专利名称：针对乙肝表面抗原的重组小鼠-人嵌合Fab的制作方法
针对乙肝表面抗原的重组小鼠-人嵌合Fab 发明领域
本发明涉及产生新的重组小鼠-人嵌合Fab抗体，其以高亲和性 结合乙肝表面抗原。
现有技术
(HBsAg)的主要抗原性'a，决定区。免疫优势'a，表位是HBsAg 的大抗原性区域的部分，称为主要亲水性区，并且该表位出现在所有 的血清型中。因此提倡将针对HBsAg的抗体用于在针刺意外损失的情 况下针对乙肝感染的被动免疫疗法，用于肝移植患者等等。现在，从 超免疫供体的血液收集得到的人抗HB免疫球蛋白(HB1G )用于暴露后 预防。该血液衍生产品不是在印度制备的。作为血液衍生产品，抗HB HB1G是昂贵的并能引起交叉感染。
文献中已经报道少数几种抗HBsAg小鼠单克隆。然而，这些小鼠
抗体不适于治疗性应用，因为它们可以产生免疫原性反应。文献中也 报道了几种重组抗HBsAg抗体片段。然而，其大多数是小鼠来源并不 可用于治疗性应用。
大量文献报道免疫原性反应主要指向鼠抗体的Fc区。也已经观 察到通过用人恒定区交换鼠恒定区产生小鼠-人嵌合抗体，能够降低抗 体的免疫原性。这样的小鼠-人嵌合分子对治疗性用途更安全，并且目 前几种此类嵌合分子在临床上用于不同的疾病。
文献中已经报道了 5种不同的重组抗HBsAg Fab抗体。它们都是 性质独特的，并且与本发明的重组分子不同。发明目的
本发明的目的是产生重组小鼠-人嵌合抗体片段，其针对乙肝表 面抗原。
另一个目的是开发重组小鼠-人嵌合Fab抗体，其以高亲和性和 特异性结合乙肝表面抗原。
还有另一个目的是显示其衍生来源的原始单克隆具有非常有助 于生物中和作用的结合特性。
另一个目的是生产重组小鼠-人嵌合Fab抗体，其与小鼠单克隆 相比具有更小的抗原性。
且另一个目的是生产重组小鼠-人嵌合Fab抗体，其更适于在体 内用于人。
另一个目的是产生小鼠-人嵌合抗体，其是更安全、更廉价的替 代物。
还有一个目的是开发重组分子，其具有/不具有任何修饰/与其他 分子组合而用于产生完整全长的抗体双特异性抗体、双功能抗体或含 有所述Fab的蛋白质分子的任何其他修饰。
且另一个目的是开发免疫缀合物，例如与酶、配体、受体、药物、 放射性同位素、毒素或任何其他大或小分子缀合用于体外或体内用途。
发明详述
在说明书开始时，应当理解随后的说明书只是示例il明本发明的 具体形式。然而，这样的具体形式只是示例性的实施方式并且不旨在 限制性地用于暗示对本发明的范围任何限制。
有许多已知的方法来产生重组嵌合抗体。然而，每种重组嵌合抗 体在性质上都是独特的，如果并且仅如果(a )通过氨基酸序列定义的 其分子结构是独特的(b )具有通过对靶抗原的特异性和亲和性定义的 独特的生物功能。本发明的重组分子是独特的，因为没有其他分子与 该分子的结构和特性相匹配。该新型的分子也可通过许多其他广为记 栽的策略来产生。
5其他重组分子可具有相同的功能，因为它们结合乙肝表面抗原，
本文中，发明人产生了由重组Fd和重组嵌合轻链组成的重组嵌 合Fab抗体，其以高亲和性结合乙肝表面抗原。只有Fab而不是单独 的轻链和重链能够结合乙肝表面抗原，并且从而可用于病毒中和作用。
本发明人已经使用来自小鼠单克隆(命名为5S )的抗体基因用于 产生针对乙肝表面抗原的重組抗体片段。该小鼠抗体结合乙肝表面抗 原的免疫优势'a，表位，并且发现其在替代体外测定法中具有保护性。 使用用于产生杂交瘤的现有方法产生该小鼠单克隆。然而，该小鼠单 克隆不能直接用在人受试者，因为其会触发人抗-小鼠抗原性应答。为 降低所述抗体的免疫原性，发明人已经产生了小鼠-人嵌合Fab，其保 留了对HBsAg的高亲和性。通过反转录(RT)和其后的聚合酶链式反 应(PCR)扩增抗HB小鼠单克隆5S的可变区基因(Vh和VJ。相似地， 使用人外周血淋巴细胞(PBL )作为抗体基因的来源扩增人k链的恒定 区(CJ和人IgGl重链的第一恒定区(CH1)。通过重叠PCR将小鼠 、和人G连接从而产生嵌合Fd。随后将两个嵌合抗体基因克隆入双顺 反子细菌表达载体(pC0MB3H， Scripps Research Institute, U Zola，USA)从而在大肠杆菌(XLl-blue)的周质中表达所述嵌合Fab。 在细菌周质中如此表达的嵌合Fab表现出对HBsAg的高结合，并且竟 争性ELISA证实其结合至与原始小鼠单克隆相同的表位。发现所述嵌 合抗体的表观解离常数与原始小鼠单克隆(4.575 nM)接近。如此方 式克隆并表达该嵌合抗HB Fab使得可通过将嵌合Fd与人Fc片段融合 将其进一步处理从而产生完整的嵌合抗体。因此，具有与人恒定区融 合的独特小鼠可变区的该嵌合Fab可以成为用于产生针对乙肝表面抗 原的具治疗性功能的全长重组抗体的起始材料。在性质上是嵌合的， 预期比小鼠抗体的免疫原性更低，并且由于是通过重组方式产生的， 其比现在使用的人多克隆抗体更安全、更廉价。发明步骤
1. 通过反转录(RT)和其后的聚合酶链式反应(PCR)扩增抗HB 小鼠单克隆5S的可变区基因(Vh和Vl)。从5S杂交瘤分离得到的RNA 用作这两种基因的来源。
2. 通过反转录(RT)和其后的聚合酶链式反应(PCR)扩增人K 链的恒定区(C)和人IgGl重链的第一恒定区(CH1)。从人外周血 淋巴细胞(PBL)分离得到的RNA用作这两种基因的来源。
3. 通过重叠PCR将小鼠W和人G连接从而产生嵌合轻链。相似 地，通过重叠PCR将小鼠VH和CHl连接从而产生嵌合Fd。
4. 将两个嵌合抗体基因克隆入双顺反子细菌表达栽体 (pC0MB3H， Scripps Research Institute, La Zoia， USA)从而在大
肠杆菌(XLl-blue)的周质中表达所述嵌合Fab。
5. 在合适的培养基中培养重组克隆，并通过常规方法制备细胞提 取物。
6. 通过使用蛋白质G的亲和层析，纯化所述重组嵌合抗体。 通过将抗HBsAg小鼠抗体5S的可变区基因(Vh和VJ和人的恒
定区基因(人IgGl的CJ区和人K链的G区)融合而产生该重组分子。 本发明的全部方案显示在
图1中。
所述重组构建体的克隆和产生
用于产生所述嵌合Fab的策略显示在图2中。通过反转录和其后 的PCR扩增5S杂交瘤的可变区基因。用于所有反转录和PCR的引物列 于表1中。使用标准方案从5S细胞分离总RNA,并通过反转录产生VH 和、片段的cDNA。对于VH和VL，用于反转录的引物分别是Fd3和K3。 使用引物5H23M和Fd3，通过PCR进一步扩增VH片段。相似地，使用 引物5L35和K3，通过PCR进一步扩增W片段。用于这两个PCR的条 件是94。Cl分钟、60。C1分钟、72。C2分钟，共30个循环，其后在 72。C最终延伸IO分钟。对于扩增人恒定结构域，从人外周血淋巴细胞 (PBL)分离RNA。通过反转录产生人IgGl的CJ区和人K链的Cl区的cDNA。对于CJ和CL，用于反转录的引物分别是CGlZ和Ckld。使 用引物Fd5和CG1Z，通过PCR进一步扩增CH1片段。使用引物K5和 CKld,通过PCR扩增人C" Fd5和K5携带与5S的可变区的3，末端互 补的突出部分。用于这两个PCR的条件是94'C1分钟、6(TC1分钟、 72'C2分钟，共3G个循环，其后在72。C最终延伸IO分钟。
在1. 5%琼脂糖凝胶中解析PCR扩增片.段，并使用标准方案洗脱各 个条带。将PCR扩增的CH1 (人IgGl)和小鼠Vh用作模板，通过重叠 PCR来产生嵌合Fd。通过PCR进行等摩尔量的小鼠Vh和人Ch1的起始 组装(intitial assembly) , PCR条件为94。Cl分钟、6(TC1分钟、 72。C2分钟，共20个循环，其后在72。C最终延伸1Q分钟。将起始组 装反应的产物稀释10倍，并用作贯穿使用引物5H23M和CG1Z的PCR 的模板。相似地，连接人K Cl和小鼠Vl片段从而产生嵌合轻链。用 于此反应的引物是5L35和CKld。
用Xhol和Spel消化所述嵌合Fd,并将其克隆到噬菌粒载体 pC0MB3H中。通过标准化学方法(CaClJ热激活)将所得的构建体
(pC0MB3H-Fd )转化到化学感受态大肠杆菌XL1-Blue细胞中。将转化 的细胞培养在氨苄青霉素-琼脂平板上。过夜温育后挑选克隆，并通过 菌落PCR和限制性消化(Xhol/Spel )筛选插入部分的存在。通过碱裂 解法分离重组噬菌粒pC0MB3H-Fd,并用Sacl和Xbal消化。将用这两 种酶消化的嵌合轻链克隆入pC0MB3H-Fd以产生噬菌粒构建体 pC0MB3H-Fd-L。通过标准化学转化方法将此构建体转化入化学感受态 XL1-Blue细胞，并在过夜温育后通过菌落PCR和限制性消化
(Sacl/Xbal)就所述嵌合轻链的存在检查重组克隆。
所述重组嵌合Fab的表达
为了所述嵌合Fab的可溶性表达，通过用spel和Nhel的双消化 将噬菌体gIII序列从重组噬菌粒构建体pC0MB3H-Fd-L中去除。双消 化的噬菌粒自连从而产生构建体pC0MB3H-Fd-L-So1,并将其转化入化 学感受态XL1-Blue细胞。为了重组嵌合Fab的可溶性表达，将1L含
8有20mmol/L的MgCl2和氨节青霉素(100 pg/ml )的超级肉汤(Super Broth)与10 ml过夜培养的所述重组克隆温育，并在37。C下培养至 A,达到大约0.6，此时通过l mmol/L的IPTG诱导所述嵌合Fab的过 表达。在30。C下过夜生长后，通过4000 g离心收获细胞。将细胞沉 淀团重悬在20 ml的PBS/1 mmol/L的EDTA中，并在冰上力文置40分钟。 通过10000 g离心重悬的产物而得到澄清的周质提取物。
所述重组嵌合Fab的纯化
通过使用蛋白质G HP柱的亲和层析，从周质提取物中纯化所述 重组嵌合Fab。简言之，用双蒸水(5个柱体积)彻底洗涤蛋白质G 柱(1 mi )，然后用5个柱体积的平衡緩冲液(pH7. 0)平衡该柱。使 用注射器以2 ml/分钟的速度使周质提取物通过该柱。用IO个柱体积 的平衡緩冲液彻底洗涤该柱，并用5个体积的洗脱緩冲液(pH2. 7 )洗 脱所结合的嵌合Fab。立即用中和緩沖液(77nl/ml， pH9 )中和洗脱 的级分。在SDA-PAGE检查所述洗脱的级分。
所述重组嵌合Fab的测定
分别在还原和非还原条件下，通过12%的SDS-PAGE解析所述纯化 的嵌合Fab。通过银染对所解析的蛋白质染色。如图3所示，所述嵌 合Fab表达为嵌合Fd和轻链的异二聚体(~50kD)。在还原条件下， 两种链以单体形式(~25KD)被检测到。
通过在非还原条件下的Western印迹(图4,泳道NR )进一步证 实所述异二聚体嵌合Fab的表达。在还原条件下，检测到对应于单体 Fd和/轻链的条带(图4，泳道R )。
通过固相ELISA检测所述嵌合Fab的结合，并且其结果显示在图 5中。如图5所示，抗体的结合随所述嵌合Fab的量的增加而增加， 达到对于抗原-抗体反应来说所预期的饱和水平。所述嵌合Fab的核芬酸序列
抗体Fab片段由两个多肽链Fd和L组成。所述抗-HBsAg小鼠-人嵌合Fd链的核芬酸序列
1 gtccagcttc tcgagcccgg ggctgagctg gcgacgcctg gggcctcatt gaagatgtcc
61 tgc肪ggctt ctggctactc atttagcacc tacaacattc actgggtaaa gcagacacct121 ggacggggcc tggaatggat tggaaptatt tatccaggaa ttggtgatac ctcctacaat181 cagaagttca aaggcaaggc cacattgact gcagacaaat cctccagcac agcctatttg241 cacctcaaca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aagtgacatc301 tactatggta actacaatgc tttggactac tggggtcaag gaacctcagt cactgtctct361 tcagcctcca cc幼gggccc atcgg認c cccctggcac cctcctcc肌gagcacctct421 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg481 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc541 tcaggactct actccctcag cagegtggtg accgtgccct ccagcagctt gggiacccag601 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag661 cccaaa城gtgacaaaac tagtacatgc
所述抗-HBsAg嵌合轻链的核苷酸序列1 agatgtgagc tcgtgatgac ccagactcca ctctccctgc ctgtcagtct tggagatcaa
61 gcctccatct cttgcagagc tagtcagagc attgtccaca gttatggaga cacctatttg
121 gaatggcac6 tgcaga謠c鄉ccagtct ccaaagctcc tgatctacaa agtttccaac
181 cgattttctg gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat cagggacaga at"acactc
241 aagatcagca gagtggaggc tgaggatctg ggagtttatt tctgctttca acgttcatat
301 gttccgtgga cgttcggtgg aggcaccaag ctggaactca aacggactgt ggctgcacca
3j61 tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactge ctctgttgtg
421 tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc
481 ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac
10541昭cctcagC3 gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacac肌agtctacgcc601 tgcgaagtca cccatcaggg cctgagttcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag661 tgt
所述嵌合Fab的氨基酸序列
抗体Fab片段由两个多肽链Fd和L组成。所述抗-HBsAg小鼠-人嵌合Fd链的氨基酸序列
LGT
QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTSTC
所述抗-HBsAg嵌合轻链的氨基酸序列:
VYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
通过两个多肽片段(嵌合Fd和嵌合轻链)在两个片段羧基末端上的精确共价键形成所述Fab。这是凭借在每个链的羧基末端上存在的氨基酸半胱氨酸上的SH基团。这两个SH基团在适当的氧化还原环境下缩合形成二硫键(S-S)，从而产生功能性Fab。表l:用于产生嵌合Fd和轻链的寡核普酸引物
引物
序列
用于VH的5'引物(5H23M) 用于Vh的3，引物(Fd3)
用于人IgGl的CH1的5， (Fd5)
引物
用于人IgGl的CH1的3，引物 (CG1Z) 用于l的5，引物(5L35)
用于W的3'引物(K3)
用于人K链CL的5，引物(K5)
用于人K链Ct的3，引物(Ckld)
5，- AG GTC CAG CTT CTC GAG CCC GGG GC-3'
5，-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA AGA GAC AGT GAC TGAGGTTCC-3'
5'-GGA ACC TCA GTC ACT GTC TCT TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCATCG-3'
5，-GCA TGT ACT AGT TTT GTC
ACA AGA TTT GGG-3,
5，-CCA GAT GTG AGC JCG TGA
TGA CCC AGA CTC CA-3'
5，-CAG ATG GTG CAG CCA CAG
TCC GTT TGA GTT CCA GCT TGG-
3，
5，-CCA AGC TGG AAC TCA AAC GGA CTG TGG CTG CAC CAT CTG-3，
5，-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCG AAC TCA G-3，
Fab或抗原结合片段是轻链和重链的前2个结构域以非常精确的 方式的组合。这些轻链和重链各自以一种方式折叠，所述方式与它们 彼此组合时折叠的方式非常不同，因此不具有所需的生物学特性。轻 链和重链必须以支持其有活性的及折叠后的并稳定这些性质的方式共 价连接。这是通过两个分子的羧基末端附近的氨基酸半胱氨酸上存在 的SH基团。在每条链上有许多半胱氨酸，其中大部分形成链内二硫键。 然而，只有一个链间二硫键。这只能通过2个相关半胱氨酸的精确排 列而形成，否则该分子将错误折叠并且不具有功能同时自身具抗原性。
为了制备所述Fab分子，本发明人在本文中釆用了重组方法，其 中将各片段克隆入为本发明目的特别设计的载体。已经在宿主细菌(大 肠杆菌)中表达这些片段。该特定的大肠杆菌菌株具有的周质空间提 供了特别有利氧化还原电势的环境，这有助于片段的适当相互作用、它们的功能上有活性的排列以及形成链间二硫键以产生完整的、功能
性的Fab片段。
应当注意本发明的设计容易被本领域技术人员修饰、改编和更 改。这些变体设计旨在通过以下权利要求进一步阐明的本发明的范围 内
权利要求
1.重组嵌合Fab抗体，其包含重组Fd和以高亲和性结合乙肝表面抗原的重组嵌合轻链，该抗体通过融合抗-HBsAg小鼠抗体5S的可变区基因(VH和VL)和人恒定区基因，人IgG1的CH1区以及人κ链的CL区而产生，其中通过重叠PCR连接小鼠VL和人CL以产生嵌合轻链，并通过重叠PCR连接小鼠VH和CH1以产生嵌合Fd。
2. 如权利要求1中所述的重组嵌合Fab抗体，其中已经将各片 段克隆入特别设计的载体并在宿主细菌中表达，所述宿主细菌是特定 的大肠杆菌菌林，它具有的周质空间提供了特别有利的氧化还原电势 的环境，其中该氧化还原电势有助于片段的适当相互作用、它们的功 能上有活性的排列以及形成链间二硫鍵以产生完整的、功能性的Fab 片段。
3. 如权利要求1中所述的重组嵌合Fab抗体，其中只有所述Fab 能结合乙肝表面抗原，而单独的轻链和重链不能。
4. 如权利要求1中所述的重组嵌合Fab抗体，其中已经以如下方式对其克隆和表达，即能够通过融合所述嵌合Fd和人Fc片段对其进 一步操作从而产生完整的嵌合抗体。
5. 如权利要求1中所述的重组嵌合Fab抗体，其中其具有融合到 人恒定结构域的独特的小鼠可变区，其可以是用于产生针对乙肝表面 抗原的具有治疗性功能的全长重组抗体或用于开发任何其他类型的治 疗性分子的起始材料，其可以具有或不具有修饰、缀合等而发挥作用。
6. 如权利要求1中所述的重组嵌合Fab抗体，其中因为其嵌合性 质而具有比小鼠抗体低的免疫原性，并且由于是通过重组方式产生的而比现在使用的人多克隆抗体更安全、更廉价。
7.重组嵌合Fab抗体，其中其可自己单独使用或用作其他分子的 起始材料，具有或不具有合适的修饰或缀合，以用来开发检测乙肝表 面抗原的诊断试剂。
全文摘要
本发明涉及重组嵌合Fab抗体，其包含重组Fd和以高亲和性结合乙肝表面抗原的重组嵌合轻链，该抗体是通过融合抗HBsAg小鼠抗体5S的可变区基因(V<sub>H</sub>和V<sub>L</sub>)和人的恒定区基因，人IgGI的CH1区和人κ链的CL区而产生的，其中通过重叠PCR连接小鼠V<sub>L</sub>和人CL以产生嵌合轻链并通过PCR连接小鼠V<sub>H</sub>和人CH<sub>1</sub>以产生嵌合Fd。
文档编号C07K16/46GK101646692SQ200780050010
公开日2010年2月10日 申请日期2007年9月10日 优先权日2006年12月18日
发明者B·伯斯, N·克哈纳, S·K·阿查亚, S·辛哈 申请人:生物技术部;全印度医学科学院;遗传工程和生物技术国际中心