一种锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量pcr的检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR的检测试剂盒，属于分子生物学领域。本发明的检测引物、探针和检测试剂盒，利用锁核酸的特点，设计含有锁核酸的特异性探针，该探针对DNA有强大的识别能力和强大的亲和力，从而能够很好的适用于对病毒含量低、病毒基因组GC含量高的猪伪狂犬病毒进行检测，提高了猪伪狂犬病毒野毒株检测的效率，检索漏检的概率降低，为猪伪狂犬病毒野毒株检测提供了一种新的检测方法和检测试剂。本发明的探针、引物和试剂盒，与现有的常规检测方法相比，具有特异性强、灵敏度高、操作方便等优点，特别适用于临床猪伪狂犬病毒野毒株的检测，也可用于科研及临床应用，且具有很好的商业应用价值。
【专利说明】
一种锁核酸増敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR的检测 试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种锁核酸(LNA)增敏的猪伪狂犬病毒野 毒株荧光定量PCR的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是在世界范围内导致猪群发生严重性 疾病并产生重大经济损失的病原之一。猪伪狂犬病毒是一种高度亲和神经性病毒，可引起 仔猪神经症状甚至死亡、严重的呼吸道疾病及母猪繁殖障碍，具有传播速度快、流行范围 广、死亡率高等特点。该病毒除感染猪外，还可感染牛、羊、狗、鼠等动物。
[0003] 猪伪狂犬病毒又名猪疱疹病毒I型，属于疱疹病毒甲亚科水痘疱疹病毒属。猪伪狂 犬病毒基因组为线状双链DNA结构，基因组全长约150kb，基因组GC含量高达74%，至少含有 70个基因，编码约100种蛋白质，成熟的病毒粒子约含有50种蛋白质。猪伪狂犬病毒基因组 编码16种囊膜蛋白，包含11种糖基蛋白（gB，gC，gD，gE，gH，gI，gK，gL，gM，gN，gG)还有其余4 个非糖基化的跨膜蛋白（UL20，UL43，US9，UL24)。其中gE基因是猪伪狂犬病毒的主要毒力相 关基因，也是猪伪狂犬病毒复制非必需的基因。缺失gE基因后，猪伪狂犬病毒毒力明显减 弱，但其抗原性不受影响，为基因缺失疫苗的研制及应用提供了可靠保障。我国普遍推广使 用的猪伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗，对预防和控制猪伪狂犬病起到了重要作用。但自从 2011年以来全国多个省份使用gE基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪产弱仔、死 胎、流产，仔猪神经症状及死亡等疑似伪狂犬病的临床症状并造成了严重的经济损失。发病 仔猪脑组织病毒分离鉴定结果显示为猪伪狂犬病毒，全基因组测序及分析结果显示，病毒 基因组序列已发生较多变异，包括碱基的插入、缺失及突变，且目前临床检测中面临伪狂犬 病发病率高但病原检出率低的困扰，给该病的防控增加了前所未有的难度。急需建立新的 灵敏度更高、特异性更强的野毒鉴定方法，应对病原不断变异带来的检测不确定性，及时、 准确淘汰野毒感染猪，有利于伪狂犬病净化。
[0004] 目前猪伪狂犬病毒野毒株的检测方法有针对gE基因的乳胶凝集、ELISA及胶体金 免疫层析等血清学方法;也有针对gE基因的常规PCR检测及定量PCR检测等方法。但这些方 法均存在一定的缺陷性，血清学方法虽然能有效区分野毒感染抗体和疫苗免疫抗体，但由 于病毒感染早期和潜伏感染期不产生抗体，因此无法做到早发现，而PCR检测方法仍然存在 灵敏度不够，检出率低的缺陷，对实际生产的指导意义不够。因此，建立一种灵敏度更高、准 确性更好的定量PCR诊断方法已迫在眉睫。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种锁核酸增敏的 猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR检测引物和探针。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR 的检测试剂盒。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008] -种锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR检测引物和探针，包括用于 检测的1组引物和1条LNA-Taqman探针；
[0009] 所述的1组引物为：
[0010]正向引物：5/-ccgaggacgagttcagcag-3'; (SEQ ID NO: 1)
[0011]反向引物：5'-ccattcgtcacttccggtt-3'; (SEQ ID N0:2)
[0012] 所述的LNA-Taqman探针由Y端带有的焚光物质，LNA-Taqman探针的序列和Y端带 有的淬灭物质组成；
[0013]所述的5'端带有的荧光物质优选为FAM;
[0014]所述的3'端带有的淬灭物质优选为BHQ1;
[0015] 所述的1条LNA-Taqman探针的序列如下：
[0016] LNA-TagMan荧光探针：5/-FAM-cgctccggctTCGacgtc-BHQl-3 /。（SEQIDN0:3) [0017]其中，引物用来检测猪伪狂犬病毒野毒株基因 gE;
[0018]其中，LNA-Taqman探针是用来检测猪伪狂犬病毒野毒株基因 gE的探针。
[0019] LNA-Taqman探针所示序列的探针中，第11位的碱基"T"、第12位的碱基"C"和第13 位的碱基"G"均为锁核酸。
[0020] 本发明的再一方面公开了一种锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR的 检测试剂盒，包括本发明的探针试剂、引物试剂和阳性对照样品。
[0021] 所述的阳性对照样品为包含所述猪伪狂犬病毒野毒株gE基因片段的质粒DNA。
[0022] 所述的锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR的检测试剂盒适用于各种 组织、细胞及血清中的猪伪狂犬病毒野毒株核酸的定量检测。
[0023]所述的锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR的检测试剂盒在猪伪狂犬 病毒野毒株的检测、猪伪狂犬病的诊断治疗方面的应用。
[0024] -种锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：
[0025] (1)荧光定量核酸扩增反应体系的配制：在反应管中加入正向引物、反向引物和 LNA-TagMan荧光探针、模板DNA、2XPremix Ex Tag PCR反应混合液，增加 ddH20至反应体系 为20yL，混合均匀；
[0026] (2)荧光定量核酸扩增:将所述步骤（1)得到的混合溶液置于荧光定量检测仪上进 行反应；
[0027] (3)反应结束后，将模板DNA的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到模板DNA中猪伪狂 犬病毒野毒株基因片段拷贝的浓度。
[0028]步骤(2)中所述的反应的条件为95 °C 10分钟；热循环为95 °C 15秒，60 °C 1分钟，40个 循环。
[0029]本发明猪伪狂犬病野毒的引物、探针和试剂盒是基于猪伪狂犬病毒野毒株gE基因 的特点而设计的，目前在猪伪狂犬病毒的检测中面临两大难题。第一、病毒早期和潜伏期感 染病毒含量低，第二、病毒基因组GC含量太高;而现有检测方法的检测灵敏度和检测效率不 高。本发明的检测方法以实时荧光PCR为基础，采用特殊结构的含有锁核酸的探针对猪伪狂 犬病毒野毒株gE基因进行检测，使得整个检测靶标片段可以大大的缩短，同时增加与靶标 序列的识别能力和亲和能力。需要说明的是，本发明的一个关键因素就是采用了特殊结构 的含有锁核酸的探针。
[0030] 本发明中的含有锁核酸的探针，又称为LNA探针。LNA(Locked Nucleic Acid)是一 种核酸类似物，它和普通核酸分子区别在于在其碱基碳环的2'氧原子和V碳原子位置有亚 甲基桥而成锁状结构，因此也称锁核酸。LNA锁核酸共有A，C，G，T，U，mC六种碱基，它们均可 以引入实时荧光TagMan探针。引入LNA碱基的TagMan探针既为LNA-TagMan探针，即LNA探针。 每引入一个LNA碱基可提高探针TM值3~8摄氏度，这样既可缩短探针的长度，又可大大增加 探针的灵敏度和稳定性，从而使检测信号增强、信噪比增大。本发明正是利用该特性，设计 了合适的特异性探针和引物。
[0031] 需要说明的是，在本发明的引物和探针的基础上，将引物或探针冻干制成粉剂或 者直接制成高浓度的溶液从而制成便于使用的试剂盒是容易做到的，比如本领域中，为了 使引物能够长期保存并便于运输经常会将其制成粉剂，在使用时加入灭菌蒸馏水或者实验 室常规使用的TE缓冲液即可。
[0032]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0033]本发明的猪伪狂犬病毒野毒株的检测引物、探针和检测试剂盒，利用锁核酸的特 点，设计含有锁核酸的特异性探针，该探针对DNA有强大的识别能力和强大的亲和力，从而 能够很好的适用于对病毒含量低、病毒基因组GC含量高的猪伪狂犬病毒进行检测，提高了 猪伪狂犬病毒野毒株检测的效率，检索漏检的概率降低，为猪伪狂犬病毒野毒株检测提供 了一种新的检测方法和检测试剂。本发明的探针、引物和试剂盒，与现有的常规检测方法相 比，具有特异性强、灵敏度高、操作方便等优点，特别适用于临床猪伪狂犬病毒野毒株的检 测，也可用于科研及临床应用，且具有很好的商业应用价值。
【附图说明】
[0034]图1是本发明实施例中常规的实时荧光PCR检测方法和本发明的检测方法的对比 结果图；其中，A为本发明的检测方法的检测结果，B为常规实时荧光PCR检测结果。
[0035]图2是本发明实施例中的引物和探针的特异性检测结果;其中，曲线1为PRV野毒株 阳性样品的扩增曲线；曲线2-6分别为猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪 伪狂犬病疫苗和阴性对照的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0036]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0037] 实施例1 [0038] -、试剂和仪器
[0039] 1、主要试剂
[0040] 2XPremix Ex Tag(Probe qPCR)可通过市售购买。本例所用的试剂为分析纯或生 化试剂，实验用水符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均无 DNA酶污染的容器分装。 [0041 ] 2.主要仪器
[0042]实时荧光PCR仪、离心机、微量移液器、冰箱、高压灭菌器、紫外分光光度计。
[0043]二、供试样品
[0044] 猪伪狂犬病毒野毒株标准品，在中国专利申请"申请号：201410217702.5、名称为 猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒"中公开。
[0045]三、样品制备
[0046] 1、提取待测样品的DNA模板，按TAKARA的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Ki t Ver. 4.0的说明书进行样品中DNA的提取。
[0047] 2、DNA浓度测定:使用Biodropsis的BD-2000超微量紫外分光光度计测定DNA浓度。 [0048]四、引物和探针设计
[0049] 针对Genbank公布的猪伪狂犬病毒gE基因序列设计特异性检测引物和探针，并且 通过引物合成公司合成引物和探针，其中，探针中根据检测要求设计若干锁核酸，引物、探 针及探针中的锁核酸具体情况如表1。同时，本例还合成了不含有锁核酸的如表1所示的探 针，即表1中所示的探针按照常规的方法合成，其中不含有锁核酸，以作为对比。
[0050] 表lgE基因检测引物和探针
[0051]
[0052] 注：其中"正"表示正向引物，"反"表示反向引物，"探针"即实时荧光PCR检测用的 探针，各探针序列中的大写字母表示该碱基为锁核酸。
[0053] 五、检测步骤
[0054] 1、荧光PCR反应体系
[0055] 实时荧光PCR反应体系见表2。
[0056] 表2实时荧光PCR反应体系
[0058] 2、荧光PCR反应参数
[0059] 置于LightCycler96(Roche)定量PCR仪上进行扩增，实时荧光PCR反应条件为:95 °C 10分钟;热循环为95 °C 15秒，60 °C 1分钟，40个循环；
[0060] 3、实时荧光PCR扩增
[0061] (1)样品设置
[0062] 每个样品设置三个平行的反应体系。检测过程中分别设立阳性对照和阴性对照。
[0063] 以上检测，均采用本例设计的引物和含有锁核酸的探针，以及本例的引物与不含 锁核酸的探针进行比对试验。
[0064] (2)特异性检测
[0065]分别采用本例设计的引物和探针，以阳性病料研磨液作为阳性对照，水作为阴性 对照，分别对猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)、猪痕病毒（Classical Swine fever Virus，CSFV)和猪伪狂犬病疫苗4种病毒的核酸样品进行检测。猪圆环病毒为阳性病料，猪 繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒均采购自市场上的商品化疫苗，其中猪 繁殖与呼吸综合征病毒为大华农JXA1-R疫苗，猪瘟病毒为广东永顺C-株细胞疫苗毒，猪伪 狂犬病毒为大华农Barhta-K61(伪兰威）疫苗。上述材料均在中国专利申请"申请号： 201410217702.5、名称为猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒"中 公开。
[0066] (3)灵敏度检测
[0067]分别取猪伪狂犬病毒野毒株DNA 10ng、l .0ng、100pg、10pg、lpg、0. lpg和 10fg，进 行灵敏度检测。
[0068] (4)临床样品检测
[0069]取疑似感染PRV的猪的脑、肺和脾等组织样品，从样品中提取DNA，按TAKARA的 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0的说明书进行样品中DNA的提取，进行 检测。
[0070] 六、检测结果
[0071] 1、含锁核酸和不含锁核酸的探针的检测结果对比
[0072] 本例设计的探针序列在合成时，分别合成了含有锁核酸和不含锁核酸的探针。然 后分别采用这两组探针对不同的样品进行检测。具体，采用含锁核酸和不含锁核酸的探针， 对猪伪狂犬病野毒基因组DNA中的gE基因进行检测，检测的体系和条件均相同。
[0073] 部分检测结果见表3,部分扩增图谱见图1。结果显示，含锁核酸的探针的Ct值最多 可提前近4个循环，即其灵敏度至少可提高10倍。
[0074] 表3两种TagMan探针Ct值的比对
[0076] 2、特异性检测
[0077] 采用本例的引物和含有锁核酸的探针，对供试样品进行检测，结果显示，只有阳性 对照有扩增，而其他病毒猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬疫苗 毒和阴性对照均没有扩增，即没有Ct值，在图谱上也没有峰值(图2)。
[0078] 可见，本例的检测方法以及检测引物和含锁核酸的探针具有较好的特异性，能够 特异扩增出靶标序列，而对其他不含靶标序列的样品没有非特异扩增。
[0079] 3、灵敏度检测
[0080] 样品DNA浓度为10f g时，LNA探针的阳性检出次数为4次(33 % )，而普通TagMan探针 的检测次数为0;样品DNA浓度为0.10pg时，LNA探针的阳性检出次数为12次(100 % )，而普通 TagMan探针的检测次数为0;样品DNA浓度为l.Opg时，LNA探针和普通TagMan探针的检测次 数均为12次（100%)。因此，LNA探针的最低检测浓度为O.lOpg，而普通TagMan探针的最低检 测浓度为l.Opg (表4)。
[0081] 以上灵敏度检测，采用含锁核酸和不含锁核酸的探针，对猪伪狂犬病毒野毒株基 因组DNA中的gE基因进行检测，检测的体系和条件均相同，检测重复12次。
[0082] 表4两种TagMan探针扩增阳性数比对
[0083]
[0084] 4、临床样品检测
[0085]分别采用含锁核酸和不含锁核酸的探针，对临床87份样品DNA进行检测，检测的体 系和条件均相同。
[0086]结果显示，不含锁核酸的探针共检测获得阳性临床样品47份，阳性率54.02%;含 锁核酸的探针检测获得阳性临床样品55份，阳性率达63.22%，含锁核酸的探针提高了临床 样品的检出率(表5)。
[0087] 表5两种TagMan探针临床样品检测结果
[0089] 从上面的实验表明，本发明猪伪狂犬病毒野毒株锁核酸探针荧光定量PCR检测试 剂盒，可以用于科研及临床应用，达到灵敏、快速准确地检测猪伪狂犬病毒野毒株。
[0090] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于： 包括用于检测的1组引物和1条LNA-Taqman探针； 所述的1组引物为： 反向引物：5' -ccattcgtcacttccggtt-3'; 所述的LNA-Taqman探针由5'端带有的荧光物质，LNA-Taqman探针的序列和3'端带有的 淬灭物质组成。2. 根据权利要求1所述的锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR检测引物和 探针，其特征在于:所述的5'端带有的荧光物质为FAM。3. 根据权利要求1所述的锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR检测引物和 探针，其特征在于:所述的3'端带有的淬灭物质为BHQl。4. 根据权利要求1所述的锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR检测引物和 探针，其特征在于:所述的1条LNA-Taqman探针的序列如下： LNA-TagMan探针：5' -FAM-cgctccggctTCGacgtc-BHQl-3'; LNA-Taqman探针所示序列的探针中，第11位的碱基"T"、第12位的碱基"C"和第13位的 碱基"G"均为锁核酸。5. -种锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR的检测试剂盒，其特征在于:包 括权利要求1~4任一项所述的引物和探针。6. 根据权利要求5所述的锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR的检测试剂 盒，其特征在于:还包括阳性对照样品。7. 根据权利要求6所述的锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR的检测试剂 盒，其特征在于:所述的阳性对照样品为包含所述猪伪狂犬病毒野毒株gE基因片段的质粒 DNA08. 权利要求5~7任一项所述的锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR的检测 试剂盒的应用，其特征在于:所述的锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR的检测 试剂盒适用于各种组织、细胞及血清中的猪伪狂犬病毒野毒株核酸的定量检测。9. 一种锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括如 下步骤： (1) 荧光定量核酸扩增反应体系的配制：在反应管中加入正向引物、反向引物和LNA-TagMan荧光探针、模板DNA、2 XPremix Ex Tag PCR反应混合液，增加 CldH2O至反应体系为20 yL，混合均匀； (2) 荧光定量核酸扩增:将所述步骤（1)得到的混合溶液置于荧光定量检测仪上进行反 应； (3) 反应结束后，将模板DNA的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到模板DNA中猪伪狂犬病 毒野毒株基因片段拷贝的浓度。10. 根据权利要求9所述的锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量PCR检测方法， 其特征在于:步骤(2)中所述的反应的条件为95°C 10分钟；热循环为95°C 15秒，60°C 1分钟， 40个循环。
【文档编号】C12N15/11GK105886663SQ201610272623
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】李艳, 李春玲, 蔡汝健, 蒋智勇
【申请人】广东省农业科学院动物卫生研究所