一种用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率逐年增长，已超过62. 6万/年， 居于恶性肿瘤的第5位；死亡接近60万/年，位居肿瘤相关死亡的第3位。PLC在我国高 发，目前，我国发病人数约占全球的55% ;在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌，位居第二。因此， 肝癌严重威胁我国人民健康和生命。肝脏是人体最大的实质性器官，承担人体的各类重要 代谢功能，因此，肝脏一旦出现恶性肿瘤将导致未及生命的严重后果。又由于肝脏具有丰富 的血流供应，与人体的重要结构如下腔静脉、门静脉、胆道系统等关系密切；肝脏恶性肿瘤 发病隐匿，侵袭性生长快速，其治疗甚为困难。因此，早期发现、早期诊断对肝癌的治疗及其 重要。大量的研究已经证实，在肝癌患者的早期，血清中有数种分子水平已经发生了明显的 变化，比如：AFP、AFP-L3、CK19、SCCA、DCP、GP73等明显上升。因此，通过对血清中这些分子 水平的定量检查可以作为肝癌预测的一个有效手段。
[0003] AFP是目前诊断原发性肝癌最重要的肿瘤标记物，已被广泛用于肝癌的普查、诊 断、判断治疗效果和预测复发中，但AFP的敏感性和特异性较差，据文献报道，阳性率仅为 60-70%，并存在假阳性。
[0004] AFP-L3为AFP的异质体。有研究认为，AFP-L3比AFP具有更高的特异性，其敏感 性和特异性分别为36至96%和89至94%。研究表明，AFP-L3与肝功能不佳，肿瘤低分化 程度及生物学恶性行为相关。
[0005] 细胞角蛋白19(CK19)表达于胆管上皮，肝脏干细胞，是胆管上皮标志物。CK19在 恶性上皮细胞中，激活的蛋白酶加速了细胞角蛋白的降解，使得大量细胞角蛋白片段释放 入血，可作为肿瘤鉴别诊断的参考指标，并能提未肿瘤的分化程度。
[0006] 鳞状细胞癌抗原（SCCA)鳞状细胞癌抗原（SCCA)是从宫颈鳞状上皮细胞癌组织提 取的肿瘤相关抗原TA-4,正常人血清含量极微< 2. 5 μ g/L。SCCA是鳞癌的肿瘤标志物，适 用于宫颈癌、肺鳞癌、食管癌、头颈部癌，膀胱癌的辅助诊断，治疗观察和复发监测。
[0007] 异常凝血酶原（DCP)是产生于肿瘤细胞的不正常的凝血酶原，与正常凝血酶原相 比，DCP的分子结构特点是其Gla domain结构域中的一个或多个Glu残基（Glu residus) 没有被完全羧化（Y-carboxylated)成为Gla,从而失去凝血功能。大约50至60%的HCC 患者DCP水平升高。由于肝病本身可以引起AFP水平的增高，但不能导致DCP水平的增高， 所以DCP诊断HCC比AFP更特异。
[0008] 高尔基蛋白73 (GP73)是存在于高尔基体的一种跨膜蛋白。研究表明，在正常的人 体肝组织中，GP73主要由胆管上皮细胞表达，而肝细胞表达很少甚至不表达。肝细胞受到 病毒感染后可引起GP73的表达上调，在肝癌患者血清中GP73水平显著升高。GP73诊断肝 癌的敏感性为69%，特异性为75%。
[0009] 血管内皮生长因子（VEGF)，可在体内诱导血管新生（induce angiogenesis in vivo)。VEGF对单核细胞和造骨细胞也是化学趋化因子。在体内，VEGF能诱导血管生成和 增加血管渗透性。基于这些体外与体内的活性，VEGF被认为在伤口愈合、胚胎发育、固体瘤 的生长与转移等过程有重要作用。
[0010] ct -L岩藻糖苷酶（AFU)是一种溶酶体酸性水解酶，在HCC患者中其血清活性较肝 硬化，慢性肝炎等良性肝病及健康对照组均有明显升高，诊断HCC的敏感性为75-90%，且 与肿瘤大小无关，对直径小于2cm HCC的敏感性高于AFP，特异性为79-90%。
[0011] 肝癌的早期的发现率低，主要与早期肝癌的症状不明显以及目前市场上缺乏有效 的检测手段有关。目前，临床上肝癌的确诊主要通过影像学方法如PET-CT、病理活检来验 证。PET-CT检查费用昂贵，而侵入性活检对患者来讲是极其痛苦的。因此，开发其它有效的 检测手段是极其必要的。血清学检测已经成为临床诊断的一个常规手段。而且，大量的研究 证实，在早期的肝癌患者体内相应的肿瘤标志物的水平明显上升。比如：AFP、DCP、AFP-L3、 SCCA。所有的这些指标已经成为临床检测项目。然而，大量的回顾性研究已经发现，单个指 标的肿瘤标志物对肿瘤的敏感性和特异性都是很低的，因此，通过多个指标的联合检测有 可能提高肿瘤检测的敏感性和特异性。
【发明内容】
[0012] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测肝癌标志物的抗体芯 片试剂盒，该试剂盒采用抗体芯片技术，能够同时检测8种肝癌标志物，避免传统单个指标 检测方法样本使用量大、检测时间长的弊端，具有检测速度快、样本用量少、灵敏度高、稳定 性好等优点，能在普通实验室推广和应用。
[0013] 本发明一种检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒，包括：由用于点样的标准载玻片、 用于防止漏液的软质硅胶垫、划分为若干个小格的硬质框架、U形框夹形成的反应槽，所述 U形框夹从两侧将由下至上放置的尺寸对应的所述硬质框架、所述软质硅胶垫和所述标准 载玻片夹紧在一起，以致所述标准载玻片贴紧封闭所述硬质框架的底部，使所述硬质框架 上的每个小格形成一个小的反应槽，各个小的反应槽里的标准玻片结合有相应浓度的特异 性抗体；所述硬质框架划分为2 X 8或4 X 16个小格，形成16或64孔框架；所述特异性抗体 为针对选自如下8种肿瘤标志物的抗体：AFP、AFP-L3、DCP、AFU、GP73、SCCA、CK19、VEGF。
[0014] 根据本发明所述的用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述特 异性抗体是采用以下步骤固定于玻片：
[0015] 1)特异性抗体与含有1. 4至2 %酪蛋白的pH7. 4磷酸盐缓冲液混合形成抗体混合 物；
[0016] 2)于抗体混合物中将每个抗体含量以0. 01至2ng固定于所述点样孔，每个抗体设 置2至4个重复孔；
[0017] 3)抗体芯片点阵排布于玻片，玻片每平方厘米点10至100个特异性抗体。
[0018] 根据本发明所述的用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述玻 片包括阳性对照孔和阴性对照孔；阳性对照孔为对应特异性抗体的具有相应浓度的生物素 化IgG抗体，每个反应的生物素化的IgG抗体的浓度一致，以便于标准化检测；阴性对照孔 为具有相应浓度的生物素化的无关抗体，每个反应的生物素化的无关抗体的浓度一致，以 便于标准化检测。
[0019] 根据本发明所述的用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述样 本处理液为包含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液，用于裂解细胞沉淀物，可处理血浆、 血清、尿液、咽拭子、细胞培养物、组织等样本。
[0020] 根据本发明所述的用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，利用荧 光素作为检测信号，通过比较未知样品和标准样本的信号来确定样品中的目标抗原的浓 度。
[0021] 根据本发明所述的用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，利用 Genepix Pro 6.1软件获取芯片上所有点的信号强度，利用电子表格版的分析软件计算每 个蛋白的表达水平和标准曲线，利用阳性对照信号标准化，背景阈值设置对照组的平均强 度加上2倍标准偏差（SD)进行统计，表达水平高于背景加上2XSD的蛋白用于校正的T检 验分析。
[0022] 根据本发明所述的用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，采用全 自动点样仪器，各特异性抗体蛋白质的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的 蛋白质芯片排布阵列，控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。
[0023] 本发明采用了玻片式抗体芯片平台与定量抗体芯片平台。通过在标准大小的玻片 上固定多个特异性捕获抗体，并用16或64孔的框架形成的多通量的芯片。