专利名称：一类选择性α<sub>2A</sub>受体激动剂的治疗阿尔茨海默病用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类具有CI2a-肾上腺素受体激动剂活性的化合物，该类化合物作为a 2A-肾上腺素受体受体激动剂具有很好的治疗阿尔茨海默病的活性。
背景技术：
阿尔茨海默症(Alzheimer' s disease,AD)亦称老年性痴呆症或早老性痴呆症，是老年期常见的一类慢性、进行性神经细胞退行性病变。随着人口的老龄化，AD已成为仅次于心血管病、肿瘤和中风而居第四位的死因，目前全球有AD患者约2430万人，预计到2040年全球将共有AD患者8100万。有关AD的病因、预防和治疗靶点的研究成为当今国际迫切热点课题之一。AD病人的脑内病理特征主要为￠-淀粉样蛋白(P-amyloid,A0 )沉积形成的老年斑(Senile Plaque, SP)、微管相关蛋白(Tau蛋白)过度磷酸化所致的神经纤维缠结以及神经元缺失。近年来许多研究者从各个不同的角度如淀粉样蛋白沉积、炎症介质、血管因素、胆固醇代谢等方面探讨AD的病因、病理机制和治疗手段。但到目前为止，AD病因和病理机制尚未完全明了，对AD确切有效的药物尚少，也没有对因治疗根治AD的药物。a 2A-肾上腺素受体(a 2A_adrenoceptor, a 2A_AR)属于G蛋白偶联的7次跨膜受体超家族成员中的一种亚型，广泛分布在血小板、脑、脊髓、脂肪细胞、肾、脾等组织器官，其生物学效应主要由Gi/Go蛋白介导。Ci2a-AR激活后通过Gi/Go蛋白调节能够抑制腺苷酸环化酶(AC)活性，降低细胞内环磷酸腺苷(cAMP)的水平，抑制蛋白激酶A(PKA)及其调控的蛋白质磷酸化，在调控交感神经和中枢神经系统去甲肾上腺素神经元的神经递质释放方面起关键性作用。随着a 2A-AR在大脑皮质中的大量发现，越来越多的研究转向了 a2A-AR在中枢神经系统方面的作用。近几年有少量关于a 2A-AR激动剂在治疗精神分裂症、镇静、镇痛、抗惊厥、抗焦虑、改善记忆，以及药物成瘾方面有一定成效的报道。此外，亦有报道a2A-AR激动剂能够通过抑制额前皮质的cAMP，超极化环核苷酸信号途径而增强帕金森病症中衰退的工作记忆。近年国外有极少数几篇报道，认为a 2A-AR激动剂可能通过减少微管相关蛋白2(MAP-2)在丝氨酸及苏氨酸残基上的磷酸化而增加皮质神经元的生长、进一步对AD产生治疗作用。神经保护剂，神经营养剂，神经再生剂是一类新型的用于治疗AD的药物，国内外临床应用表明，在AD病变的急性期或慢性期开始使用美金刚，神经营养因子，鼠神经生长因子等神经保护剂，具有良好的治疗效果。神经保护剂的市场份额也正在逐年增加。目前，我国研制的注射用神经生长因子在获得SFDA颁发的一类生物制品新药证书后，已加快了药物临床和商品化的进程。a 2A-AR激动剂刺激皮质神经元生长这一作用对于开发神经保护剂具有重要的意义，为AD的预防和治疗提供了新的途径
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗阿尔茨海默病的化合物，该化合物是a 2A-AR激动剂，对阿尔茨海默病有预防或者治疗作用。本发明所述的化合物包括含治疗有效量的化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。本发明采用高通量筛选技术，建立了 a2A-AR激动剂高通量筛选模型并应用于化合物大规模筛选，通过筛选一批从CHEMDIV公司购买的化合物并进行功能性验证寻找到了具有化学式(I)的a2A-AR激动剂。本发明的技术方案为在中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)内稳定转染a2A受体，建立a 2A-AR激动剂高通量筛选模型，进行初筛，复筛，构效关系分析，得到一类具有a 2A受体激动活性的候选药物。具体步骤如下步骤一建立及培养稳定转染a 2A受体的CHO细胞株。步骤二 标准曲线的测定及最佳细胞数确定。步骤三阳性药验证。步骤四采用稳转细胞株和摸索的最佳检测条件对化合物进行a 2A受体激动剂的高通量筛选，得到有明显量效关系的化合物。
图I :标准曲线及最佳细胞数曲线(600cell/iil)图2 :阳性药胍法辛(Guanfacine)量效曲线
具体实施例方式以下结合
本发明的
具体实施例方式I.建立及培养稳定转染a 2A-AR的CHO细胞株。应用重组酶介导的盒交换技术(Recombinase-MediatedCassette Exchange,RMCE)批量构建G蛋白偶联受体细胞株，并使其稳定转染a2A-AR，培养CH0-a2A细胞使其达到稳定生长状态。2.标准曲线的测定及最佳细胞数确定。为验证实验体系的正确性以及能筛选出可靠的a2A-AR激动剂，在建立模型时需要测定标准曲线并确定最佳细胞数。待CHO-a 2A细胞生长到80%的时用0. 5mM EDTA的PBS消化细胞，离心去除上层液体，最后将细胞用刺激缓冲液重悬用于确定最佳细胞数。使用PerkinElmer公司的LANCE cAMP 384Kit试剂盒，配制标准cAMP梯度稀释液及腺苷酸环化酶激活剂(forskolin)梯度稀释液。标准曲线测定方法将cAMP的标准溶液mol/L ( LANCE cAMP检测试剂盒自带)，用刺激缓冲液逐级稀释为终浓度4倍的工作浓度，cAMP与抗体溶液各5 ill加入384孔板中共同孵育45分钟，加入10 U I终止液，孵育一个小时后检测；最佳细胞数检测方法将50mM的forskolin母液用刺激缓冲液逐级稀释为终浓度4倍的工作浓度，forskolin与含有细胞的抗体溶液各5 加入384孔板中共同孵育45分钟，加入10 u I终止液，孵育一个小时后在EnVision微孔板测读仪上检测。根据forskolin量效曲线窗口(性噪比S/B)及曲线与cAMP标准曲线斜率相近的细胞浓度作为最佳细胞数。标准曲线及最佳细胞数确定见图I。3.选用a 2A-AR选择性激动剂Guanfacine对所建立的高通量筛选模型进行验证并且根据量效曲线计算其的EC50。
阳性药测定方法将IOOmM的Guanfacine母液,用刺激缓冲液逐级稀释为终浓度4倍的工作浓度，配置能引起最佳细胞数Ratio EC90效应的forskolin稀释液。阳性药Guanfacine2. 5 U I与含有最佳细胞数的抗体溶液5 加入384孔板中共同孵育15分钟，再将forskolin稀释液2. 5 ill加入384孔板中孵育30分钟，加入10 U I终止液再孵育一个小时后用EnVision微孔板测读仪检测。阳性药量效曲线见图2。4.在上述的最佳检测条件下进行a2A-AR激动剂的的初筛和复筛。初筛与复筛过程相同，初筛只选用一个浓度对8万个化合物进行初步筛选，再选择初筛有效的化合物梯度稀释8个浓度进行复筛，过程如下用Janus全自动加样工作站稀释化合物并吸取5 u I转移到384孔板中，再用Multidrop自动加样仪将含有最佳细胞数的抗体溶液5 ill加入384孔板中，两者共同孵育45分钟后，Multidrop自动加样仪将10 U I终止液加入384孔板中，再次孵育一个小时，用EnVision微孔板测读仪检测。复筛得到一系列具有a 2A-AR激动作用的化合物。复筛实验结果筛选得到的化合物可以根据母核的结构总结为一类，结构式与EC5tl如下
权利要求
1.下式化合物或其药学上可以接受的盐
2.权利要求I要求保护的式(I)的化合物或其药学上可以接受的盐用于制备具有作为a 24受体激动剂的药理作用的药物制剂的用途。
3.按照权利要求2的用途，作为a2A受体激动剂，用于治疗阿尔兹海默症。
全文摘要
本发明涉及一类具有α2A受体激动活性的化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，有很强的体外激动α2A受体的活性，EC50均为nM水平，其中活性最强的化合物的EC50为16.97±0.79，可以作为神经保护剂，用于治疗阿尔茨海默病。
文档编号C07D413/14GK102977087SQ20121054387
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者张陆勇, 何玲, 严明 申请人:中国药科大学