HNF4α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，本发明采用免疫组化方法检测HNF4α蛋白在肝癌组织中的表达量，能够判断肝癌患者出现远处转移的风险及术后状况。本发明提供了HNF4α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。本发明用HNF4α蛋白作为判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝细胞癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。
【专利说明】HNF4a蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种HNF4 α蛋白的应用，具体地说，涉及HNF4 a蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002]肝癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率长期居高不下。我国是世界上肝癌发病最多的国家，每年新发病例约占全球50%。统计资料表明，肝癌术后高复发转移率(5年复发率达70%，小肝癌也达50%)已成为进一步提高远期疗效的瓶颈，肝癌预后判断指标匮乏。
[0003]肝癌转移是一个多因素参与并相互作用的复杂过程，既关乎癌细胞本身、又与癌细胞同癌周微环境及宿主免疫状态的相互作用有关。在肝癌中显著升高或降低的数百种基因和/或蛋白中，至少有20余种基因和/或蛋白的表达目前被确定与肝癌的转移相关，但这些基因和/或蛋白的敏感性及特异性尚难以满足临床预测要求。
[0004]本领域迫切需要寻找能预测肝癌病情及预后的相关基因和/或蛋白，这方面的研究对临床治疗肝癌及预 防肝癌复发具有重要意义。
[0005]HNF4 α 蛋白(hepatocyte nuclear factor4 α , HNF4 α , GeneID: 3172) ? 肝细胞核因子4 (hepatocyte nuclear factor4, HNF4 a )是一种属于细胞核激素受体家族的转录因子，在分化成熟的肝细胞中高表达，其中HNF4 α是HNF4的重要亚型。HNF4 a参与维护肝细胞脂肪代谢、白蛋白合成、药物解毒、能量代谢、胆汁酸合成等重要功能，也是维持肝细胞上皮表型的重要基因。对肝癌研究发现，肝癌去分化状态伴随大量肝细胞核因子表达下调，其中HNF4 α表达下调是肝癌发生的重要环节。(参见文献:0domDTj et al.Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcriptionfactors.Science2004;303:1378-1381.Beifang Ningjet al.Hepatocyte nuclearfactors4a prevents the development of hepatocellular carcinoma.CancerResearch2010:70 (5): 7640-7651)目前为止，肝癌转移的分子机制仍不清楚，有效的治疗靶点和预后标志物也十分有限。
[0006]目前还未见HNF4CI可调控肝癌转移并用于肝癌病人预后判定的研究报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供HNF4 α蛋白的新应用，特别是在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。
[0008]本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测HNF4ci蛋白在肝癌组织中的表达量，能够判断肝癌患者出现远处转移的风险及术后状况。基于HNF4 α蛋白的表达量与肝细胞癌的这种相关性，以该蛋白作为分子标记对其表达量进行检测可以用于指导肝癌病人的预后判断。
[0009]本发明提供了 HNF4CI蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，该应用是指将HNF4a蛋白作为分子标记，利用HNF4a单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，分析HNF4 α蛋白在肝癌组织中的表达量。
[0010]所述的HNF4 α单克隆抗体为商品化抗体，(制备方法参见文献YokoyamaWMj et al.2001.Production of Monoclonal Antibodies.Current Protocols inImmunology.74:2.5.1-2.5.25.)相应的，利用特异性抗HNF4 α蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，用于制备确定肝癌手术预后的制剂或试剂盒，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
[0011]本发明还提供了使用上述试剂盒用于体外检测HNF4 α蛋白在肝癌组织中的表达量的方法，该方法包括以下步骤:
[0012](a)利用本试剂盒中的二甲苯，乙醇，3%H202溶液，1%BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG将肝癌组织切片进行免疫组化染色；
[0013](b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；
[0014](c)利用生物图像处理软件分析肿瘤中阳性信号强度，给出评分。
[0015]所述的该方法具体步骤如下:
[0016](I)制备肝癌组织石蜡切片，60°C烤箱过夜；
[0017](2)切片脱腊至水；
[0018](二甲苯 I ① IOmin — 二甲苯 II ② IOmin — 二甲苯 III ③ IOmin — 100% 乙醇5min — 95% 乙醇 5min — 85% 乙醇 5min — 75% 乙醇 5min —双蒸水 5min)
[0019](3) 3%H202 溶液，室温放置 20min ；
[0020](4)双蒸水洗 5min X 3 ；
[0021](5)抗原修复:切片放入0.0lM柠檬酸盐缓冲液(ρΗ6.0)中煮沸30min ；
[0022](6)自然冷却至室温，双蒸水洗5minX3 ;
[0023](7) 1%BSA 封闭 30min, 37°C ；
[0024](8)甩去封闭液，不洗，直接加一抗(鼠HNF4ci单克隆抗体，购自R&D公司，稀释比例1:200)。置入湿盒中4°C冰箱过夜16小时；
[0025](9)41:取出，室温复温151-11，然后0.0謹 PBS 洗 5minX4;
[0026](10)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，购自丹麦DAKO公司，即用型，无需稀释)45min，37°C ；
[0027](11)0.0lM PBS 洗 5minX4，DAB 显色 2-10min，镜下观察；
[0028](12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；
[0029](13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
[0030](14)脱水透明，盖玻片覆盖；
[0031](15)显微镜下观察阳性染色，于肝癌组织随机选取3个视野并拍照；
[0032](16)采用Image Scope (Aperio公司)软件对组织样本进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms (Positive Pixel Count)程序对每个样本进行“阳性Pixel ”计算,获得计算数据如下表:
【权利要求】
1.HNF4 α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。
2.制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，使用上述试剂盒用于体外检测HNF4a蛋白在肝癌组织中的表达量的方法，该方法包括以下步骤:根据权利要求1所述的HNF4 α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，该应用是指将HNF4 α蛋白作为分子标记，利用HNF4CI单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，分析HNF4 α蛋白在肝癌组织中的表达量。
3.根据权利要求2所述的HNF4ci蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，其中的免疫组化实验试剂是指二甲苯、乙醇、3%Η202溶液、1%BSA封闭液、DAB显色试剂、苏木素和辣根过氧化物酶。
4.根据权利要求2或3所述的HNF4ci蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述的HNF4a单克隆抗体是鼠HNF4a单克隆抗体。
5.根据权利要求2或3所述的HNF4α蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，该方法包括以下步骤Ca)利用本试剂盒中的二甲苯，乙醇，3%H202溶液，1%BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG将肝癌组织切片进行免疫组化染色；(b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；(c)利用生物图像处理软件分析肿瘤中阳性信号强度，给出评分。
6.根据权利要求5所述的HNF4ci蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，当步骤(C)的评分高于0.24为HNF4a蛋白高表达，低于0.24为HNF4 α蛋白低表达。
【文档编号】G01N33/68GK103439516SQ201310356995
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】宁北芳, 谢渭芬, 丁劲, 张新, 尹川, 许文萍 申请人:中国人民解放军第二军医大学