作为褪黑素受体MT₁和MT₂的亚型选择性激动剂的异喹诺酮化合物的制作方法

专利名称：：作为褪黑素受体MT₁和MT₂的亚型选择性激动剂的异喹诺酮化合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及异喹诺酮衍生物和它们作为治疗试剂的用途。特别地，本发明涉及能够调节褪黑素受体的异喹诺酮化合物，以及涉及含有这些化合物的药物组合物，用于在哺乳动物受试者中治疗与褪黑素受体相关的失调或病理学状况。
背景技术：
：褪黑素(N-乙酰-5-曱氧基色胺)是主要由松果腺合成和分泌的激素，已经显示了调节哺乳动物昼夜节律和生殖功能(KennawayandWright,2002;GuerreroandReiter,2002)。^逸黑素是在哺乳动物的神经系统、血液和周围组织中广泛分布的亲脂性激素(Vaughanetal.,1978;Rogawskietal.，1979)。它通过与特定的褪黑素受体相互作用来发挥它的生物学效应。两种人类褪黑素受体MT,和MT2已经被鉴定和克隆，都具有对褪黑素的相似的结合亲合力(Reppertetal.,1994，1995)。这些受体是G蛋白偶联受体，表明了经由G蛋白介导的信号转导途径的触发机制。G蛋白随后直接或间接地(经由第二信使)调节各种效应物系统。由于能够介导褪黑素受体的下游信号转导途径的G蛋白的不同类别(Newetal,2003),MT!和MT2可以触发许多不同的信号转导级联，引起各种独特的细胞反应的活化(Witt-Enderbyetal.，2003)。褪黑素受体MT,和MT2在身体内的各种各样的组织中表达。MTt受体在脑内下丘脑的视交叉上核(SCN)中、心脏血管以及脑与周围组织的各种区域中表达。MT!受体也在正常的和恶性的乳房組织中存在(Dillonetal,2002)。MT2受体更多地定位于和存在于脑内的小脑和SCN、视网膜、卵巢、肾和心脏血管中。两种受体都被认为通过调节身体的昼夜节律在介导睡眠/醒来周期方面起作用(Dubocovichetal.，1998)，但是MT!受体被认为调节睡意，M丁2受体被认为帮助调节睡眠-醒来周期，MTi受体收缩心脏血管，MT2受体扩张它们(Doolenetal,1998)。此外，MT2受体涉及炎症性反应。因此，随着两种受体在身体内许多不同组织中的广泛分布，褪黑素涉及身体的许多生理过程并不令人惊讶。褪黑素已经与许多生理过程的调节相关联(Pandi-Perumaletal,2006)，因而，已经用于许多生物学失调的治疗。它广泛地用于时间生物学失调例如季节性情感障碍(SAD)(Rosenthaletal.,1986)、原发和继发性失眠、以及由失明(Nakagawaetal,,1992)、倒班(Sacketal.,1992)和时差反应(Arendtetal.,1991)引起的睡眠失调。褪黑素还与视网膜醛生理^L能(Dubocovichetal.,1997)、血压调节(Doolenetal.,1998)以及免疫系统的调节(GuerreroandReiter,2002)和炎症(CuzzocreaandReiter,2002)相关联。此外，褪黑素已经显示了具有对抗癌症和肿瘤生长的强的效果(Reiter，2003;Blasketal,2002)。而且，在许多新近的研究中，已经报道了褪黑素抑制多种肺瘤细胞，包括乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑素瘤、前列腺肺瘤和肠胂瘤细月包的生长和增殖(Pandi-Perumaletal.2006)。新近的证据也表明，褪黑素在精神失调(双极的、抑郁和忧虑失调、精神分裂症、癫痫和癫痫发作)、神经变性疾病(Parkinson's病(PD)、阿尔茨海默氏病(AD)、Huntington，s病、肌萎缩性侧索硬化、肌肉硬化)中风和神经内分泌失调(消化性溃疡、银屑病)的治疗方面可能是有益的。新近的研究提供了实验证据，支持了褪黑素作为PD的治疗中有希望的治疗试剂(Khaldyetal.,2003)。褪黑素还显示了在人类(Molina-Carballoetal.，1997)和大鼠(Bikjdaoueneetal.,2003)中赋予对抗癫痫的保护效果，这种效果被认为通过提高GABA能神经传递来发生(Acuna-Castroviejoetal.，1995)褪黑素还显示了在Alzheimer，s病人中赋予了有益的效果。新近的报告指出，患有AD的患者展现了降低的褪黑素受体亚型MT2的表达(Savaskanetal.，2005)。向AD患者施用褪黑素已经获得了满意的结果，包括改善的认知功能、改善的睡眠和疾病发展速度的显著降低(Maurizi,2001;Cardinali,2003)。褪黑素也在神经保护中起到作用。新近的报告显示了褪黑素在急性脑缺血性中风后的神经保护中的牵涉。对病灶脑缺血的动物模型的研究指出，褪黑素赋予了显著的神经保护效果(Kilicetal.，2005;Leeetal.,2005;Macleodetal.,2005)并发挥了抗炎症效果(PeiandCheung,2004),结果表明，褪黑素可能是人中风后神经保护药物的良好候选物(Macleodetal.,2005)。褪黑素的神经保护作用被认为通过它的抗氧化和自由基清除活性来发生(Leeetal.,2005)。尽管褪黑素对多种效应物系统具有调节效果，但是它在临床应用中的使用受到它的短的生物学半衰期、不良的口服生物利用率和遍在性作用的限制(Uchikawaetal.,2002)。因此，最近几年中，已经进行了许多工作来鉴定或开发褪黑素激动剂，其比褪黑素是更加代谢稳定的、展现更高的对MTt和MT2受体的亲合力，最主要的，显示了相对一种亚型的对另一种受体亚型的选择性。合成来源的褪黑素激动剂模拟了褪黑素通过与褪黑素受体MT^和MT2的结合所产生的信号级联。它们对于不同褪黑素受体亚型的生理学研究是有无限价值的，帮助描绘褪黑素调节和触发其他效应物系统的方式。由于褪黑素已经显示了通过广泛地靶向受体来调节睡眠-醒来周期，展现了褪黑素性质以及对褪黑素受体亚型之一或两者的高亲合力和选择性的褪黑素激动剂作为治疗试剂和研究工具都是有价值的。对于失眠和昼夜节律相关的失调、以及在如上所述与褪黑素相关的其他失调的治疗中，它们是有希望的治疗试剂。除了褪黑激素之外，还存在着与褪黑素受体相互作用的几种其他的已知的褪黑素配体。这些包括2-碘褪黑素和N-乙酰血清素，其与褪黑素一样，以不同的亲合力结合MT,和MT2受体。这些激动剂已经用于受体亚型的药理学评估，但是它们的使用受到了它们缺乏两种受体亚型之间的选择性的限制。此外，它们不是有希望的药物候选物。表现对受体之一的选择性的褪黑素受体的配体具有更大的药理学和治疗学的价值。因此，最近几年中，许多不同的科研小组使用了药物化学来合成展现更大选择性和更高结合亲合力的激动剂。大多数已知的褪黑素受体配体是基于褪黑素的。引哚结构开发的。关键特征包括5-曱氧基基团(Chongetal.,1993;Moretal.，1998;Sicsicetal.,1997;Sugdenetal.,1995)和3-乙基酰胺链(GrolandJansen,1996)。褪黑素上的曱氧基和酰胺基的相对距离和构象是决定配体的效力和功效的一些关键因素。附着到酰胺羰基基团上的烷基链有长度<3个碳的限制以保持高亲合力(Sugdenetal.,1995)。已经深入地研究了C2和C6取代的耐受性和特异性(Spadonietal.，1993;Sugdenetal.,1995)。其他褪黑素配体结构采用了各种杂环的支架，例如基于吲哚的三环和四环、1，2-二氩化茚、萘、1,2，3，4-四氢化萘、喹啉、苯并嚼唑、苯并呋喃等等(Zlotos,2005)。在植物中，对抗草食动物和病原体的防御机制涉及生物碱。公开的报导指出了植物中的生物碱赋予神经保护活性。它们也被报道具有抗病毒、抗微生物、和免疫调节活性(Hudson,1990;Huang，1999),以及作为强力的抗肺瘤试剂(Craggetal.,1997;CraggandPhil,1999)。虽然，在本发明之前，美国申请N0.10/135，247和10/738,964以及PCT申请7>开WO/2005/075431A1和WO/2005/075432Al/^开了一些异唾诺酮书亍生物，但是这些申请人不知道具有褪黑素受体激动剂活性的任何异喹诺酮衍生物。参考文献Acuna-Castroviejoetal.(1995)Cellprotectiveroleofmelatonininthebrain.Jow""/o/尸/wea//^earc/z16:100-112.Arendt,J.(1991)Melatonininhumans:jetlagandafter.」<iv尸/wea/5:299-302.Bikjdaoueneetal.(2003)Changesinbrainaminoacidsandnitricoxideaftermelatoninadministrationinratswithpentylenetetrazole-inducedseizures.JoMrwa/q/"Pi'Mea/iesearc/z25:54-60.Blask,D.E.，Sauer,L,A.，andDau勿，R.T.(2002)Melatoninasachronobiotic/anticanceragent:cellular,biochemicalandmolecularactionandtherapeuticimplicationsforcircadian-basedcancertherapy.CWrewf7b//cs她血/"a/C7ew/s吵2:113-132.Cardinali,D.P.(2003)ClinicalperspectivesfortheuseofmelatoninasaneuroprotectivechronobioticinAlzheimer'sdisease,iwa/"osc/iVewra/og/czwe2:188-204.Cragg，G,M.,Newman,D丄，Weiss，R.B.(1997)CoralReefs，forests,andthermalvents:theworldwideexplorationofnaturefornovelanticanceragents.iSe/w力a^y0"co/ogy24:156-163.Cragg，G.M.andPhil,D丄(1999)Discoveryanddevelopmentofantineoplasticagentsfromnaturalsources.C朋cer/"vesf17:153-163.Cuzzocrea,S.andReiter，R丄(2002)Pharmacologicalactionsofmelatonininacuteandchronicinflammation.Cwr7b/A/e<iCTzem2:153-165.Dillon,D.C.，Easley，S.E.,Asch,B.B.，Cheney,R.T.，Brydon,L.,Jockers，R.,Winston,J.S.，Hurd，T.，andAsch,H丄.(2002)Differentialexpressionofhigh-affinitymelatoninreceptor(MTl)innormalandmalignanthumanbreasttissue,Jow"a/o/C7/w'ca//Wo/ogy118:451-458.Doolen，S.，Krause,D.N.，Dubocovich,M丄.,andDuckies，S.P.(1998)Melatoninmediatestwodistinctresponsesinvascularsmoothmuscle.Jowr""/o/ZV^moco/ogy345:67-69.Dubocovich,M丄.，Masana，M丄，Iacob，S.，andSauri，D.M.(1997)MelatoninreceptoragoniststhatdifferentiatebetweenthehumanMellaandMellbrecombinantsubtypesareusedtoaccessthepharmacologicalprofileoftherabbitretinaML1presynapticheteroreceptor.A^w"少"-Sc/脂WeZerg，《sAc/w'veso/尸/2wwaco/ogy335:365-375.Dubocovich,M.L.，Yun,K.,Al-Ghoul，W.M.,Benloucif,S.，andMasana,M.I.(1998)SelectiveMT2melatoninreceptorantagonistsblockmelatonin-mediatedphaseadvancesofcircadianrhythms.尸J5"ES12:1211—1220.Guerrero，J.M.andReiter，R丄(2002)Melatonin誦immunesystemrelationships.Cwrre"/7b//csMec^c/wa/C7e脂、^y2:167-169.Hudson,J.B.(1990)Alkaloids.In:Antiviralcompoundsfromplants,pp.83-87.CRCPress,BasaRaton.Huang，K.C.(1999)ThePharmacologyofChineseHerbs.2ndedition,CRCPressIXC.Kennaway,D丄andWright,H.(2002)Melatoninandcircadianrhythms.0/〃7b/7A/edC/zem2:199-209.Khaldy，H.，Escames，G.，Leon，J.，Bikjdaouene，L.,andAcuna-Castroviejo，D.(2003)SynergisticeffectsofmelatoninanddeprenylagainstMPTP-inducedmitochondrialdamageandDAdepletion.7Vewra6/o/ogyo/24:491-500.Kilic，U.,Kilic,E.,Reiter，R丄，Bassetti,C丄.andHermann,D.M.(2005)Signaltransductionpathwaysinvolvedinmelatonin-inducedneuroprotectionafterfocalcerebralischemiainmice.JP/"ea/38:67.Lee,E陽J.，Lee，M-Y.,Chen，H-Y.，Hsu,Y-S.，Wu,T-S.，Chen，S-T.andChang,G-L.(2005)Melatoninattenuatesgrayandwhitematterdamageinamousemodeloftransientfocalcerebralischemia.J尸/"ea/38:42.Macleod,M.R.，O，Collins，T.,Horky,L.L.，Howells，D.W.，andDonnan，G.A.(2005)Systemicreviewandmeta-analysisoftheefficacyofmelatonininexperimentalstroke.JT/wea/38:35.Maurizi，C.P.(2001)Alzheimer'sdisease:rolesformitochondrialdamage,thehydroxylradicalandcerebrospinalfluiddeficiencyofmelatonin.Me血a/i/少/7o^ses57:455-462.Molina-Carballoetal.(1997)Utilityofhighdosesofmelatoninasadjunctivetherapyinachildwithseveremyoclonicepilepsy:twoyears'experience.Jbwma/o/7^"ea/iesearc/z27:202-209.Nakagawa，H.，Sack,R丄.,andLewy,A丄(1992)Sleeppropensityfree-runswiththetemperature,melatoninandCortisolrhythmsinatotallyblindperson.57ee/15:330-336.NewD.C.,TsimS.T.andWongY,H.(2003)Gprotein-linkedeffectorandsecondmessengersystemsinvolvedinmelatoninsignaltransduction.7VewmsZg"a/s12:59-70.Pandi-Perumal，S.R.，Srinivasan,V.，Maestroni，G.J.M.，Cardinali，D.P.，Poeggeler，B.，andHardeland,R.(2006)Nature'smostversatilebiologicalsignali^S/ow服/273:2813-2838.Pei,Z.andCheung,R.T.(2004)Pretreatmentwithmelatoninexertsantiinflammatoryeffectsagainstischemia/reperfbsioninjuryinaratmiddlecerebralarteryocclusionstrokemodel.J尸mea/37:85-91.Reiter，R.J.(2003)Melatonin:Clinicalrelevance.ZVac"ceaw//e5^wcAC7/"/ca/五"^om力o/ogy朋dMe/a6o//5vw17:273-285.Reppert,S.M.,Weaver,D.R.，andEbisawa，T.(1994)Cloningandcharacterizationofamammalianmelatoninreceptorthatmediatesreproductiveandcircadianresponses.jVewra"113:1177-1185.Reppertetal.(1995)Molecularcharacterizationofasecondmelatoninreceptorexpressedinhumanretinaandbrain:theMellbmelatoninreceptor,扁爿ca"c/腦92:8734-8738.Rogawski,M.A.，Roth,R.H.，andAghajanian,G.K.(1979)Melatonin:Deacetylationto5-methoxytryptaminebyliverbutnotbrainarylacylamidase.</A^卿c/zew32:1219-1226.Rosenthaletal.(1986)Melatonininseasonalaffectivedisorderandphototherapy.Wewra/rramw5"w///21:257-267.Sack,R丄.，Blood,M丄.，andLewy,A.J(1992)Melatoninrhythmsinnightshiftworkers.S/鄉15:434-441.Savaskan，E.,Ayoub,M.A.，Ravid，R.，Angeloni,D.，Fraschini,F.,Meier,F.，Eckert，A.，Muller-Spahn，F.，andJockers,R.,(2005)ReducedhippocampalMT2melatoninreceptorexpressioninAlzheimer'sdisease,^固/ies38:10.Uchikawaetal.(2002)Synthesisofanovelseriesoftricyclicindanderivativesasmelatoninreceptoragonists./JMedCTiem45:4222-39.Vaughanetal.(1978)Melatoninconcentrationinhumanbloodandcerebrospinalfluid:Relationshiptostress./C7/wEwt/ocr/wo/Afefa647:220-223.Witt-Enderbyetal.(2003)Melatoninreceptorsandtheirregulation:biochemicalandstructuralmechanisms.Z^/e5We"ces72:2183-2198.
发明内容在本发明的一个方面中，提供了治疗、预防或改善哺乳动物中的病理状况的方法，其中所述病理状况与褪黑素受体相关，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的式(I)的异喹诺酮衍生物的步骤R4O其中RrR7各自独立地是氢或取代基。取代基是取代氢原子的原子或原子基团。取代可以通过化学合成领域已知的方法来实现。例如，通过合适的设计，高产量的组合合成能够产生大的衍生物库，所述衍生物具有附着到亲本化合物的主干的各个位置的各种取代基。然后可以通过希望的褪黑素性质选择本发明的异喹诺酮衍生物。对于大的衍生物库，选择可以通过高产量的筛选方法来实现。作为治疗试剂，式(I)的化合物可以具有下文定义的功能衍生物形式。作为本发明的另一个方面，提供了一系列异喹诺酮衍生物，其具有褪黑素性质，对褪黑素受体具有高亲和力，有或者没有相对于受体的一种亚型针对另一种亚型的高选择性。这些异喹诺酮衍生物具有以下的式(II)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(II)其中Rj、R2、R3、Rt和R7独立地是H、卣素、烷氧基、烷基或羟基，条件是R!、R2、R3和R之一是X-(CH2)n-R8;Rs是烷基或芳烷基；Re是H或烷基；X是键、O、S、SO、S02、CO或NH;n=0-10;Rs是链烯基、取代或未取代的芳基、NR9Rk)或OR9;R9是H、取代的或未取代的芳基曱基、或链烯基；和R,o是H或烷基。期待的是，普通技术人员将理解的，上述化合物可以以各种可能的外消旋的、对映异构或非立体异构的同分异构体形式制备，可以与矿物质和有机酸形成盐，也可以形成衍生物例如N-氧化物、前体药物、生物电子等排体。"前体药物"是指化合物的无活性形式，由于以短暂的方式使用来改变或消除亲本分子中不希望的性质的一种或多种专门化的保护基团的附着而导致无活性，其一旦被施用便在身体内部(体内)被代谢成或转变成活性化合物。"生物电子等排体"是指由原子或原子的基团与其他的、广义上类似的原子或原子的基团的交换而产生的化合物。生物电子等排替换的目的是产生具有与亲本化合物类似生物学性质的新化合物。生物电子等排替换可以是基于物理化学的或基于拓朴的。从已知化合物(例如在本说明书中公开的那些)制备适合的前体药物、生物电子等排体、N-氧化物、药学上可接受的盐或各种异构体是本领域普通技术人员能力之内的。因而，本发明期待上文公开的化合物的所有适合的异构体形式、盐和衍生物。在本发明的上下文中，术语"功能衍生物，，是指来自上文公开的特定化合物的前体药物、生物电子等排体、N-氧化物、药学上可接受的盐或各种异构体，其在一个或多个方面与亲本化合物相比是有益的。制备功能衍生物可能是费力的，但是所涉及的技术是本领域公知的。各种高产量化学合成方法是可用的。例如，组合化学已经使得化合物库的快速扩展与各种高效率的生物筛选技术结合。本发明的另一个方面，提供了合成和鉴定褪黑素受体激动剂的方法，所述褪黑素受体激动剂用作治疗试剂用于治疗与褪黑素受体相关的多种疾病。所述方法包括步骤(a)设计和合成在不同位置具有各种取代基的式(I)的异会诺酮衍生物，和(b)对异喹诺酮衍生物进行分析来测定与褪黑素受体相关的任何效果或任何褪黑素激动剂活性。在步骤(a)中，异喹诺酮衍生物可以通过常规的有机合成逐个地获得，其中设想了在式(I)的一个或多个给定位置处具有取代基的特定衍生物。异喹诺酮衍生物还可以通过利用异喹诺酮结构单元的固相组合合成来获得。异喹诺酮衍生物的库可以通过利用IRORI技术的组合合成即时获得，IRORI技术涉及microkan反应器和无线复频标签。在步骤(b)中，如果观察到褪黑素受体相关的效果，还可以进一步测定针对特定褪黑素受体亚型的效果的特异性。对于理解说明书和解释权利要求的范围来说，在整个说明书和权利要求书中，词语"一"是指"一个(一种)或多个(多种)"。例如，"对一异喹诺酮衍生物进行一分析"与"对一种或多种异喹诺酮衍生物进行一种或多种分析"是相同的。本发明的另一个方面，还期待的是，式(II)的组合物进一步掺入到药物组合物中，用于治疗或预防哺乳动物中的病理状况或症状，其中可以通过调节褪黑素受体的活性减轻和预防所述病理状况或症状。本发明的另一个方面，提供了治疗、预防或改善哺乳动物中的病理状况的方法，其中通过调节褪黑素受体的活性减轻或预防所述病理状况，其中所述方法包括向患有病理状况的所述哺乳动物施用治疗有效量的式(I)的化合物。褪黑素受体是MTVMT2、或两者。另一个方面，提供了为治疗或科学研究目的调节MTi或MT2受体活性的方法，通过体外或体内地用式(I)的化合物接触所述受体。在附属于并构成本公开内容的一部分的权利要求书中，详细地指出了表征本发明的各种特征和新颖点。为了更好地理解本发明、它的操作优点、以及通过它的使用获得的特定目标，应当参考附图和随后的说明，其中说明和描述了本发明的优选的实施方式。附图1显示了异会诺酮化合物IS005的剂量反应曲线。附图2显示了异会诺酮化合物IS030的剂量反应曲线。附图3显示了异会诺酮化合物IS007的剂量反应曲线。附图4显示了异查诺酮化合物IS017的剂量反应曲线。附图5显示了异会诺酮化合物IS044的剂量反应曲线。附图6显示了异喹诺酮化合物IS521的剂量反应曲线。附图7显示了异唾诺酮化合物IS528的剂量反应曲线。附图8呈现了开发本发明的新型褪黑素化合物中涉及的步骤。具体实施例方式I.获得具有褪黑素激动剂活性的异喹诺酮衍生物异会诺酮衍生物可以通过从天然来源例如植物提取它们或通过化学合成来获得。实际上，在本发明中利用了天然来源和化学合成两者。参考附图8，来自天然产物的生物碱首先在荧光成像平板读取器(FLIPR)上通过高产量筛选(Ca"动员分析)来筛选针对G蛋白偶联受体(GPCR)的比活性。使用了与关键信号转导途径相关的一系列GPCR。异喹诺酮生物碱，一种最常见的生物碱种类，展现了针对褪黑素受体ML和MT2的活性。然后合成基于异会诺酮生物碱的小的化合物库，针对MT,/MT2受体来筛选。由于这些是初步的筛选，进行单剂量分析(10pM)。对成功地活化MT!/MT2受体的化合物在此进行Ca"动员分析，这次通过使用亲本细胞系。在这种情况下，多剂量的新化合物被用于产生完整的剂量反应曲线和测定它们相应的ECso。还对展现了阳性结果(positivehit)的化合物进行一系列其他功能分析来获得进一步的活性证明。这些包括cAMP和荧光素酶分析。然后对被成功地证实为褪黑素激动剂的所有新的化合物进行第二级的分析来确认作用的机制。这些分析包括(i)放射性配体结合分析来检查化合物取代褪黑素的能力，褪黑素是V/MT2受体的天然配体；和(ii)ERK分析来测量下游信号转导途径的活化。此外，还通过MTT分析来筛选新的化合物的细胞毒性，其测量在暴露于新的异喹诺酮化合物之后的细胞生存力。在下文中进一步提供了制备本发明的化合物的合成方案和特定实例。<image>imageseeoriginaldocumentpage20</image>在下文的实施例1中举例说明了方案1。方案2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>在下文的实施例2中举例说明了方案2:方案3OH〇tR3XHOBBr3OntR2RX0RON-R2N-R2X:Br或IR。R2和R3是本领域普通技术人员认为适合于所述方案的取代基团。优选的，RpR2是烷基或取代的烷基基团，R3、R是烷基、取代的烷基、酰基、磺酰基基团。在下文的实施例3和4中进一步举例说明了方案3。方案4卜(CH2)n-CI'"CI—(CH2)n-ONalRtOi—(CH2)n—OfON-R221R,和R2是本领域普通技术人员认为适合于所述方案的取代基团。n是2-12。在下文的实施例5中举例说明了方案4。方案5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>所需产物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>r3y:石典代曱烷，烯丙基溴，苄基溴，4-溴苄基溴，3-曱氧基苄基溴，4-叔丁基在下文的实施例6中举例说明了方案:步骤l<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>向曱胺在THF中的溶液(2.0M,16.8mL，33.7mmol)添加苯基乙烯基亚砜(3mL，22.4mmol)。反应混合物在室温下搅动18小时。在真空下除去溶剂。产生的残余物通过柱层析纯化来提供产物(2.9g,17.1mmol，76%)。步骤2o在氮气下，向步骤l的产物(2.9g)、4-羟基-3-曱氧基苯曱酸(3.5g,20.6mmol)和HOBt(2.8g，20.6mmol)在80mL二氯曱烷的溶液中滴加二异丙基碳二亚胺(2.6mL,20.6mmol)。反应混合物在室温下搅动12小时。在真空下除去溶剂。产生的残余物通过柱层析纯化来提供产物(4.8g，14.4mmol，84%)。iHNMR(400MHz,CDC13)57.64(1H,dd,J=8.4，1.2Hz)，7.56(1H，d，J=1.2Hz)，7.30(5H，m)，6.93(1H，d,J=8.4Hz),4.49(2H，t,J=5.6Hz)，3.92(3H，s)，3.31(2H，t，J=5.6Hz)，2.94(3H，s)。步骤3o步骤2的产物(4.8g,14.4mmol)溶于40mL乙酸酐中。产生的混合物回流下加热6小时。减压下除去过量的乙酸酐。产生的残余物用饱和的碳酸氢钠处理，用二氯曱烷提取，干燥并浓缩，得到产物(6.1g，100%)，其不进一步纯化就用于下一个步骤。iHNMR(400MHz,CDC13)S7.53(1H,m)，7.32(4H，m)，7.01(2H，m)，6.90(1H,m)，6.50(1H，s),3.88(2H，m)，3.81(3H,s)，3.03(3H,s),2.32(3H，s)，2.09(3H，s)。步骤4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>向步骤3的产物(粗产物，6.1g)在70mL曱苯中的溶液中，添加p-曱苯磺酸一水合物(12.2g,64.1mmol)。混合物在氮气中加热至回流。40分钟之后，减压下除去溶剂。产生的残余物用饱和的碳酸氢钠中和。用二氯曱烷提取混合物几次，直到水相的TLC不显示期望的产物。干燥合并的二氯甲烷，然后浓缩和通过柱层析纯化，提供呈白色固体的两种产物。产物l:6-羟基-7-甲氧基-2-曱基-l(2H)-异喹诺酮(2.1g，10.2mmol，71%)toMR(糊MHz，CDC13)57.82(1H，s)，6.99(1H,s)，6.98(1H，d，J=7.2Hz)，6.38(1H,d，J=7.2Hz),3.99(3H,s),3.60(3H,s)。产物2:6-羟基-5-曱氧基-2-曱基-l(2H)-异喹诺酮(80mg,0.39mmol，3%)'HNMR(400MHz,CDC13)S8.15(1H,d，J=8.8Hz),7.15(1H，d，J=8.8Hz),7.08(1H，d，J=7.4Hz),6.66(1H，d,J=7.4Hz),3.91(3H,s)，3.59(3H,s)。从不同地取代的苯曱酸和伯胺开始，根据实施例l中列出的操作制备具有不同取代型式的以下异喹诺酮化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>买施例2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>向甲胺在THF中的溶液(2.0M，49.3mL,98.5mmol)添加苯基乙烯基亚石风(10mL，65.7mmo1)。反应混合物在室温下搅动48小时。减压下浓缩混合物来得到粗产物，其通过柱层析纯化来提供产物(8.38g，49.5mmol，75%)。步骤2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>在氮气下，向步骤l的产物(8.38g，45.7mmo1)、3-羟基-4-曱氧基-苯曱酸(8.46g，50.3腿ol)和HOBt(6.84g，50.3mmol)在150ml二氯曱烷和40mLDMF的混合物中的溶液中滴加二异丙基碳二亚胺(7.9mL,50.3mmol)。在室温下搅动2天之后，停止反应，减压下浓缩。残余物用二氯曱烷处理。滤出白色的脲盐。滤液用饱和的氯化铵处理，用二氯曱烷萃取，干燥并浓缩，以提供18.83g的粗产物，其不进一步纯化就用于下一个步骤。步骤3向在IOOmLDMF中的步骤2的产物(粗产物，18.83g)添加千基溴(8.1mL,68.6mmol)和碳酸钾(9.5g，68.6mmol)。反应混合物在室温下搅动17小时。减压下除去溶剂，产生的残余物用水处理，用乙酸乙酯萃取(x3)。干燥、过滤和浓缩合并的乙酸乙酯提取物。柱层析纯化提供了产物(17.7g，41.8mmo1,两个步骤91%)。在氮气中，在0摄氏度下，向步骤3的产物(17.7g)在210mL二氯曱烷的溶液中滴加2，4,6-三曱吡啶(16.6mL,125.4mmol)，随后滴加TFAA(29.5mL，208.95mmol)。在搅动30分钟之后，通过緩慢添加180mL10%碳酸钾来淬灭反应。混合物然后加温到室温。分离各层。用二氯曱烷萃取水层(x2)。用10%盐酸盐洗涤(x2)合并的二氯曱烷，干燥、过滤并浓缩。产生的残余物溶于210mL曱苯中。添加p-甲苯磺酸一水合物(39.75g，209.0mmol)。产生的混合物回流下加热40分钟。反应冷却到室温。添加饱和的碳酸氢钠直到pH二8。分离各层。用二氯曱烷萃取水层几次，直到水层的TLC不显示期望的产物。干燥、过滤和浓缩合并的有机层。通过在硅胶上的柱层析纯化提供了两种主要产物。产物4:5-羟基-6-曱氧基-2-曱基-l(2H)-异喹诺酮(2.5g，10匪ol，24%)'HNMR(400MHz,CDC13)S7.96(1H，d,J=8.8Hz),7.03(1H，d,J=8.8Hz)，6.97(1H,d，J=7.6Hz),6.83(1H，d，J=7.6Hz),3.86步骤4(3H,s)，3.55(3H，s)。产物3:7-羟基-6-曱氧基-2-甲基-l(2H)-异喹诺酮(3.2g,15.6mmol，37%)iHNMR(400MHz，CDC13)S7.78(1H,s)，6.98(1H,d，J=7.4Hz)，6.87(1H,s),6.46(1H，d，J=7.4Hz)，3.98(3H，s),3.60(3H，s)。向5-羟基-6-曱氧基-2-曱基-l(2H)-异会诺酮(实施例2，步骤4的产物4)(40mg，0.20mmol)在3mLDMF种的溶液中，添加千基溴(0.035mL，0.30mmol)和碳酸钾(55mg，0.40mmol)。反应在室温下搅动24小时，通过添加水来淬灭。用乙酸乙酯萃取混合物(x3),干燥、过滤并浓缩。通过柱层析纯化产生的残余物，提供了产物(45mg，76%)。iHNMR(400MHz，CDC13)S8.20(1H，d,J=8.8Hz)，7.35-7.47(5H，m)7.14(1H，d,J=8.8Hz)，6.94(1H，d，J=7.0Hz)，6.67(1H，d，J=7.0Hz)，5.07(2H,s)，3.97(3H,s)，3.53(3H，s)。利用合适的中间物(产物l、2、3、4、5、6、7或8)和不同的溴化物(或碘化物)，根据实施例3中列出的操作制备以下化合物IS007、IS008、IS009、ISOIO、IS013、IS017、IS042、IS044、IS047、IS521、IS523、IS526、IS528、IS527、IS529、IS532和IS098。实施例4OHO在氮气下，向8-羟基-7-曱氧基-2-曱基-l(2H)-异喹诺酮(产物6，63mg，0.31mmol)在5mL二氯曱烷种的溶液中添加三溴化硼(在二氯甲烷中，实施例3IS005l.OM，3.1mL)。反应在室温下搅动4小时，然后用曱醇淬灭。减压下除去溶剂，添加曱醇。添加曱醇随后除去曱醇的这个操作重复三次，以除去硼残余物。通过在硅胶上的柱层析纯化提供了产物(48.7mg,83%)。'HNMR(400MHz，CD3OD)57.17(1H,d，J=8.2Hz)，7.01(1H，d，J=7.4Hz)，6.89(1H,d，J=8.2Hz),6.51(1H，d，J=7.4Hz)，3.51(3H,s)。实施例5o步骤l使用产物3(实施例2，步骤4，600mg,2.92mmol)和l-氯-2-碘丙烷(0.63mL，5.84mmol)根据实施例3中列出的操作，制备7-(3-碘代丙氧基)-6-曱氧基-2-曱基-l(2H)-异喹诺酮(830mg，2.95mmol,100%)。ESI-MS282.18(M+1)步骤2向步骤l的产物(830mg,2.95mmol)在29mL曱基乙基酮种的溶液中添加石典化钠(4.41g,29.5mmo1)。反应在回流下加热30小时。减压下除去溶剂，添加水。产生的混合物用二氯曱烷(x3)萃取，干燥、过滤并浓缩。通过在硅胶上的柱层析纯化提供了产物(1.01g，92%)。ESI-MS374.09(M+1)。实施例6步骤l将StratospherePL-REM树脂(50-100目)均匀分布到96IRORImicrokan反应器中。每个microkan反应器含有无线复频标签和28-35mg树脂。将96个microkan反应器分到四个烧瓶中。向每个烧瓶添加40mL干燥的DMF和一种不同的胺(12.7mmoL)。密封烧瓶，microkan反应器在室温下搅动48h。在除去DMF之后，microkan反应器用DMF(x3)、二氯曱烷(x3)和甲醇(x3)洗涤并在真空下干燥过夜。步骤2将96个microkan反应器分到四个不同的烧瓶中。向每个烧瓶中添加40mLDMF、lmL二异丙基乙胺和一个异喹诺酮结构单元(如方案4中所示制备的)。密封烧瓶，在55。C下搅动48h。停止反应之后，microkan反应器用DMF(x3)、二氯曱烷(x3)和曱醇(x3)洗涤并在真空下干燥过夜。步骤3将96个microkan反应器分到6个不同的烧瓶中。向每个烧瓶中添加20mLDMF。将六种不同的活性囟化物分别添加到六个不同的烧瓶中。烧瓶在室温下摇动24h之后，停止反应。然后，microkan反应器用DMF(x3)、二氯曱烷(x3)和曱醇(x3),二氯曱烷(x3)洗涤并在真空下干燥过夜。步骤4将得到的96个microkan反应器放入96试管阵列中。向每个试管中添加2.1mL的混合物，所述混合物是IOmL二异丙基乙胺在200mL二氯曱烷中形成的。在室温下摇动96试管阵列48h，过滤到另一个96试管阵列中。在蒸发溶剂之后，剩余的残余物一个接一个地通过短的硅胶柱纯化，以获得最终产物。通过这种4步反应从4种胺、4种异喹诺酮结构单元和6种囟化物可以获得96种异唾诺酮衍生物的库。根据上文公开的方案和实施例，可以获得具有附着于异喹诺酮主干上的一个或多个位置的各种取代基的异会诺酮衍生物。通过改变起始苯曱酸的取代，可以制备具有不同取代型式的异喹诺酮主干。还可以从异喹诺酮结构单元、不同的胺和卣化物通过利用IRORI技术的固相组合化学作用构建适合的库。然后筛选这些异喹诺酮衍生物，鉴定具有比专利化合物更大特异性和效力的化合物。以下公开了某些筛选分析方法。II.测定褪黑素激动剂活性的方法一般地，在评估本发明的化合物的褪黑素活性时进行两种分析功能分析1.FLIPRCa2+动员分析这项分析通过测量活化的受体的下游事件(在这种情况下为细胞内钩动员)，表明了新的化合物活化MTi和MT2受体的能力。如在表l中指出的，EC50是在nM-nM范围内。作为2-IMT反应(已知的褪黑素激动剂)的百分比的反应也被包括用于比较。2.cAMP分析cAMP分析表明新的化合物活化褪黑素受体的能力。当被活性的激动剂结合时，褪黑素受体启动事件的级联，其引起对细胞中cAMP生成的抑制。表达MTl或MT2受体的细胞用单独的forskolin(—种刺激cAMP产生的物质)处理或用具有新的异喹诺酮化合物的forskolin处理。表1中显示的产生的抑制作用百分比是褪黑素受体活化作用的量度。3.CRE-Luc分析荧光素酶报告基因分析提供了测量褪黑素受体活化作用的另一种途径。表达cAMP应答元件驱动的荧光素酶报告基因(293-pCREluc)以及MT1或MT2受体之一的细胞用单独的forskolin(刺激cAMP产生以及随后的荧光素酶基因表达的一种物质)或用具有新的异会诺酮化合物的forskolin处理。由于褪黑素受体活化作用抑制了cAMP产生，荧光素酶表达方面的任何抑制导致酶活性的降低和产生的萤光信号数量的降低。表l中的数据表明，对于大多数新的异会诺酮化合物，抑制作用是约60-80%。二级分析1.结合分析进行竟争性配体结合分析来检查新的异喹诺酮化合物的受体结合特性。该分析测量了新的异喹诺酮化合物结合并替换放射标记的内源配体[3司褪黑素的能力。添加提高浓度的新化合物来替换与MT1或MT2受体表达细胞结合的卩H]褪黑素。只要新的化合物结合受体的相同区域，观察到的结合放射活性将随着新化合物浓度提高而降低。如表2中表明的，2-IMT(具有对两种亚型的相似效价的已知激动剂)替换了结合的卩H]褪黑素的85-95。/。，IC5o<lnM。然而，异喹诺酮化合物都没有替换结合的褪黑素，表明受体结合处在另一个位点结合分析结果表明，新的化合物不能或仅最低限度地能够替换结合的卩H]褪黑素，尽管它们对MT,或M丁2受体有高活性。由于异喹诺酮非常不同于主要基于吲哚的已知的褪黑素配体结构，竟争性结合分析结果表明，异全诺酮的结合特性不同于。引咮。因此，不同于在受体上与内源配体褪黑素相同的结合口袋处与MT!或MT2受体的相互作用(正位位点)，它们可能在受体内不与褪黑素结合位点重叠的第二变构位点处结合，引起对卩H]褪黑素的不完全替换。变构位点在GPCR中不是罕见的(例如，它们在某些毒蕈碱亚型中存在)，但是早先的报道没有表明褪黑素受体中存在这样的位点。2.MTT分析这项分析根据长期处理下的细胞生存力评估了新的异喹诺酮化合物的细胞毒性效应。存活细胞而不是死细胞能够将底物转变为有色产物，其产生更高的光吸收。表2中的数据表示为对照细胞(没有用本发明处理的细胞)的百分比。低的百分比表明低的细胞生存力(或高的细胞毒性)。3.ERK磷酸化分析这项分析通过测量活化的受体的下游事件(在这种情况下为ERK磷酸化)，表明了新的化合物活化MTt或MT2受体的能力。在蛋白质印迹(westernblot)中检测和定量磷酸化的ERKl/2的数量。表2中的数据表示为相对于未刺激的对照细胞的刺激倍数。在下文中更详细地描述了一些方法1.利用荧光成像平板读取器(FLIPR)的细胞内Ca"动员分析在荧光成像平板读取器(FLIPR)上进行细胞内钙动员分析来筛选针对两种褪黑素受体亚型MT!和MT2的异喹诺酮化合物。为了以高产量方式促进筛选过程，采用了具有结合一系列GPCR并活化细胞内Ca"的能力的嵌合G蛋白。褪黑素受体亚型(MT,或MT2)在COS-7(猴肾脏成纤维细胞)细胞中与G蛋白嵌合体共同表达。在分析期间，细胞暴露于新的异喹诺酮化合物，测量焚光方面的相应改变。对每种异喹诺酮化合物进行单点和剂量依赖性分析，根据后者绘制剂量反应曲线，为每种受体亚型确定相应的ECso。特别地，COS-7细胞以20，000个细胞/反应孔的密度播种到设计用于FLIPR分析的96孔平板中，利用具有10%FCS的Opti-MEM,FCS用量为100ja1/反应孔。使用Lipofectamine⑧试剂进行转染。在每个反应孔中，0.2ng的GPCR和G蛋白cDNA用25jal的Opti-MEM稀释，0.2|il的Lipofectamine200(f用另外的25HlOpti-MEM稀释。在混合两种成分20分钟之后，将它们添加到合适的反应孔中。在转染后温育48小时之后，从每个反应孔中除去50pl的转染培养基，随后用100nl的2uMFluo-4、在具有20mMHEPES(N-[2-羟乙基]旅嗓N，-[2-乙烷磺酸];pH7.5)和2.5mM4-(二丙基氨磺酰基)苯曱酸(阴离子交换剂抑制物，新制备的)的含钙HBSS(Hank，s平衡盐溶液)中在37。C标记转染的细胞1小时。制备70jul的3x药物(本发明涵盖的异喹诺酮化合物)并等分到V-孔药物平板的相应反应孔中。荧光的改变用488nm的激发波长在FLIPR96中检测。通过改变FLIPR设备的激光功率和曝光时间(一般分别为0.4W和0.4秒)，将背景荧光调节到8，000到12，OOO单位的范围。将50nl的每种激动剂溶液添加到相应的反应孔中，监视荧光发射(510和560nm之间)3分钟。结果表示为荧光强度单位(FIU)的变化。通过测定每个数据集的FIU的最大变化来确定浓度-反应曲线。在GraphPadPrism版本3.03上进行统计数据和EC5G(半有效浓度)值的数值分析。2.CRE-荧光素酶分析进行荧光素酶分析(一种报告基因分析)，来确定本发明活化褪黑素受体的能力。在分析之前，HEK(人类胚肾)293细胞用cAMP应答性元件驱动的荧光素酶报告基因(293-pCREluc)和编码MT!或MT2受体的cDNA稳定地转染。细胞然后暴露于新的异喹诺酮化合物中，之后，添加底物萤光素，测量产生的萤光。在分析之前，于37。C下，在含有5%C02的湿润大气中，将人类胚肾(HEK)293细胞(CRL-1573，ATCC)保持在补充有10%胎儿牛血清(FBS)、100单位/mL青霉素和100yg/mL链霉素的最小必需培养基(MEM)中。建立用cAMP应答性元件驱动的荧光素酶报告基因(293-pCREluc)稳定转染的人类胚肾293细胞，并保持在补充有300ug/mlG418硫酸盐的生长培养基中。对于荧光素酶分析，稳定地表达pCRE-荧光素酶的HEK-293细胞以15,000个细胞/反应孔的密度播种到96孔平板中。用均为0.2iul的Plus和lipofectamine试剂，利用Lipofectamine卩11^@试剂进行转染，每个反应孔有50ng的编码MTt或MT2受体的cDNA。在37。C下3小时的转染期之后，将具有20%胎牛血清(FCS)的50julDMEM添加到反应孔中，在24小时的血清饥饿之前将平板在37。C温育48h。将不同的新型异会诺酮化合物和IOiuMforskolin添加到合适的反应孔中30分钟，随后加入普通培养基保持另外6小时。通过用50)il荧光素酶裂解緩冲液替换反应孔中的培养基来收获细胞。在整个分析中Berthold微量培养板光度计维持在25。C。连接到空的试管的注射器M和连接到药物试管的注射器P被设置成将25yl的萤光素注射到合适的反应孔中。L6秒延迟时间、之后是1秒测量时间周期被分配给注射器M,而注射器P在荧光素酶底物导入反应孔中之后被测量10秒。结果表示为相对发光单位(RLU)。在指明时，激动剂诱导的活性被表示为用forskolin获得的RLU的百分比。3.卩H]环化AMP分析进行cAMP分析来测量在本发明存在的情况下在表达褪黑素受体(MT,或MT2)的细胞中第二信使cAMP的水平。当被活性的激动剂结合时，褪黑素受体启动事件的级联，其引起细胞中对cAMP的抑制作用。因而，与对照相比，暴露于本发明的化合物的细胞中cAMP水平的降低将表明褪黑素受体活化。可以使用稳定的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系。表达褪黑素MT2受体和G蛋白嵌合体16z25的稳定的转染子CH0-MTV16z25维持在补充有300lag/mlG418硫酸盐和200ng/mlZeocin⑧的生长培养基中。对于所述分析，将CHO-MT2/16z25细胞以2x105个/孔的细胞密度播种到12孔细胞培养平板中，并温育过夜。细胞在具有1%FBS的F12培养基中用卩H]腺噤呤(1juCi/ml)标记额外一天。标记的细胞用具有20mMHEPES、pH7.5的lmlF12培养基洗涤，用单独的10uMforskolin、或用在具有lmM3-异丁基-l-曱基黄嘌呤(磷酸二酯酶抑制物，新制备的)的相同培养基中合适浓度的测试化合物或IOjaM2-IMT处理30分钟。通过抽吸和向每个反应孔添加具有lmMATP的1ml冷却的5。/。三氯乙酸来停止反应。细胞在4。C裂解至少30分钟，通过连续的离子交换层析从其他的标记的腺苷酸核苷酸中分离卩H]cAMP级分。cAMP水平被解释为卩H]cAMP级分的每分钟计数(cpm)与总共标记的核苦酸级分的每分钟计数的比率。4.竟争性结合分析利用放射性配体结合分析测定化合物结合]VT^和/或MT2受体的能力。HEK-293细胞用编码G16z25以及MT,或MT2之一的cDNA转染。转染后48小时，在结合緩冲液(50mMTris-HCl、2mMMgCl2、1mMEDTA、pH7.4)中收获细胞。100,000个细胞在室温下与96孔平板(PerkinElmerLifeAndAnalyticalSciences,Inc.,Boston,MA)中总体积IOO|ul中的1nM[3H]褪黑素(比活性83Ci/mmol;GEHealthcare)和合适浓度(0.1nM到ljuM)的未标记的配体仪器温育2小时。通过在96孔GF/C过滤片上快速过滤通过96孔细胞收集器来终止反应。过滤片用500)LU冰冷的结合緩冲液洗涤，干燥，并密封在具有3.5ml的闪烁液体的聚乙烯袋中，在MicrobetaJet闪烁计数器中对氚计数。每个96孔平板包括一系列浓度的已知褪黑素受体激动剂2-碘褪黑素作为标准物。数据利用GraphPadPrism3.02通过非线性最小二乘回归法来分析。5.利用MTT分析的细胞毒性测试细胞以合适的密度播种到100ial生长培养基中的透明的96孔平板中，容许生长过夜。新的异喹诺酮化合物利用新鲜的生长培养基稀释到希望的浓度，这些稀释物用于替换每个反应孔中的生长培养基。在温育24-96h之后，将10jul的MTT标记试剂(Roche)添加到每个反应孔中，细胞在032孵化器中温育4h。然后将IOOial溶解緩冲液添加到每个反应孔中并温育过夜，以完全溶解紫色曱潜(formazan)晶体。最后，利用ELISA读取器测量570nm处样品的分光光度的吸光度。在每个实验中每种条件进行三次，结果表示为空白对照土标准差的％。6.ERK磷酸化的4企测一天前在12孔平板中播种至汇合的、表达任一褪黑素受体亚型的HEK29334细胞，用2-碘褪黑素(100nM)或选定的新的异喹诺酮衍生物(1uM)处理5分钟。通过在冰上抽吸来终止刺激，并通过200jul的lx蛋白凝胶加载緩冲液立即裂解。溶胞产物通过煮沸5分钟来变性，在室温下冷却直到加载。30in1的每种溶胞产物在12%SDS-PAGE上分离并通过电印迹转移到硝化纤维膜上。转移的成功通过丽春红S染色来显现。所有随后的温育在轻柔的搅动下进行(~100行程/分钟)。膜的不用的区域通过"Blotto"—一lxTris緩冲盐水(TBS)中的5%脱脂奶来封闭。针对磷酸化的或总的ERKl/2的初级抗血清在合适的稀释度(1:4000-1:2000)下在Blotto中与封闭的膜在4。C温育过夜。膜用新鲜的Blotto洗涤3次各15分钟，然后与lxTBS中l:1000稀释度的二级抗血清(辣根过氧化酶结合的抗兔IgG)在室温下温育lh。用过量的lxTBS快速地清洗膜3次，随后用lxTBS进行历时10分钟的4次洗涤。最后，制备基于鲁米诺(luminol)的化学发光底物溶液的预混合物(每8cm^莫，lmL),并覆盖在经洗涤的膜上温育l分钟。在移除过量的溶液之后，膜用赛纶外罩覆盖，在暗室中在X射线底片上产生具有合适曝光量的自动生成的照片。扫描图像，利用ImageJ1.34来定量条带强度。数据表示为载体处理的或未处理的样品的反应百分比。实验进行至少3次，给出平均反应土SEM。III本发明的异喹诺酮衍生物的褪黑素激动剂活性为了显示库中的异壹诺酮化合物的功能活性，将MT!和MT2受体的cDNA转染到各种细胞系中。然后如上所述利用荧光成像平板读取器(FLIPR)进行细胞内Ca"动员分析。参考式(III)，环的碳原子位置顺时针方向地计数，羰基的碳原子为Cl,因而R1、R2、R3和R4分别连接到C5、C6、C7和C8。两个主要的取代的异会诺酮系列，2，5,6-和2，6,7-取代的异喹诺酮主要显示显著的受体活化活性，而大多数的衍生物看起来是MT2特异性的。在位置5、6或7上取代的变化决定了受体亚型选择性和受体活化效力。2,5，6-和2,6,7-取代的异喹诺酮分别是指在位置C2、C5和C6处具有取代基的异喹诺酮，和在位置C2、C6和C7处具有取代基的异喹诺酮。参看表l，第一系列的化合物在C6位置处含有曱氧基，在C5位置上具有变化的取代基。5-千氧基基团取代产生了化合物IS005,其以nM级亲和力结合两种褪黑素受体(EC5():MT尸5.81nM;MT2=48.5nM)，但对MT,具有稍凝:更高的亲和力。然而，IS005看来是部分激动剂，因为与已知的褪黑素激动剂2-碘褪黑素(2-IMT)引发的反应相比，IS005对于MT,和MT2的活性分别是31%和63%。许多其他的取代基，例如苯基丙基氧基(IS008)、p-溴节氧基(IS009)和p-曱基千氧基(IS529),与5-节氧基取代相比，降低了亲和力和/或受体活化的效力，这表明烷基链的延长在褪黑素受体的配体结合口袋中不是良好耐受的。重要地，这些化合物仅活化MT2，表明5-取代的基团的适应性在两种受体亚型中是十分不同的。在C5位置，曱氧基对5-节氧基基团的苯环的单-或二-间位取代显著地提高了对MTz的亲和力(IS527:单-间，EC50=5.78nM;IS528:二-间，EC50=0.37nM)而不损害它们专有的受体亚型选择性。IS528和IS527都部分地活化MT2，与2-IMT相比具有~65%的效力。含有5-烯丙氧基取代的另一个高度MT2选择性的化合物IS007展现了对MT2的3.51nM的ECso。与对于IS528和IS527的发现结合起来，这表明了在5-取代基的末端的分散的7T电子结构促进了异喹诺酮化合物的MT2选择性。然后在C6和C7上进行类似的取代，用曱氧基取代任一个。与化合物ISOOl和IS002(分别在C6和C7处具有羟基)相比，在任一位置上的千氧基(C6:IS016和C7:IS003)或苯基丙氧基(C6:IS017和C7:IS013)取代没有显著地提高亲和力，ECso为lOOnM-lmM。尽管这些取代产生了完全MT2激动剂，具有与2-IMT类似的最大反应，然而它们显示了对ML的弱的或边缘的活性。在任一位置上的单-(C6:IS044和C7:IS521)和二-间-甲氧基千氧基(C6:IS042和C7:IS523)取代产生了具有高度MT2选择性的非常强力的完全激动剂。在这四种衍生物中，与C7取代基相比，C6取代基显示了对两种受体亚型的更高的总体亲和力(低l-2个数量级的ECso)。与C7取代基相比，MT!对C6取代基具有更好的耐受性，但是当C6取代基显示50。/。活化作用时，C7取代基具有非常低的效力(<30%)。在任一位置上的二-间-曱氧基苄氧基取代看起来具有对MT2的稍微更高的最大反应，其几乎与2-IMT—样好。反之，与二-间-曱氧基苄氧基取代基相比，在MT,中，单-间-曱氧基苯基氧基取代引发了高得多的反应。对C5、C6和C7取代基的多样性的进一步的扩展通过组合化学技术来进行。对每个位置产生约96种衍生物，然后对其进行褪黑素受体活化的单剂量筛选。然而，它们中仅少数显示了对两种受体亚型的弱活化。根据基于上述发现对配体选择性的理解，这不是令人惊讶结果，因为大多数这些化合物由于在3个关键位置上具有大体积的取代基因而是无活性的。在C4、C8和N2上具有取代基的衍生物主要展现对两种受体亚型的低亲和力和/或效力。总的说来，发现了在异喹诺酮支架的位置C5、C6或C7处的3-曱氧基节氧基或3,5-二曱氧基千氧基基团对于异喹诺酮衍生物展现强力的褪黑素激动剂活性是关键的。具有在C5位置处附着的这种取代基的化合物(IS527,IS528)提供了高效力和高MT2选择性。附图1-7显示了某些代表性的异喹诺酮化合物的剂量反应曲线和它们对于每种受体亚型的ECso:对于异喹诺酮化合物IS005，对MTi和MT2的ECso估计值分别是5.81xl(T9nM和4.85xl(T8nM;对于IS030，对MTi和MT2的EC5o估计值分别是1.04xIO-6nM和3.01xl(T6nM;对于IS007,对MT2的EC5o估计值是3.51xl(T9nM(MT!未测定);对于IS017，对MT2的EC5o估计值是1.08xio'7nM(MT,未测定)；对于IS044，对MT,和MT2的ECso估计值分别是1.20xl(T8nM和3.79xl(r1GnM;对于IS521，对MT!和MT2的EC5。估计值分别是1.86xl(y6nM和1.14xl(T8nM;对于IS528，对MT,和MT2的EC5Q估计值分别是7.14xl(V6nM和3.69xl(T1()nM。表l-3呈现了更多的测试数据，表现了本发明的示例性化合物的褪黑素活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表3:证实新的异全诺酮化合物的褪黑素活性的二级分析<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>:a;IV制造药物组合物和它们在治疗褪黑素受体相关失调方面的用途一旦鉴定了有效的化合物，通过从天然来源例如植物分离所述化合物或通过化学合成，获得化合物的部分纯的或基本上纯的制品，可以利用现有的工艺或将来在产业中开发的工艺来从部分纯的或基本上纯的化合物制造各种药物组合物或制剂。从化合物制造药物制剂和剂型(包括但不限于，片剂、胶嚢、注射液、糖浆)的具体过程不是本发明的一部分，制药工业的普通技术人员能够将产业中建立的一种或多种工艺应用于本发明的实践。做为选择，本领域的普通技术人员可以改进现有的常规工艺来更好地适合本发明的化合物。例如，在美国专利局官方网站上提供的专利或专利申请数据库含有涉及从有效的化合物制造药物制剂和产品的丰富资源。虽然在应用于本发明的优选的实施方式时描述和指出了本发明的基础性的新特征，要理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员可以对例举的实施方式的形式和细节做出各种省略和替代和改变。本发明不受到上文描述的实施方式的限制，其仅仅作为实例，而可以以各种方式在专利权利要求所限定的保护范围之内变化。权利要求1.一种治疗、预防或改善哺乳动物中的病理状况的方法，其中所述病理状况与褪黑素受体相关，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的异喹诺酮衍生物的步骤。2.权利要求l的方法，其中所述异喹诺酮衍生物是式(I)的化合物或式(I)的化合物的功能衍生物R4OR1R7(I)其中R!-R7各自独立地是氢或取代基。3.权利要求2的方法，其中R,、R2、R3、R4和R7独立地是H、卣素、烷氧基、烷基或羟基，条件是R,、R2、R3和R7之一是X-(CH2)n-R8;Rs是烷基或芳烷基；R^是H或烷基；X是键、O、S、SO、S02、CO或NH;n=0-10;Rs是链烯基、取代的或未取代的芳基、NR9R!o或OR9;R9是H、取代的或未取代的芳基甲基，或链烯基；和Rn)是H或烷基。4.一种调节褪黑素受体的活性的方法，包括用足够数量的异喹诺酮衍生物与所述受体相互作用以调节所述受体的步骤。5.权利要求4的方法，其中所述异喹诺酮衍生物是式(I)的化合物或式(I)的化合物的功能衍生物R4OR1R7(I)其中R1-R7各自独立地是氢或取代基。6.权利要求5的方法，其中Ri、R2、R3、R4和R7独立地是H、卣素、烷氧基、烷基或羟基，条件是R。R2、R3和R之一是X-(CH2VR8;Rs是烷基或芳烷基；Re是H或烷基；X是键、O、S、SO、S02、CO或NH;n=0-10;Rs是链烯基、取代的或未取代的芳基、NR9Rkj或OR9;R9是H、取代的或未取代的芳基曱基，或链烯基；和Rw是H或烷基。7.—种化合物，其是式(II)的化合物或是式(II)的化合物的功能衍生<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(II)其中RrR7各自独立地是氢或取代基。8.权利要求7的化合物，其中R!是X-(C恥-R8;R2、R3、R4、R7独立地是H、卣素、烷氧基、烷基或羟基；Rs是烷基或芳烷基；R6是H或烷基；X是键、O、S、SO、S02、CO或NH;n=l-10;Rs是链烯基、取代的芳基、未取代的芳基、或NR9Rk)、OR9;R9是H、取代的芳基甲基、未取代的芳基甲基、链烯基；Rio是H或坑基。9.权利要求7的化合物，其中RAX-(CH2)n-R8;R。R3、R4、R7独立地是H、卣素、烷氧基、烷基或羟基；Rs是烷基或芳烷基；Re是H或烷基；X是键、O、S、SO、S02、CO或NH;n斗10;Rs是链烯基、取代的芳基、未取代的芳基、或NR9Rk)、OR9;R9是H、取代的芳基曱基、未取代的芳基甲基、链烯基；Rm是H或烷基。10.权利要求7的化合物，其中R3是X-(CH2)n-R"R,、R2、R4、R7独立地是H、卣素、烷氧基、烷基或羟基；Rs是烷基或芳烷基；Re是H或烷基；X是键、O、S、SO、S02、CO或NH;n=l-10;Rs是链烯基、取代的芳基、未取代的芳基、或NR9Rk)、OR9;R9是H、取代的芳基曱基、未取代的芳基甲基、链烯基；R,o是H或烷基。11.权利要求7的化合物，其中R7是X-(CH2)n隱R8;R,、R2、R3、R4独立地是H、卣素、烷氧基、烷基或羟基；Rs是烷基或芳烷基；R6是H或烷基；X是键、O、S、SO、S02、CO或NH;n=l-10;Rs是链烯基、取代的芳基、未取代的芳基、或NR9Rw、0R9;R9是H、取代的芳基曱基、未取代的芳基曱基、链烯基；Rjo是H或烷基。12.权利要求7的化合物，其选自以下化合物7-曱氧基-6-(3-曱氧基-苄氧基)-2-曱基-2仏异喹啉-l-酮,<image>imageseeoriginaldocumentpage6</image>6-(3,5-二曱氧基-节氧基)-7-曱氧基-2-曱基-2//-异喹淋-1-酮，<image>imageseeoriginaldocumentpage6</image>6-曱氧基-7-(3-曱氧基-节氧基)-2-曱基-2//-异喹啉-1-酮,<image>imageseeoriginaldocumentpage6</image>7-(3，5-二曱氧基-苄氧基)-6-曱氧基-2-曱基-2//-异喹淋-1-酮，<image>imageseeoriginaldocumentpage6</image>5-烯丙氧基-6-曱氧基-2-曱基-2//-异*啉-1-酮O5_千氧基_6-曱氧基-2-曱基-27/-异喹啉-1-酮,o5陽(3.5-二曱氧基-苄氧基)-6-曱氧基-2-曱基-2//-异喹啉-1-酮,o6-曱氧基-5-(3-曱氧基-苄氧基)-2-曱基-277-异喹啉-l-酮，和6-曱氧基-5-{2-[(3-曱氧基-千基)-丙基-氨基]-乙氧基}-2-曱基-2//-异喹啉-1-酮。13.—种药物组合物，包含药学上可接受的载体和治疗有效量的活性成物。14.权利要求13的药物组合物，其中所述活性成分是权利要求8的化合物或权利要求8的化合物的功能衍生物。15.权利要求13的药物组合物，其中所述活性成分是权利要求9的化合物或权利要求9的化合物的功能衍生物。16.权利要求13的药物组合物，其中所述活性成分是权利要求10的化合物或权利要求10的化合物的功能衍生物。17.权利要求13的药物组合物，其中所述活性成分是权利要求ll的化合物或权利要求11的化合物的功能衍生物。18.权利要求13的药物组合物，其中所述活性成分是权利要求12的化合物或权利要求12的化合物的功能衍生物。19.权利要求4的方法，其中所述异喹诺酮衍生物通过以下方法来鉴定，所述方法包括步骤(a)在异喹诺酮主干上的位置进行取代来获得异喹诺酮衍生物和步骤(b)对所述异全诺酮衍生物进行分析来测定与褪黑素受体相关的任何效果或任何褪黑素激动剂活性。全文摘要一种治疗、预防或改善哺乳动物中与褪黑素受体相关的病理状况的方法，通过使用含有作为配体与褪黑素受体相互作用的式(I)的化合物的药物组合物，R₁、R₂、R₃、R₄和R₇独立地是H、卤素、烷氧基、烷基或羟基，条件是R₁、R₂、R₃和R₇之一是X-(CH₂)n-R₈；R₅是烷基或芳烷基；R₆是H或烷基；X是键、O、S、SO、SO₂、CO或NH；n＝0-10；R₈是链烯基、取代的或未取代的芳基、NR₉R₁₀或OR₉；R₉是H、取代的或未取代的芳基甲基，或链烯基；和R₁₀是H或烷基。文档编号C07D217/24GK101583601SQ200780050054公开日2009年11月18日申请日期2007年1月17日优先权日2007年1月17日发明者何细新,何觉中,大卫·查尔斯·纽,庞海泓,王殷厚,胡月青申请人:香港科技大学