实验证实这些LT突变体与TNFRI的结合能力保持，而结合TNFRII的能力下降至少10倍， 通常至少20倍，较佳地至少100，更佳地至少1000倍，更佳地至少10000倍以上(如40000 倍)。细胞学试验证实，这种TNFRI选择性LT对多种肿瘤细胞杀伤活力优于野生型rhLT， 对TNFRII高表达的肿瘤细胞敏感性增强，还能够提高肿瘤细胞对化疗药物如CDDP等的敏感性。如本文所用，术语“淋巴毒素”、“LT”、“LTa ”、“TNFi3 ”可互换使用，意指淋巴毒素 LTa，包括来源于人、鼠、猪、马或牛的淋巴毒素。较佳地，是人淋巴毒素。此外，淋巴毒素可 以是具有天然野生型序列的LT，也可以是具有突变序列(相对野生型序列而言)的衍生型 或重组的LT。天然的野生型人淋巴毒素TNF α的氨基酸序列示于SEQ ID Ν0:3中。如本文所用，淋巴毒素的氨基酸编号基于野生型的人淋巴毒素(SEQ ID NO 3)。例如，106-113位的套索结构就是淋巴毒素天然序列即SEQ ID NO 3中106-113位的 SQYPFHVP，或相当于天然序列106-113的氨基酸的区域。如本文所用，术语“TNFRI选择性LT”或“本发明的LT突变体”指这样的LT突变 体，它与TNFRI的结合能力保持，而结合TNFRII的能力下降至少10倍，通常至少20倍，较 佳地至少100倍，更佳地至少1000倍，更佳地至少10000倍以上(如40000倍)。本发明的 LT突变体可含有或不含有起始的甲硫氨酸。如本文所用，Q107E表示107位Gln — Glu突变；Q107D表示107位Gln — Asp ； S106E 表示 106 位 Ser — Glu ；S106D 表示 106 位 Ser — Asp,依此类推。Q107E/S106E 表示 107位Gln — Glu突变且106位Ser — Glu,依此类推。本发明的所述人淋巴毒素突变体包括编码人淋巴毒素突变体的DNA、RNA或人淋 巴毒素突变体蛋白。在一优选例中，通过氨基酸替换，对106-113区域结构进行微调。例如，用酸性氨 基酸谷氨酸或天冬氨酸替换原有的氨基酸。在另一优选例中，通过在106-113区域，保持108位残基不变，插入1_3个氨基酸。 例如，在106-113区域插入酸性或碱性氨基酸，尤其是谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、天冬酰氨 中的一个氨基酸。在另一优选例中，可用化学修饰方法，在106-113区域引入带有负电荷的基团。本发明的LT突变蛋白可以这样进行制备根据已公开的人淋巴毒素的序列来合 成引物，通过PCR法扩增出人淋巴毒素的编码序列。也可以人工合成人TNFa的编码序 列。此外，可以对编码序列进行碱基替换，以利于高表达(例如为了在大肠杆菌中表达，可 以用编码相同氨基酸的大肠杆菌优选密码子替换天然密码子)。然后，以人淋巴毒素的DNA 序列，按本发明中指出的突变形式进行遗传修饰，进行遗传修饰的技术是本领域中已知的， 例如可参见“Mutagenesis :a Practical Approach，，，Μ. J. McPherson, Ed. , (IRL Press, Oxford, UK. (1991)，其中例如包括定点诱变、盒式诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。在获得了定点突变后的编码本发明新突变蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的 表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发 明的新的突变蛋白。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载 体，然后将编码本发明新突变蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋 白表达载体。如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影 响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的 分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA ；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置 时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前 导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的 例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动 物细胞。较佳地，该宿主细胞是原核细胞，更佳地是大肠杆菌。在本发明的一个实例中，制备本发明LT突变体的方法包括如下步骤i.修饰LT的编码序列，使其在保持天然淋巴毒素序列108位残基不变的情况下， 用其它氨基酸替换106-113位中至少一个氨基酸；或者在106-113位插入1_3个氨基酸(如 酸性或碱性氨基酸，优选的是谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、或天冬酰氨)；ii.将上述改造的淋巴毒素基因克隆到表达质粒；iii.用上述携带淋巴毒素基因的表达质粒转化宿主细胞；iv.培养被转化的宿主细胞；v.收集宿主细胞及培养液，分离纯化淋巴毒素突变体。本发明的LT突变体适用于治疗肿瘤和体内寄生虫病。代表性的肿瘤包括(但并不 限于)白血病、组织细胞淋巴瘤、胃癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、黑色素瘤、膀胱癌。 代表性的体内寄生虫病包括(但并不限于)弓浆虫病。本发明的淋巴毒素突变体可以单独使用，也可与化疗药物等其他药物联合使用， 以便增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本发明还提供了药物组合物，它包括有效量的一种或几种本发明的LT突变蛋白， 以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成 分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起 稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因 此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例 子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、 水、等。制剂还可包括湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。在另一优选例中，本发明的药物组合物中还含有额外的化疗药物，如⑶DP、5_FU、 ADM、VCR或其组合。组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出 预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。本发明的LT突变体和药物组合物的给药方式没有特别限制，可以通过口服、局 部、非肠道给药，例如肌肉、静脉、或皮下注射，或吸入喷雾等方式给药。优选方式是静脉注 射给药。当本发明中的LT突变体以片剂或胶囊形式口服时，剂量对于平均体重60-70公 斤的成人而言在约Iug到IOOOug范围内，或以注射剂方式非肠道给药，剂量约为Iug到 500ug，可以每天一次或分几次给药。药物组合物的单元剂量通常包括范围为lug-500ug的 活性成分，典型地是 lug、5ug、10ug、25ug、50ug、100ug、200ug、300ug、400ug、500ug。用本发明组合物治疗具体病症时所用的治疗活性成分的数量和给药方案，取决于 多种因素，包括体重、年龄、性别、必然的医学症状、疾病轻重、给药途径及频率。这可以由医务人员确定。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如 Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。通用方法(a)突变体的评价1.酶联免疫吸附测定TNFRI:Fc/TNFRII:Fc包被在酶标板上，将待测LT突变体稀释至相同浓度上样与 之结合后，加兔抗LT的酶联抗体，显色读数。比较计算，与野生型LT进行比较，求百分率，推测LT突变体与受体的结合能力变 化，初步筛选与TNFRI:Fc结合力强的突变体进行进一步评价。2. rhLT突变体在体外对L929细胞系的细胞毒活性测定L929细胞作为靶细胞，野生型LT做对照，测定rhLT突变体的体外杀伤肿瘤细胞活 性。每单位活力指淋巴毒素诱导了 50%接种细胞调亡时用的淋巴毒素或淋巴毒素突变体的用里。3.受体结合能力测定L929细胞作为靶细胞，加入淋巴毒素或淋巴毒素衍生物进行杀伤，分别用TNFRI 和TNFRII中和淋巴毒素的杀伤作用，以TNFRI :Fc阻断待测淋巴毒素突变体对L929细胞杀 伤的IC50与阻断野生型淋巴毒素对L929细胞杀伤的IC50之比定义为LT与TNFRI受体结 合能力；以TNFRII :Fc阻断待测淋巴毒素突变体对L929细胞杀伤的IC50与阻断野生型淋 巴毒素对L929细胞杀伤的IC50之比定义为LT与TNFRII受体结合能力。(b)淋巴毒素突变体的肿瘤杀伤活性在体外检测各种淋巴毒素突变体对肿瘤细胞的杀伤活性，所使用的肿瘤细胞系包 括Jurkat (白血病)、U937 (组织细胞淋巴瘤)、MKN_45/MGC_863 (胃癌)、MCF_7 (乳腺癌)、 A549 (肺癌)、A375 (黑色素瘤)、T-24 (膀胱癌)细胞等。实施例1野生型LT、LT24_171、LT28_171的制备表达载体构建根据GENBANK中人LT序列(BAA00064)，委托上海生工生物技术服务公司分别全基 因合成编码LT成熟蛋白第1位至171位、第24位至171位、第28位至171位的野生型LT、 LT24_171、LT28_171 氨基酸序列，并克隆于 pET32a(+)载体(购自 Novagen)的 NdeI 和 HindIII 位点上，获得重组表达质粒 LT/pET32a(+)、LT24_171/pET32a (+)、LT28_171/pET32a (+)。在大肠杆菌中的表达重组表达质粒LT/pET32a (+)、LT24_171/pET32a (+)、LT28_171/pET32a (+)分别转化大 肠杆菌BL21 (DE3)，转化液涂布LB (含氨苄青霉素IOOng/ μ 1)平板。从转化平板上挑取单 克隆接种于ImL LB培养基中，37°C、250rpm培养3h后，加入IPTG至终浓度0. 5mM，继续培 养3h。取IOOul表达后的菌液离心收集菌体沉淀，加入50ul SDS样品制备液，在12. 5%的 PAGE胶中进行电泳检测。蛋白纯化
分别取 LT/pET32a (+) /BL21 (DE3)、LT24_171/pET32a (+) /BL21 (DE3)、LT28_171/ pET32a(+)/BL21(DE3)重组工程菌Iml接种IOOOmlLB (含氨苄青霉素lOOng/μ 1)培养基 中，37°C、250rpm培养5h后，加入IPTG至终浓度0. 5mM，继续培养4h。收集湿重为5g的菌 体沉淀用PBS洗涤后超声破碎，离心收集包涵体。用尿素增溶包涵体，用Tri s缓冲液复性。 相继用Q-S印harose FF离子交换柱层析、Phenyl-S印harose FF疏水层析和CM-S印harose FF离子交换柱层析进行纯化。将洗脱液稀释至蛋白浓度为lmg/ml。分别获得野生型LT、LT24_171、LT28_171 蛋白 1· 0、3· 5、4· 2 毫克。实施例2突变体rhLT008的制备rhLT008突变体表达载体的构建(I)PCR扩增突变体基因以LT24_m/pET32a(+)质粒为模板，以LT-P32U和Q107E-R为一对引物进行扩增，获 得LT008-AB片段，同时以LT-P32D和Q107E-F —对引物进行扩增，获得LT008-⑶片段。再 取LT008-AB和LT008-CD混合后为模板，以LT-P32U和LT-P32D为一对引物进行扩增，获得 含Q107E突变的LT008片段。LT-P32U :5，ACACATATGATG CAC TCT ACC CTG AAA CCG 3，(SEQ ID NO 4)LT-P32D :5，TGCAAGCTTCTA CAG AGC GAA GGC TCC AAA 3，(SEQ ID NO 5)Q107E-F 5' CTCTTCTCCTCCGAATACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 6)Q107E-R 5' GAAGGGGTATTCGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 7)PCR产物纯化后与pMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5a，提取LT008/pMD-18T质 粒，正反向进行序列测定。(2)构建rhLT突变体的原核表达载体测序正确的克隆，其质粒用限制酶NdeI和HindIII双酶消化，亚克隆至pET32a(+) 表达载体的相同位点上，获得LT008/pET32a(+)重组表达质粒。rhLT突变体在大肠杆菌中的表达重组表达质粒LT008/pET3a (+)转化大肠杆菌BL21 (DE3)，转化液涂布LB (含氨苄 青霉素lOOng/μ 1)平板。从转化平板上挑取单克隆接种于ImL LB培养基中，37°C、250rpm 培养3h后，加入IPTG至终浓度0. ImM，继续培养3h。取IOOul表达后的菌液离心收集菌体 沉淀，加入50ul SDS样品制备液，在12. 5%的PAGE胶中进行电泳检测。按实施例1同样方法纯化LT008，获得LT008蛋白3. 6毫克。实施例3LT006的制备以LT24_171/pET32a(+)质粒为模板，以 LT-P32U 和 S106E-Q107E-R 为一对引物进 行扩增，获得LT006-AB片段，同时以LT-P32D和S106E-Q107E-F —对引物进行扩增，获得 LT006-CD片段。再取LT006-AB和LT006-CD混合后为模板，以LT-P32U和LT-P32D为一对 引物进行扩增，获得全长的含S106E-Q107E突变的LT006片段。PCR引物序列为S106E-Q107E-F :5，CTCTTCTCCGAAGAATACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 8)S106E-Q107E-R :5，GAAGGGGTATTCTTCGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 9)按实施例2同样方法克隆、表达、纯化LT006，获得LT006蛋白3. 1毫克。实施例4LT009的制备
以LT24_m/pET32a(+)质粒为模板，以LT-P32U和Q107D-R为一对引物进行扩增，获 得LT009-AB片段，同时以LT-P32D和Q107D-F —对引物进行扩增，获得LT009-⑶片段。再 取LT009-AB和LT009-CD混合后为模板，以LT-P32U和LT-P32D为一对引物进行扩增，获得 全长的含Q107D突变的LT009片段。PCR引物序列为Q107D-F 5' CTCTTCTCCTCCGACTACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 10)Q107D-R 5' GAAGGGGTAGTCGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 11)按实施例2同样方法克隆、表达、纯化LT009，获得LT009蛋白4. 2毫克。实施例5突变体rhLT057的制备以LT28_m/pET32a(+)质粒为模板，以LT28_P32U和Q107E-R为一对引物进行扩增， 获得LT057-AB片段，同时以LT-P32D和Q107E-F —对引物进行扩增，获得LT057-⑶片段。 再取LT057-AB和LT057-CD混合后为模板，以LT28_P32U和LT-P32D为一对引物进行扩增， 获得含Q107E突变的LT057片段。LT28-P32U :5，ACACATATG AAA CCG GCT GCT CAC 3，(SEQ ID NO 12)LT-P32D :5，TGCAAGCTTCTA CAG AGC GAA GGC TCC AAA 3，(SEQ ID NO 5)Q107E-F 5' CTCTTCTCCTCCGAATACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 6)Q107E-R 5' GAAGGGGTATTCGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 7)按实施例2同样方法克隆、表达、纯化LT057，获得LT057蛋白3. 1毫克。实施例6LT090的制备以LT24_m/pET32a(+)质粒为模板，以LT-P32U和Q107R-R为一对引物进行扩增，获 得LT090-AB片段，同时以LT-P32D和Q107R-F —对引物进行扩增，获得LT090-⑶片段。再 取LT090-AB和LT090-CD混合后为模板，以LT-P32U和LT-P32D为一对引物进行扩增，获得 全长的含Q107R突变的LT090片段。PCR引物序列为Q107R-F 5' CTCTTCTCCTCCCGTTACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 13)Q107R-R 5' GAAGGGGTAACGGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 14)按实施例2同样方法克隆、表达、纯化LT090，获得LT090蛋白3. 3毫克。实施例7LT092的制备以LT24_m/pET32a(+)质粒为模板，以LT-P32U和Q107N-R为一对引物进行扩增，获 得LT092-AB片段，同时以LT-P32D和Q107N-F —对引物进行扩增，获得LT092-CD片段。再 取LT092-AB和LT092-CD混合后为模板，以LT-P32U和LT-P32D为一对引物进行扩增，获得 全长的含Q107N突变的LT092片段。PCR引物序列为Q107N-F 5' CTCTTCTCCTCCAACTACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 15)Q107N-R 5' GAAGGGGTAGTTGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 16)按实施例2同样方法克隆、表达、纯化LT092，获得LT092蛋白4. 5毫克。实施例8.酶联免疫吸附测定受体结合状况TNFRI:Fc/TNFRII:Fc包被在酶标板上，将待测LT突变体稀释至相同浓度上样与 之结合后，加兔抗LT的酶联抗体，显色读数。
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比较计算，与野生型LT进行比较，求百分率，推测LT与受体的结合能力表1 与受 体的结合能力评价 结果表明，与LT相比，LT006、LT008、LT009与受体TNFRI的结合力基本保持，而与 TNFRII的结合力极大降低。实施例9. rhLT突变体在体外对L929细胞系的细胞毒活性测定对本实施例中对突变体LT006、008、009进一步测定细胞毒活性。L929细胞1. 5 X IO4细胞/孔接种96孔板，37°C、5 % CO2培养24h，每孔加IOOul 不同稀释度的样品和放线菌素D (lmg/L)，继续培养24h后用结晶紫染色法检测细胞存活情 况。检测样品分别为LT国际标准品、N端缺失27个氨基酸的第一代LT原液(LT28_171)、N端 缺失 23 个氨基酸的 LT(LT24_171)和 LT 突变体 LT006、LT008、LT009。一个单位指诱导50%的检测细胞调亡所需要的LT的量。rhLT突变体在体外对L929细胞系的细胞毒活性测定结果见表2 表2细胞毒性 实施例10. TNFRI和TNFRII活性中和法检测LT突变体的结合受体能力(1)细胞种板取对数生长期的L929细胞1. 5 X 105/ml，接种96孔培养板中，每孔 IOOul，培养 24h。 (2)样品稀释种板次日，将LT突变体和LT标准品配成lng/ml 2倍稀释TNFRI， 从250ng/ml起稀释13个稀释度。将LT突变体和LT标准品配成lng/ml 4倍稀释TNFRII， 从500，000ng/ml起稀释13个稀释度每孔含1放线菌素DIOOOng/ml。继续培养24h。(3)样品读数将96孔板取出，弃去培养液并尽量拍干，用结晶紫染色法检测细胞 存活情况，酶标仪570nm处比色。(4)结果分析采用PraphPad Prism4. O数据处理软件的四参数方程进行自动分 析LT标准品浓度的对数值为X轴，0D490值为Y轴，软件将给出样品和标准品的半数有效 浓度(IC50)，并绘制“S”形曲线。以阻断待测淋巴毒素突变体对L929细胞杀伤的IC50与 阻断野生型淋巴毒素对L929细胞杀伤的IC50之比定义LT的受体结合能力。结果见表3。表3LT各突变体结合TNFRI、TNFRII的能力 表3 的中和实验结果表明 LT006、LT008、LT009、LT057、LT090、LT092 结合与 TNFRI 的结合能力保持，表明LT006、LT008、LT009与TNFRI的结合力略高于LT ；而与TNFRII的结 合能力降低了 200-40000倍以上，具有了对TNFRI受体的高度选择性。实施例11. rhLT突变体的体外抑瘤谱rhLT突变体LT008体外杀伤Jurkat (白血病)、U937 (组织细胞淋巴瘤)、MKN_45/ MGC-863 (胃癌)、MCF-7 (乳腺癌)、A549 (肺癌)、A375 (黑色素瘤)、T_24 (膀胱癌)细胞的 能力优于LT。(l)rhLT突变体LT008体外杀伤Jurkat (白血病)细胞Jurkat细胞以1. 0 X IO4细胞/孔接种96孔板，37 °C、5 % CO2培养24h，每孔加 IOOul不同稀释度的样品，放线菌素D终浓度为25ng/ml，继续培养48h后用MTS染色法检 测细胞存活情况。检测的样品分别为LT、rhLT突变体LT008。结果如图1 所示，LT 的 EC50 = 8. 385ng/ml, LT008 的 EC50 = 1. 390ng/ml。(2) rhLT突变体LT008体外杀伤Lovo (结肠癌)细胞Lovo细胞以2. 0父104细胞/孔接种96孔板，371、5% CO2培养4h，每孔加IOOul 不同稀释度的样品，放线菌素D终浓度为2000ng/ml，继续培养24h后用结晶紫染色法检测 细胞存活情况。检测的样品分别为LT、LT突变体LT008。结果如图2 所示，LT 的 EC50 = 5. 171ng/ml ；LT008 的 EC50 = 1. 845ng/ml。(3) rhLT突变体LT008体外杀伤MCF-7 (乳腺癌)细胞MCF-7细胞以1.0X104细胞/孔接种96孔板，37°C、5% CO2培养24h，每孔加IOOul 不同稀释度的样品，放线菌素D终浓度为20ng/ml，继续培养48h后用MTS染色法检测细胞 存活情况。检测的样品分别为LT、LT突变体LT008。结果如图3 所示，LT 的 EC50 = 1. 773ng/ml ；LT008 的 EC50 = 0. 889ng/ml(4) rhLT突变体LT008体外杀伤A549 (肺癌)细胞A549细胞以1. 0X IO4细胞/孔接种96孔板，37°C>5% CO2培养24h，每孔加IOOul 不同稀释度的样品，放线菌素D终浓度为20ng/ml，继续培养48h后用MTS染色法检测细胞 存活情况。检测的样品分别为LT、LT突变体LT008。结果如图4 所示，LT 的 EC50 = 6. 010ng/ml ；LT008 的 EC50 = 3. 886ng/ml。(5) rhLT突变体LT008体外杀伤A375 (黑色素瘤)细胞A375细胞以1. OX IO4细胞/孔接种96孔板，37°C>5% CO2培养24h，每孔加IOOul 不同稀释度的样品，放线菌素D终浓度为lOng/ml，继续培养48h后用MTS染色法检测细胞 存活情况。检测的样品分别为LT、LT突变体LT008。结果图5 所述，LT 的 EC50 = 2. 128ng/ml ；LT008 的 EC50 = 0. 621ng/ml。(6) rhLT突变体LT008体外杀伤HeLa (宫颈癌)细胞
HeLa细胞以2. 0 X IO4细胞/孔接种96孔板，37°C、5% CO2培养4h，每孔加IOOul 不同稀释度的样品，放线菌素D终浓度为2000ng/ml，继续培养24h后用结晶紫染色法检测 细胞存活情况。检测的样品分别为LT、LT突变体LT008。结果图6 所述，LT 的 EC50 = 3. 024ng/ml ；LT008 的 EC50 = 0. 945ng/ml。(7) rhLT突变体LT008体外杀伤U937 (组织细胞淋巴瘤)细胞U937细胞以2. 5 X IO4细胞/孔接种96孔板，37°C、5% CO2培养24h，每孔加IOOul 不同稀释度的样品，放线菌素D终浓度为20ng/ml，继续培养48h后用MTS染色法检测细胞 存活情况。检测的样品分别为LT、LT突变体LT008。结果如图7 所示，LT 的 EC50 = 2. 174ng/ml ；LT008 的 EC50 = 0. 562ng/ml。(8) rhLT突变体LT008体外杀伤HL-60 (白血病)细胞HL-60细胞以1.0X105细胞/孔接种96孔板，37°C>5% CO2培养4h，每孔加IOOul 不同稀释度的样品，放线菌素D终浓度为300ng/ml，继续培养24h后用MTS染色法检测细胞 存活情况。检测的样品分别为LT、rhLT突变体LT008。结果如图8 所示，LT 的 EC50 = 2. 263ng/ml ；LT008 的 EC50 = 1. 034ng/ml。实施例12. rhLT突变体对化疗药物的增敏作用(l)rhLT突变体LT008增加K562 (慢性髓原白血病)、U937 (组织细胞淋巴瘤)、 A549 (肺癌)、MCF-7 (乳腺癌)、SW-626 (卵巢癌)细胞对烷化剂类化疗药物CDDP (顺钼) 和CTX (环磷酰胺)的敏感性。K562、U937、A549、MCF-7 和 Sff-626 细胞以 1. OXlO4 细胞 / 孔接种 96 孔板，37°C、 5% CO2培养24h。加药方案为(a)单加0. lng/ml的LT、LT突变体LT008 ；(b)单加不同浓度CDDP和CTX ； (c)0. lng/ml的LT、LT突变体LT008分别与不同 浓度CDDP和CTX联合同时加药；和(d)空白对照价组加等量培养液。继续培养48h后用MTS染色法检测细胞存活情况。根据浓度反应曲线，求出加或 不加LT、TNF和LT008化疗药物的半数抑制浓度IC50，并求出增敏倍数(T) = IC50 (单用 化疗药)/IC50 (LT、TNF和LT008联用化疗药物)结果如图9 所示，CDDP 组的 IC50 = 7. 96mg/ml ；LT+CDDP 组的 IC50 = 0. 89mg/ml, T = 8. 94 ；LT008+CDDP 组的 IC50 = 0. 12mg/m, T = 66. 33。(2) rhLT突变体LT008增加SW480 (结直肠癌)、MKN-45/MGC-863 (胃癌)细胞对 抗代谢类化疗药物5-FU(5-氟尿嘧啶)和MTX(氨甲蝶呤)的敏感性。SW480 和 MKN-45/MGC-863 细胞以 1. 0 X IO4 细胞 / 孔接种 96 孔板，37 °C、5 % CO2 培养24h。加药方案为(a)单加不同浓度LT、LT突变体LT008 ； (b)单加不同浓度5-FU和 MTX ； (c)不同浓度LT、LT突变体LT008分别与不同浓度5-FU和MTX联合同时加药(d)空 白对照价组加等量培养液。继续培养48h后用MTS染色法检测细胞存活情况。结果如图10 所示，5-FU 组的 IC50 = 40mg/ml ；LT+5-FU 组的 IC50 = 21. 5mg/ml, T = 1. 86 ；LT008+5-FU 组的 IC50 = 2. 3mg/m, T = 17. 39。(3) rhLT突变体LT008增加Jurkat (白血病)、HL-60 (原髓细胞白血病)细胞对 抗生素类化疗药物ADM (阿霉素)的敏感性。Jurkat、HL-60 细胞以 1. 0 X IO4 细胞 / 孔接种 96 孔板，37°C、5% CO2 培养 24h。加 药方案为(a)单加不同浓度LT、LT突变体LT008 ； (b)单加不同浓度ADM ； (c)不同浓度LT、LT突变体LT008分别与不同浓度ADM联合同时加药；(d)空白对照价组加等量培养液。继 续培养48h后用MTS染色法检测细胞存活情况。结果如图11 所示，ADM 组的 IC50 = 1. 07mg/ml ；LT+ADM 组的 IC50 = 0. 98mg/ml, T = 1. 09 ；LT008+ADM 组的 IC50 = 0. 450. 013mg/ml, T = 2. 38。(4)rhLT突变体LT008增加A375 (黑色素瘤),HeLa (宫颈癌)、T_24(膀胱癌)细 胞对植物类化疗药物VCR (长春新碱)的敏感性。A375、HeLa、T_24 细胞以 1. 0 X IO4 细胞 / 孔接种 96 孔板，37°C、5% CO2 培养 24h。 加药方案为(a)单加不同浓度LT、LT突变体LT008 ； (b)单加不同浓度VCR ； (c)不同浓度 LT、LT突变体LT008分别与不同浓度VCR联合同时加药；(d)空白对照价组加等量培养液。 继续培养48h后用MTS染色法检测细胞存活情况。结果如图12 所示，VCR 组的 IC50 = 0. 437mg/ml ；LT+VCR 组的 IC50 = 0. 141mg/ ml, T = 3. 10 ；LT008+VCR 组的 IC50 = 0. 073mg/m, T = 5. 99。上述结果表明，rhLT突变体LT008可显著增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。讨论LT108Y是LT与受体的重要作用残基。该108Y残基是高度保守的，该位点的任何 单点突变都会产生LT与TNFR的结合力急剧下降，受体结合能力下降100倍以上。本发明 人对LT108Y所在的套索结构进行了大量的突变研究，证实LT106-113形成的套索结构是 LT与TNFRI和TNFRII的作用紧密且有差异的位置，在此区域的突变可能造成LT对TNFRI 和TNFRII的亲和力的发生重大变化，是获得受体选择性突变体的理想的研究区域，特别是 LT107位的氨基酸对LT与两个受体的结合力影响巨大。当LT107位残基Q突变为E、D、N、R 时就表现出高度的TNFRI的选择性，受体中和实验证明了这一点，LT与TNFRII的结合力下 降200-40000倍，而与TNFRI的结合能力基本保持不变；说明此区域的氨基酸性质很重要， LTS106M突变体与TNFRI的结合力有所下降，而与TNFRII的结合力保持，LT109位110位的 突变也对LT与两个受体的结合产生不同影响，也证明了此区域是获得受体选择性LT的重 要研究区域。通过对此区域的改造，可以设计出与两个受体结合力有差异的LT突变体。与天然rhLT相比，本发明的rhLT具有对TNFRI的选择性结合，与TNFRII结合能 力降低可高达200-40000倍以上。TNFRI选择性LT降低了 TNFRII可能引起的毒副作用，具 有更低的全身性毒性；避免了 TNFRII与TNFRI对LT的竞争作用以及sTNFRII对LT的中和 作用，从而对TNFRII高表达的肿瘤细胞的敏感性提高，抑瘤谱系更广，研究表明TNFRI选择 性的LT对多种肿瘤细胞的杀伤作用增强，而且与化疗药物联用治疗效果更佳。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
权利要求
一种淋巴毒素在制备增加肿瘤对化疗药物敏感性的药物的用途，其特征是，所述的肿瘤选自非小细胞肺癌、乳腺癌、喉癌、结直肠癌、子宫颈癌、黑色素瘤或胃癌中的一种。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，其中所述的淋巴毒素包括来源于人、鼠、猪、 马或牛的淋巴毒素。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的淋巴毒素为来源于人的淋巴毒素及 其衍生物。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，其中所述的淋巴毒素选自LT1-171、 LT24-171、LT28-171、LT008、LT006、LT009 中的一种。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，其中所述的淋巴毒素是LT1-171。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化疗药物选自钼类药物、蒽环类药 物、5-FU或丝裂霉素中的一种或其组合。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的化疗药物为钼类抗肿瘤药物。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，其中所述的化疗药物选自顺钼、环磷酰胺、 5-FU、氨甲喋呤、长春新碱或阿霉素。
全文摘要
本发明公开了一种受体选择性淋巴毒素突变体，所述淋巴毒素突变体与人TNFRI的结合能力与所述淋巴毒素突变体与人TNFRII的结合能力之比大于10。本发明还公开了所述淋巴毒素衍生物的制法和用途。本发明的LT突变体对TNFRI有选择性结合，与TNFRII结合则大幅降低，因而可减低TNFRII可能引起的毒副作用。
文档编号A61P35/00GK101890156SQ20101018945
公开日2010年11月24日 申请日期2004年12月24日 优先权日2004年12月24日
发明者刘彦君, 吴劲松, 吴芳, 曹峰, 杨彤, 沈毅珺, 王征, 王海波, 许燕, 谭靖伟 申请人:上海复旦张江生物医药股份有限公司;泰州复旦张江药业有限公司