乙肝病毒核心抗原的ctl表位及其相关应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及乙肝病毒核心抗原的CTL表位及其相关应用。
【背景技术】
[0002] 全世界有超过4亿人感染乙型肝炎病毒，每年有1百万人死于感染综合症，包括肝 硬化、肝细胞癌或者其他并发症。现有技术大多采用中药或者西药治疗乙肝，虽然有一定疗 效，但是不能根治乙肝或其他并发症，尤其不能有效阻断因乙型肝炎病毒感染所造成的肝 脏纤维化和硬化、阻断乙肝病毒通过胎盘传染给胎儿、阻断乙肝病毒通过乳汁传染给母乳 喂养的新生儿。
[0003] 肽合成技术目前在国内外有一些机构都有开展，组织相容性复合体(MHC)I类限制 性细胞毒性T细胞(CTL)在控制胞内病原体和肿瘤细胞生长中起极为重要的作用。通过蛋白 质基本性质分析，疏水性分析，跨膜区预测，信号肽预测，亚细胞定位预测，抗原性位点预 测，可以对基因编码蛋白的性质作出初步判断和预测。尤其通过疏水性分析和跨膜区预测 可以预测基因是否为膜蛋白。将该212个氨基酸与NCBI数据库中的蛋白片段进行Blast，结 果显示100条肽与目标肽有同源性，其中16条同源性100%，84条为99%，而这100条肽均为 HBV的precore/core蛋白。利用CLC Protein Workbench软件对该212个氨基酸的分析，可以 得到该蛋白质片段的一般生物学特性。
[0004] 细胞免疫反应在免疫应答过程中起着关键的作用。当外源性抗原被抗原呈递细胞 捕获后，蛋白质抗原在内吞系统被降解成多肽片段，其中的免疫原性多肽即T细胞表位与 MHC I类分子结合，被转运至APC表面供T细胞受体识别，从而激发细胞免疫应答，发挥免疫 调节作用，对其氨基酸序列特征的了解将有助于亚单位疫苗分子的设计与研制以及增加对 免疫系统的更进一步理解。因此，对T细胞表位的预测以及在此基础上进行结构改造具有重 要的理论价值和实际意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种能有效治疗乙肝及其各种并发症，阻断阻断乙肝病毒通 过胎盘传染给胎儿、阻断乙肝病毒通过乳汁传染给母乳喂养的新生儿的，基于DC细胞的乙 肝病毒T表位肽。
[0006] 具体来说，所述T表位肽的氨基酸序列为:QLFHLZLIX(谷氨酰胺-亮氨酸-苯丙氨 酸-组氨酸-亮氨酸-Z-亮氨酸-异亮氨酸-X);其中，氨基酸X和Z为任意氨基酸。
[0007] 在本发明的一个实施方案中，所述氨基酸X选自精氨酸(R)，谷氨酸(E)，苯丙氨酸 (F)，丝氨酸(S)，色氨酸(W)，异亮氨酸(I)或酪氨酸(Y)。
[0008] 在本发明另一个实施方案中，所述氨基酸Z选自精氨酸（R)，谷氨酸(E)，亮氨酸 (L)，丝氨酸(S)，脯氨酸(P)，异亮氨酸(I)或半胱氨酸(C)。
[0009] 在本发明又一个实施方案中，所述T表位肽的氨基酸序列选自：QLFHLELIR， QLFHLEUY 或 QLFHLPUY 中的一种。
[0010]本发明的另一个目的是提供一种负载所述T表位肽的树突状细胞，其通过以下方 法进行制备：
[0011 ] 1)分离出外周血单核细胞，通过流式细胞仪收集CD14+细胞;在经过GM-CSF和a-4 处理后采用DC培养基进行培养，每隔3天半量更换培养基，使细胞变成明显的树突状；
[0012] 2)在培养10天后，向细胞培养基中添加终浓度为0.1mg/L的T表位肽，继续培养24h 后，收获活化的树突状细胞即得。
[0013] 本发明对已知的乙肝病毒表位肽进行了氨基酸替换或修饰，从而获得了一种免疫 原性较佳的乙肝病毒T表位肽。另外，通过DC细胞体外负载该表位肽，并将成熟的DC细胞输 注特定人群体内，特异性的产生针对乙肝病毒感染所带来的危害，尤其是针对慢性乙肝的 所产生的清除体内病毒和改善临床症状的作用;阻断因乙型肝炎病毒感染所造成的肝脏纤 维化和硬化;阻断乙肝病毒通过胎盘传染给胎儿;阻断乙肝病毒通过乳汁传染给母乳喂养 的新生儿。
【具体实施方式】
[0014] 下面将结进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要 求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所 附权利要求书记载的内容为准。
[0015] 在本发明中，所述的表位肽均可以通过标准Fmoc方案进行合成，经HPLC纯化后，其 纯度应大于98% ;当然也可以将表位肽的氨基酸序列交予专业的多肽合成公司进行合成。
[0016] 实施例1负载表位肽的树突状细胞的抗病毒活性研究
[0017] 负载表位肽的树突状细胞的制备：无菌条件下提取小鼠股骨骨髓细胞，放入 PRMI1640培养液(含10 %胎牛血清，0. lml青-链霉素）中吹打混匀，3h后取贴壁细胞加入IL-4(终浓度为500U/ml)和GM-CSF(终浓度为1000U/ml)，于37°C、5 %⑶2培养箱中培养。每3天 半量更换1次培养液，同时加入GM-CSF和IL-4，诱导树突状细胞的生成。培养10天后，加入终 浓度0. lmg/L表位肽与1 X 106个/L的树突状细胞共孵育，37°C，24h，收集所活化的树突状细 胞。
[0018] 取6~8周龄雌性HBV转基因 Babl/c小鼠，随机分为实验组、对照组和空白组，每组 10只，与小鼠尾部皮下注射免疫原，每只l〇〇yL，之后每间隔1周，以同样方法加强免疫1次， 共免疫3次。对照组以1 X 106个/L的未负载表位肽的树突状细胞作为免疫原，空白组以生理 盐水作为免疫原，实验组以负载不同表位肽的IX 1〇6个/L树突状细胞作为免疫原，实验组 中各组负载的表位肽的具体序列如下：
[0019]
L0020J 1 )ELISP0T法检测树突状细胞激发CTL分泌IFN- γ的能力
[0021] 末次免疫后1周，断颈处死小鼠，在无菌条件下取脾脏，，用100目筛网碾磨，收集细 胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞;采用ELISP0T检测试 剂盒进行检测，按照试剂盒说明书操作，具体结果如下：
[0022]
[0023]
[0024] 2)血清HBV DNA抑制率检测
[0025]
[0026] 实施例2负载表位肽的树突状细胞的抗病毒临床研究
[0027]临床收集200例患者，HBeAg阳性，并且给药前6个月没有进行过抗病毒或免疫调节 药物治疗。经检测其HBV-DNA2 1000copies/mL(ALT2 40IU，ALT〈40IU)。
[0028] 制备负载表位肽的树突状细胞:采用白细胞分离法分离出患者外周血单核细胞， CD14+细胞选择的纯度达到94%。在经过GM-CSF和IL-4处理后，细胞变成明显的树突状，在 培养第10天，大部分细胞表达辅刺激分子标记⑶86、CD40、⑶80和HLA-DR、MHC-I分子。随即 加入终浓度〇.lmg/L的表位肽(表位肽序列同实施例1)与1X10 6个/L的树突状细胞共孵育， 37°C，培养24h，收集所活化的树突状细胞。
[0029] 对上述患者静脉注射lml含有1 X 106个/L负载表位肽的树突状细胞的溶液，每周1 次，治疗48周，对结果进行统计，具体结果如下：
[0030] l)HBeAg阳性患者HBV DNA定量检测及转阴率
[0031]
[0032]
[0033] 在治疗48周后，给予负载组1表位肽序列树突状细胞的患者转阴率为17.3%;而给 予负载组4表位肽序列树突状细胞的患者转阴率为4.6%。
[0034] 2)治疗48周后，对患者血清ALT含量进行检测，具体结果如下：
[0035]
[0036] 本
【发明内容】
仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技 术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到 的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开 内容中具体记载一样。
【主权项】
1. 一种基于DC细胞的乙肝病毒T表位肽，所述T表位肽的氨基酸序列为:QLFHLZLIX (谷 氨酰胺-亮氨酸-苯丙氨酸-组氨酸-亮氨酸-Z-亮氨酸-异亮氨酸-X);其中，氨基酸X和Z为任 意氨基酸。2. 根据权利要求1所述的乙肝病毒T表位肽，其特征在于，所述氨基酸X选自精氨酸(R)， 谷氨酸(E)，苯丙氨酸(F)，丝氨酸(S)，色氨酸(W)，异亮氨酸(I)或酪氨酸(Y)。3. 根据权利要求1所述的乙肝病毒T表位肽，其特征在于，所述氨基酸Z选自精氨酸(R)， 谷氨酸(E)，亮氨酸(L)，丝氨酸(S)，脯氨酸(P)，异亮氨酸(I)或半胱氨酸(C)。4. 根据权利要求1所述的乙肝病毒T表位肽，其特征在于，所述T表位肽的氨基酸序列选 自：QLFHLELIR，QLFHLEUY 或 QLFHLPUY中的一种。5. -种负载权利要求1-4任一项所述T表位肽的树突状细胞，其通过以下方法进行制 备： 1) 分离出外周血单核细胞，通过流式细胞仪收集⑶14+细胞;在经过GM-CSF和IL-4处理 后采用DC培养基进行培养，每隔3天半量更换培养基，使细胞变成明显的树突状； 2) 在培养10天后，向细胞培养基中添加终浓度为O.lmg/L的T表位肽，继续培养24h后， 收获活化的树突状细胞即得。
【专利摘要】本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种能有效治疗乙肝及其各种并发症，阻断阻断乙肝病毒通过胎盘传染给胎儿、阻断乙肝病毒通过乳汁传染给母乳喂养的新生儿的，基于DC细胞的乙肝病毒T表位肽。所述T表位肽的氨基酸序列为：QLFHLZLIX(谷氨酰胺-亮氨酸-苯丙氨酸-组氨酸-亮氨酸-Z-亮氨酸-异亮氨酸-X)；其中，氨基酸X和Z为任意氨基酸。
【IPC分类】C07K14/02, C12N5/0784
【公开号】CN105622731
【申请号】CN201610186162
【发明人】阎平希, 罗进, 闫小君
【申请人】江苏安泰生物技术有限公司, 阎平希
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月29日