小片段gG抗原及其在检测伪狂犬病毒gG抗体中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物疫病检测领域，具体涉及一种用于检测伪狂犬病毒抗体的gG抗 原片段、试剂盒，以及检测伪狂犬病毒抗体的方法。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,伪狂犬病毒）属于痕疼病毒科，α痕疼病毒 亚科中的猪的I型疱疹病毒，它能引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒（除猪外）及脑脊 髓炎为主要症状的急性传染病。该病严重危害着全球养猪业，可引起妊娠母猪流产，产死 胎、木乃伊胎；初生仔猪多为急性致死经过，具有明显的神经症状，死亡率几乎100% ;成年 猪多为隐性感染。免疫接种是防治伪狂犬病的主要策略，目前应用比较多的是缺失伪狂犬 病毒复制必需基因的伪狂犬病毒弱毒疫苗。gG基因是伪狂犬病毒中的一个分泌性的非必 需的糖蛋白基因，标志疫苗是在TK基因缺失的基础上，将病毒的非必需糖蛋白基因进行缺 失，这样得到的突变株就不产生被缺失的糖蛋白，但又不影响病毒在细胞上的增殖与免疫 原性。将这种双基因缺失疫苗注射动物后，动物不能产生抗所缺失蛋白的抗体。
[0003] 伪狂犬病毒弱毒疫苗虽然能有效地阻止感染后临床症状的出现，但接种猪仍可能 被强毒感染，感染能形成潜伏和随后潜伏感染的病毒能被激活和引起散播，通过血清学方 法可以将感染野毒的血清学阳性猪与基因缺失疫苗注射猪区分开来，接种基因缺失疫苗的 猪，血清中不含有缺失蛋白的抗体，如果在猪血清中检测出了缺失蛋白的抗体，说明猪已经 被伪狂犬病毒的野毒感染。建立伪狂犬病毒的早期快速鉴别基因缺失弱毒疫苗毒和野毒感 染的抗体检测方法十分重要。
[0004] 伪狂犬病毒的抗体检测方法很多，包括乳胶凝集（LAT)、酶联免疫吸附试验 (ELISA)、聚合酶链反应（PCR)几种。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于检测伪狂犬病毒抗体的小片段gG抗原、试剂盒以 及检测伪狂犬病毒抗体的方法，所述方法可用于鉴别伪狂犬病毒野毒感染动物和gG缺失 疫苗免疫动物。
[0006] 本发明的一方面提供一种用于检测伪狂犬病毒抗体的小片段gG抗原，其氨基酸 序列如下：
[0007] YADYYDVHIFRSESDDEVVHGDAPEAPEGEEVTEEEAELTSSDLDNIEIEVVGSPAAPAEGPATEEGRG AEEDEELTSSDLDNIEIEVVGSPRPPASSPPPPPPRPHPRGRDHDHDHGHHRADDRGPQRHHRLPPEPT(SEQ ID N0:1)〇
[0008] 在一些实施方案中，所述小片段gG抗原是重组的。在进一步的实施方案中，所述 小片段gG抗原是由大肠杆菌表达的重组多肽。
[0009] 在一些实施方案中，所述小片段gG抗原除SEQ ID NO: 1所示的序列之外，还包含 hig tag〇
[0010] 本发明的另一方面提供上述小片段gG抗原的编码核酸序列。优选所述核酸序列 如下：
[0011] TACGCCGACTACTACGACGTGCACATCTTCCGCTCGGAGTCTGACGACGAGGTCGTCCACGGCGATGCC CCCGAGGCCCCCGAGGGCGAGGAGGTGACCGAGGAGGAGGCCGAGCTGACCTCCAGCGACCTCGACAACATCGAGAT CGAGGTCGTGGGCTCTCCCGCCGCTCCCGCCGAGGGCCCGGCGACGGAGGAGGGGCGCGGGGCCGAGGAGGACGAGG AGCTGACCTCCAGCGACCTCGACAACATCGAGATCGAGGTCGTGGGCTCGCCGCGGCCGCCCGCTTCTTCGCCGCCT CCACCACCCCCGCGCCCCCACCCGCGCGGCCGAGATCACGACCATGACCACGGTCACCACCGTGCGGACGACCGAGG ACCCCAGCGGCATCACCGACTGCCGCCGGAGCCGACC(SEQ ID N0:2)〇
[0012] 本发明的另一方面提供一种非诊断目的检测样品中伪狂犬病毒gG抗体的方法， 其特征在于，使用上述小片段gG抗原作为抗原，通过基于抗原抗体反应的抗体检测方法， 检测样品中伪狂犬病毒gG抗体。
[0013] 在优选的实施方案中，所述检测是定性检测，即检测样品中是否存在伪狂犬病毒 gG抗体。
[0014] 在另一个优选的实施方案中，所述检测是定量检测，即检测样品中伪狂犬病毒gG 抗体的水平。
[0015] 本发明的另一方面提供一种非诊断目的鉴别样品是伪狂犬病毒野毒感染动物样 品还是gG缺失疫苗免疫动物样品的方法，其特征在于，使用上述小片段gG抗原作为抗原， 通过基于抗原抗体反应的抗体检测方法，检测样品中伪狂犬病毒gG抗体，如果样品中存在 伪狂犬病毒gG抗体，则样品感染伪狂犬病毒野毒，如果样品中不存在伪狂犬病毒gG抗体， 则样品为gG缺失疫苗免疫样品。
[0016] 本发明的另一方面提供一种用于检测伪狂犬病毒抗体的试剂盒，其中包含上述小 片段gG抗原
[0017] 在进一步的实施方案中，该试剂盒中进一步包含基于抗原抗体反应的抗体检测方 法所需的一种或多种试剂。
[0018] 在优选的实施方案中，所述一种或多种试剂是间接ELISA方法所需的一种或多种 试剂，可以选自：96孔板、包被液、洗液、封闭液、样品稀释液、酶标二抗、显色剂、终止液、阳 性对照、阴性对照以及其它所需的试剂。
[0019] 其中，包被液可以是pH9. 6的0. 05M碳酸盐缓冲液，其中含Na2C03l. 59g/L， NaHC032. 93g/L)。
[0020] 其中，洗液可以含有 NaCl 8g/L、KCl 0· 2g/L、Na2HPO4L 42g/L，KH2PO4O. 27g/L、 0. 05% Tween-20, pH7. 2。
[0021] 其中，封闭液可以含有 NaCl 8g/L、KCl 0· 2g/L、Na2HPO4L 42g/L，KH2PO4O. 27g/L、 0· 05% Tween-20、BSA 50g/L〇
[0022] 其中，样品稀释液可以含有 NaCl 8g/L、KCl 0· 2g/L、Na2HPO4L 42g/L， KH2PO4O. 27g/L、0. 05% Tween-20, BSA lg/L，ρΗ7· 2〇
[0023] 其中，显色液A液可以含有醋酸钠27. 2g/L、柠檬酸27. 2g/L、30% H2O2O. 6ml/L，显 色液 B 液可以含有 EDTA-Na 0· 4g/L、柠檬酸 I. 9g/L、甘油 100ml/L、TMB 0· 4g/L。
[0024] 其中，终止液可以是每L蒸馏水中含108. 5ml浓硫酸，逐滴加入。
[0025] 所述阳性对照可以是感染伪狂犬病毒野毒的动物的阳性血清，所述阴性对照可以 是未感染伪狂犬病毒野毒，也未接种伪狂犬病毒疫苗的动物的血清。
[0026] 本发明的另一方面提供上述小片段gG抗原、编码上述小片段gG抗原的核酸序列 或上述试剂盒在非诊断目的检测样品中伪狂犬病毒gG抗体中的应用。
[0027] 本发明的另一方面提供上述小片段gG抗原、编码上述小片段gG抗原的核酸序列 或上述试剂盒在非诊断目的鉴别样品是伪狂犬病毒野毒感染动物样品还是gG缺失疫苗免 疫动物样品中的应用。
[0028] 本发明的另一方面提供上述小片段gG抗原、编码上述小片段gG抗原的核酸序列 或上述试剂盒在制备用于检测样品中伪狂犬病毒gG抗体的试剂中的应用。
[0029] 本发明的另一方面提供上述小片段gG抗原、编码上述小片段gG抗原的核酸序列 或上述试剂盒在制备用于鉴别样品是伪狂犬病毒野毒感染动物样品还是gG缺失疫苗免疫 动物样品的试剂中的应用。
[0030] 在优选的实施方案中，在上述方法和应用中，所述"检测样品中伪狂犬病毒gG抗 体"可以是使用上述小片段gG抗原作为抗原，通过基于抗原抗体反应的抗体检测方法，检测 样品中伪狂犬病毒gG抗体。
[0031 ] 在优选的实施方案中，在上述方法和应用中，所述"鉴别样品是伪狂犬病毒野毒感 染动物样品还是gG缺失疫苗免疫动物样品"可以是使用上述小片段gG抗原作为抗原，通过 基于抗原抗体反应的抗体检测方法，检测样品中伪狂犬病毒gG抗体，如果样品中存在伪狂 犬病毒gG抗体，则样品感染伪狂犬病毒野毒，如果样品中不存在伪狂犬病毒gG抗体，则样 品为gG缺失疫苗免疫样品。
[0032] 在进一步优选的实施方案中，所述基于抗原抗体反应的抗体检测方法包括以下步 骤：（1)将上述小片段gG抗原固定于基质上；（2)在适合于形成抗原抗体免疫复合物的条 件下，使固定有上述小片段gG抗原的基质与待测样品接触；（3)对形成的抗原抗体免疫复 合物进行检测。
[0033] 在进一步优选的实施方案中，所述基于抗原抗体反应的抗体检测方法是间接 ELISA方法、乳胶凝集试验或间接血凝试验。
[0034] 在特别优选的实施方案中，所述基于抗原抗体反应的抗体检测方法包括以下步 骤：（1)用纯化的上述小片段gG抗原包被固相支持物；（2)在适合于形成抗原抗体免疫复 合物的条件下，使固定有上述小片段gG抗原的固相支持物与待测样品温育；（3)清洗除去 未结合的抗体；(4)加入经标记的第二抗体，在适合于形成抗原抗体免疫复合物的条件下 温育；（5)清洗