专利名称：一种靶向人高转移肝癌细胞的单链dna适配子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝癌转移复发的诊断与治疗技术领域，具体涉及一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子及其应用，可用于肝癌转移复发的靶向诊疗。
背景技术：
肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，占全部恶性肿瘤的6%，中国是世界上肝癌死亡率最高的国家，占世界上肝癌总死亡人数的53%，在中国已成为恶性肿瘤第2位的死因。尽管近几十年以来在肝癌诊治和基础研究 方面均取得了长足的进步，但总体而言，肝癌的预后并没有得到显著的改善，5年生存率仅为5%左右。目前，临床主要依靠定期复查甲胎蛋白AFP等血清学标志物和B超等影像学检查来发现术后的转移复发，但AFP阳性的肝癌只有70%-80%，B超无法发现小于Icm的肝癌，诊断均存在盲区，不能准确及时预测。因此进行筛选HCC转移相关的靶分子用来预测并干预转移复发的研究尤为重要。近年来发展起来的SELEX (systematic evolution of ligands by exponentialenrichment)技术是九十年代发展起来的一种新的体外筛选技术，它运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得高亲合力、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers)，已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子和朊病毒等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲合性和特异性，具有良好的应用前景。特异结合于肿瘤细胞的核酸适配子有利于肿瘤的诊断和治疗。抗体可以特异识别肿瘤细胞的标志物，但缺点是分子大且具有免疫原性。人源化抗体等抗体工程技术更具前景，但因易被肽酶降解和有免疫反应而导致应用受限。适配子出现十多年来，已可应用于酶链寡核苷酸实验、流式细胞仪、适配子芯片(aptamer chip)、蛋白定量及蛋白纯化等体外实验，同时具有可在体内抑制生长因子和受体的相互作用或抑制酶活性等功能，还可进行体内成像等。适配子可作为诊断和治疗试剂，用于诊断时可识别与结合特定靶分子，用于治疗时可作为功能阻断物质或者直接阻断疾病进程。适配子可以作为肿瘤发生和发展过程中具有重要功能的蛋白质的直接抑制剂。然而到目前为止，还没有出现成功将SELEX筛选技术用于开发诊断及治疗肝癌转移复发的试剂的报道。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种能特异性地、高亲和力地结合高转移潜能肝癌细胞HCCLM9(Wu et al. Journal of Experimental&ClinicalCancer Research 2010, 29:17, http://www. jeccr. com/content/29/1/17)膜表面的单链DNA适配子；
本发明的第二个目的在于提供一种上述单链DNA适配子耦联荧光量子点形成的功能化生物分子探针，能识别组织切片中的肝癌细胞；本发明的第三个目的在于提供一种上述单链DNA适配子耦联磁性颗粒的复合物，能捕获外周血模拟环境中的循环肝癌细胞；作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述单链DNA适配子或其衍生物在制备肝癌靶向诊断试剂中的应用。作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述单链DNA适配子或其衍生物在制备靶向性抗肝癌转移复发药物或抗肝癌转移复发 药物靶向输送载体中的应用。为了实现上述诸目的，本发明采用了以下技术方案一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，其筛选及初步的应用研究过程如下①随机ssDNA文库的构建和引物的合成构建长度为76nt的随机文库，两端为固定序列，中间为40个核苷酸随机序列，库容量大约为IO15-IO16,根据随机ssDNA文库两端固定序列设计上下游引物。ssDNA文库的序列5’ -ATC CAG AGT GAC GCA GCA- (MO)-TGG ACA CGG TGG CTT AGT-3’，其中 N 代表 A，T，C，G 四个随机碱基;上游引物 P1:5’-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-3’;下游引物 P2 :5，_ACTAAG CCA CCG TGT CCA-3’ ；②SELEX筛选过程a :高转移潜能肝癌细胞HCCLM9 (靶细胞)和低转移潜能肝癌细胞MHCC97-L (消减细胞)的培养；b :消减细胞、靶细胞与ssDNA文库孵育；c :与靶细胞结合ssDNA的扩增；d 链酶亲和素磁珠法制备ssDNA文库；e :重复上述过程，共进行8-12轮筛选。③流式细胞仪监测DNA适配子的各轮筛选富集情况a:制备FITC标记ssDNA ;b :靶细胞的处理；c :靶细胞与FITC标记ssDNA孵育；d :流式细胞术检测，通过荧光强度值的大小比较富集的情况。④克隆与测序经多轮筛选得到的ssDNA用PCR扩增dsDNA，回收纯化连接T载体，经蓝白斑筛选，随机挑选多个克隆进行序列测定。⑤DNA适配子一、二级结构分析和预测及同源序列分析⑥流式细胞术检测DNA适配子与高转移潜能肝癌细胞HCCLM9 (靶细胞)结合的亲和力解离常数Kd。⑦DNA适配子特异性的鉴定通过流式细胞术检测筛选得到的DNA适配子与高转移潜能肝癌细胞(HCCLM9)、低转移潜能肝癌细胞MHCC97-L、HepG2细胞、Hu7细胞、乳腺癌细胞MDA-MB-231、肺癌细胞H1299、结肠癌细胞SW48、胃癌细胞MGC803、宫颈癌细胞HeLa、外周血白细胞WBC的亲合力以鉴定其特异性。⑧通过荧光显微镜成像和流式荧光强度变化，初步分析ssDNA适配子与靶细胞的结合位点用蛋白酶K处理靶细胞后，用FITC标记的ssDNA适配子与靶细胞作用后，上流式检测。初步分析用蛋白酶处理靶细胞后，适配子与靶细胞结合的能力是降低或是升高，从而判断ssDNA适配子是否与靶细胞表面的膜蛋白分子结合。⑨应用量子点荧光成像初步分析ssDNA适配子作为分子探针识别组织切片中的肝癌细胞的能力分别以培养的肝癌细胞、肝癌肺转移动物模型肝脏和肺脏组织切片、临床确诊的若干例肝癌组织切片为研究对象，以筛选出的核酸适配子为识别分子，用量子点作为标记物，采用间接荧光法，研究其对肝癌细胞的特异性识别。⑩磁性颗粒与高亲和力特异结合 靶细胞表面单链DNA适配子耦联，研究该复合物捕获外周血模拟环境中循环肿瘤细胞的效能把不同数量(IO5个、IO4个、IO3个、IO2个)的肝癌细胞HCCLM9分别混匀到ImL健康人的外周血中，NH4Cl法除去红细胞，然后与BIO标记的核酸适配子孵育；充分洗涤后，室温下与链酶亲和素磁珠孵育；在磁力架上充分洗涤后，铺在多聚赖氨酸处理的玻片上，固定后，以AFP抗体/CK19抗体/DAPI鉴定捕获的细胞。与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于本发明以遗传背景相同但转移潜能有明显差异的两个肝癌细胞系MHCC97-L (低转移)和HCCLM9 (高转移)分别为消减靶子和筛选靶子，采用消减cell-SELEX技术，筛选出了能特异识别高转移潜能肝癌细胞HCCLM9而不识别低转移潜能肝癌细胞MHCC97-L的单链DNA适配子LY-I。量子点耦联适配子LY-I的功能化生物分子探针，可识别体外培养的高转移肝癌细胞以及肝癌肺转移动物模型裸鼠肝脏和肺脏组织切片中高转移肝癌细胞。经临床验证发现，量子点耦联适配子LY-I的功能化生物分子探针可识别肝癌病人肝脏组织切片中的肝癌细胞，这为临床肝癌早期转移诊断提供了依据。FITC标记的适配子LY-I在流式细胞仪上可识别出外周血模拟环境中高转移肝癌细胞，基于适配子LY-I耦联磁颗粒的复合物可捕获外周血模拟环境中的循环肝癌细胞。循环肝癌细胞可能是肝癌血行转移的基础，是导致术后复发转移的关键。本发明筛选出特异结合高转移潜能的肝癌细胞膜表面靶向核酸适配子分子，用来捕获、识别循环肝癌细胞，可解决因缺乏肝癌细胞表面特异性单克隆抗体而无法捕获、识别循环肝癌细胞的困扰。
图I. I为第二轮筛选电泳图变化示意图。A:第二轮单链扩双链电泳图，Lanel :18个循环的PCR产物；Lane2 :18个循环阴性对照。B:第二轮双链链扩双链电泳图，Lanel 12个循环的PCR产物；Lane2 :14个循环的PCR产物；Lane3 :16个循环的PCR产物；Lane4 :18个循环的PCR产物；Lane5 :20个循环的PCR产物；Lane6 :12个循环仅细胞无文库的PCR产物；Lane7 :14个循环仅细胞无文库的PCR产物；Lane8 :16个循环仅细胞无文库的PCR产物；Lane9 :18个循环仅细胞无文库的PCR产物；LanelO :20个循环仅细胞无文库的PCR产物。图I. 2为第八轮和第九轮筛选电泳图变化示意图。A:第八轮单链扩双链和双链扩双链，Lanel :12个循环单链扩双链PCR产物；Lane2 :阴性对照；Lane3 :4个循环双链扩双链PCR产物；Lane4 :6个循环双链扩双链PCR产物；Lane5 :8个循环双链扩双链PCR产物；Lane6 :10个循环双链扩双链PCR产物。B:第九轮单链扩双链和双链扩双链，Lanel :8个循环单链扩双链PCR产物；Lane2 :10个循环单链扩双链PCR产物；Lane3 :阴性对照；Lane4 4个循环双链扩双链PCR产物；Lane5 6个循环双链扩双链PCR产物；Lane6 8个循环双链扩双链PCR产物；Lane7 10个循环双链扩双链PCR产物。图I. 3为第10轮单链扩双链电泳图变化示意图。Lanel 10个循环单链扩双链PCR产物；Lane2 :12个循环单链扩双链PCR产物；Lane3 :14个循环单链扩双链PCR产物；Lane4 :16个循环单链扩双链PCR产物；Lane5 :阴性对照。图2为流式细胞分析监测与细胞结合的文库富集情况示意图。选取第3轮、5轮、7轮、9轮筛选的文库，采用FITC、BIO标记的引物扩增文库，链酶亲和素磁珠分离法制备ssDNA亚文库，600pmol亚文库分别与IxlO6靶细胞HCCLM9、消减细胞MHCC97L冰上孵育30min，流式监测结合细胞荧光强度变化。图3A-F为富集文库的测序结果示意图。图3A:适配子LY-I序列及测序图；图3B:适配子LY-13序列及测序图；图3C:适配子LY-7/43序列及测序图；图3D:适配子LY-27/45序列及测序图；图3E:适配子LY-32序列及测序图；图3F:适配子LY-46序列及测序图。图4为荧光显微镜和流式细胞仪鉴定ssDNA适配子与细胞的结合示意图。图4. I :6条适配子与靶细胞结合的流式检测。图4. 2 :6条适配子与靶细胞结合的荧光图。图5为适配子LY-I结合细胞的特异性分析示意图。包括FITC标记的适配子LY-I与高转移肝癌细胞HCCLM9、低转移肝癌细胞MHCC97-L、肝癌Hu7细胞、肝癌HepG2细胞、肺癌Hl299细胞、结肠癌SW48细胞、胃癌MGC803细胞、宫颈癌HeLa细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、外周血白细胞WBC结合流式检测图。图6为适配子LY-I与靶细胞结合力常数分析示意图。通过FITC-LY-I适配子在不同浓度下与HCCLM9结合后的平均荧光强度测定，利用prism软件拟合结合曲线，计算两者结合的平衡解离常数Kd值，约为Kd=167. 3±30. 2nM。图7为适配子LY-I与细胞结合位点分析示意图。A:高转移肝癌细胞HCCLM9经蛋白酶K作用后，细胞膜受到一定程度破坏，适配子LY-I结合的荧光强度减弱。B:LY-I适配子与高转移肝癌细胞荧光成像图(40X )。图8为量子点耦联适配子LY-I功能化生物分子探针可识别高转移肝癌细胞示意图。A:量子点耦联适配子LY-I功能化生物分子探针可识别高转移肝癌细胞(20X )；B:量子点耦联适配子LY-I功能化生物分子探针可识别高转移肝癌细胞(40X )。图9为量子点耦联适配子LY-I的功能化生物分子探针识别肝癌肺转移动物模型裸鼠肝脏组织切片中肝癌细胞示意图。A:量子点耦联适配子LY-I的功能化生物分子探针识别肝癌肺转移动物模型裸鼠肝脏组织切片中肝癌细胞，肝癌细胞膜表面被红色的量子点标记显色；
B:量子点耦联无关对照适配子的功能化生物分子探针不识别肝癌肺转移动物模型裸鼠肝脏组织切片中肝癌细胞。图10为量子点耦联适配子LY-I的功能化生物分子探针识别肝癌肺转移动物模型裸鼠肺脏组织切片中肝癌细胞示意图。A:量子点耦联适配子LY-I的功能化生物分子探针识别肝癌肺转移动物模型裸鼠肺脏组织切片中肝癌细胞，高转移肝癌细胞膜表面被红色的量子点标记显色；B:量子点耦联无关对照适配子的功能化生物分子探针不识别肝癌肺转移动物模型裸鼠肺脏组织切片中肝癌细胞。
图11为量子点耦联适配子LY-I功能化生物分子探针识别肝癌病人组织切片中的高转移肝癌细胞示意图。A:量子点耦联适配子LY-I的功能化生物分子探针识别肝癌病人肝脏组织切片中的肝癌细胞，肝癌细胞膜表面被红色的量子点标记显色；B:量子点耦联无关对照适配子功能化生物分子探针不识别肝癌病人肝脏组织切片中的肝癌细胞。图12为FITC标记的适配子LY-I在流式细胞仪上可识别出外周血模拟环境中高转移肝癌细胞不意图。A:仅白细胞无高转移肝癌细胞，FITC标记的适配子LY-I在流式仪上不识别白细胞；B:仅高转移肝癌细胞无白细胞，PE-⑶45不识别高转移肝癌细胞；C: IO5个肝癌细胞混匀到ImL健康人的外周血中，FITC标记的适配子LY-I可识别出一定数量的外周血模拟环境中的肝癌细胞；DilO4个肝癌细胞混匀到ImL健康人的外周血中，FITC标记的适配子LY-I可识别出一定数量的外周血模拟环境中的肝癌细胞；EilO3个肝癌细胞混匀到ImL健康人的外周血中，FITC标记的适配子LY-I可识别出一定数量的外周血模拟环境中的肝癌细胞；F: IO2个肝癌细胞混匀到ImL健康人的外周血中，FITC标记的适配子LY-I能够识别较少量的外周血模拟环境中的肝癌细胞。图13为适配子LY-I捕获外周血模拟环境中的肝癌细胞后经AFP抗体鉴定情况示意图。A:基于适配子LY-I耦联磁颗粒的复合物捕获的外周血模拟环境中的循环肝癌细胞经AFP抗体鉴定成像图(20 X)；B:基于适配子LY-I耦联磁颗粒的复合物捕获的外周血模拟环境中的循环肝癌细胞经DAPI染料鉴定成像图(20X)；C:基于适配子LY-I耦联磁颗粒的复合物捕获的外周血模拟环境中的循环肝癌细胞经AFP抗体鉴定成像图(40 X)；D:基于适配子LY-I耦联磁颗粒的复合物捕获的外周血模拟环境中的循环肝癌细胞经DAPI染料鉴定成像图(40X)。
具体实施方式
下面申请人将结合具体的实施例对本发明做进一步的阐述，便于本领域技术人员深入了解本发明；但以下内容不应以任何方式被理解为对本发明权利要求书请求保护范围的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。相应的结果见说明书附图，分析说明见
。实施例I.消减cell-SELEX筛选特异结合高转移肝癌细胞的核酸适配子I. I高转移潜能肝癌细胞HCCLM9 (靶细胞)和低转移潜能肝癌细胞MHCC97-L (消减细胞)筛选前处理采用无酶的细胞消化液处理生长状况良好的细胞，按5X IO6个细胞接种于培养皿中，过夜培养，当细胞的融合率达到95%即可用于文库的筛选。I. 2第一轮细胞筛选I. 2. I选择细胞融合率95%的单层贴壁过夜生长的细胞HCCLM9作为筛选靶标，用台盼蓝鉴定其活性，用I XPBS-lmmol/LMgCl2-0. 1%BSA漂洗细胞2次；I. 2. 2将随机ssDNA文库与靶细胞在冰上共孵育60min，使ssDNA文库与细胞充分作用；I. 2. 3 I X PBS-lmmol/LMgCl2-0. 1%BSA 洗涤缓冲液漂洗细胞；I. 2. 4向单层细胞加入CldH2O2，室温下作用lOmin，用细胞刮匙反复刮，收集细胞裂解液，转入L 5mlEP管中，100°C水浴lOmin，12000rpm, lOmin，收集上清，上清中含有第一轮筛选结合的单链DNA，上清液作为模板可用于PCR扩增，制备下一轮筛选的亚文库。-80°C冻存备用。I. 3第一轮筛选后的单链DNA文库PCR扩增I. 3. I通过上、下游引物将单链DNA文库扩增为双链DNA文库，扩增条件为
权利要求
1.一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子，其核苷酸核心序列如SEQ ID No. 2所示。
2.一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。
3.含有权利要求I或2所述单链DNA适配子的衍生物，所述衍生物为以下的任意一种 X将所述适配子进行核苷酸取代后得到的RNA核酸适配子衍生物； I将所述适配子骨架改造为硫代磷酸酯骨架后得到的核酸适配子衍生物； S将所述适配子改造为肽核酸后得到的核酸适配子衍生物； ■I将所述适配子连接标记分子或生物材料后得到的核酸适配子衍生物； 所述生物材料为放射性核素、荧光基团、酶标记物、化学发光剂、纳米材料、微流控芯片或生物传感器。
4.权利要求I或2所述单链DNA适配子在制备肝癌诊断试剂中的应用。
5.含有权利要求I或2所述单链DNA适配子的肝癌诊断试剂。
6.权利要求I或2所述单链DNA适配子在制备靶向抗肝癌转移复发药物中的应用。
7.权利要求I或2所述单链DNA适配子在制备抗肝癌转移复发药物的靶向输送载体中的应用。
8.—种靶向抗肝癌转移复发药物，其中含有权利要求I或2所述的单链DNA适配子。
全文摘要
本发明公开了一种靶向人高转移肝癌细胞的ssDNA适配子及其应用，涉及肝癌转移复发的诊治领域，为肝癌转移复发的诊治提供了一种高效特异的靶向性新型分子。本发明应用消减cell-SELEX技术，以遗传背景相同但转移潜能有明显差异的两个肝癌细胞系MHCC97-L(低转移)和HCCLM9(高转移)分别为消减靶子和筛选靶子，筛选出能特异识别高转移潜能肝癌细胞HCCLM9的ssDNA适配子。该适配子是能特异结合人高转移肝癌细胞膜表面的单链DNA分子探针，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。该适配子在制备诊断或治疗肝癌的试剂中可望发挥重要作用。
文档编号A61P35/00GK102766634SQ20121028216
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者刘少平, 李雁, 汪付兵 申请人:武汉大学