专利名称：一种具有肠上皮细胞保护功能的蛋白序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白序列，尤其是一种植物乳杆菌的蛋白序列及其在保护肠上皮细胞药物中的应用、以及一种包含该序列的药物。
背景技术：
肠道微生物生态系统数量庞大、组成复杂，其细菌数量约10倍于人体体细胞，与人类健康状况的维持和疾病的发生有着密切的关系。其中，益生菌在肠道内的黏附和定植对抑制致病菌的定植、移位和感染，维护肠道黏膜的完整性具有特别重要的意义。除此之夕卜，随着抗生素、激素以及化学药物的大量使用，加上食品中各种各样有毒有害物质的影响，人体内的微生物菌群遭到严重破坏，各种相生相克的微生物菌群失去了原有的平衡，导致人体的免疫系统的免疫能力下降。由于上述原因，在维护肠道健康及治疗肠道疾病方面，人们将注意力转移到了生物技术上，以寻求一种既能治愈肠道疾病，又能避免上述副作用的解决之道。益生菌中的乳酸杆菌一直是近年来国内外研究的热点，乳酸杆菌是指能使糖类发酵产生乳酸的细菌，嗜酸性，可治疗消化不良和腹泻，可以降低肠道内致病性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌等病原菌对肠上皮细胞的附着能力，是一群生活在机体内的有益于宿主健康的微生物，能够维护人体健康和调节免疫功能。微生物与宿主相互作用的研究是当今微生物学领域的核心研究方向，近年来，肠道微生物系统在肠道内的定植、繁衍机制引起广泛关注，尤其是其特殊的遗传特性、分泌具有潜在生物学意义的蛋白质和生物活性物质，在肠道环境中适应性以及与宿主细胞的相互作用机理非常复杂。粘附肠上皮细胞的强弱是益生菌和致病菌侵袭性的重要指标，学术界认为，粘附是由细胞壁中脂磷壁酸、肽聚糖以及细菌表面粘附蛋白等粘附素参与或介导的与宿主细胞表面受体相结合的过程，近几年来国内外对乳酸杆菌的研究表明，乳酸杆菌在发挥其益生作用时，其表 面蛋白(surface layer protein, SLP)的黏附结构域起着核心作用。
发明内容
本发明提供一种源自于植物乳杆菌的SLP中的蛋白序列及其在肠上皮细胞保护制剂中的应用、以及一种包含该序列的制剂。本发明第一个方面是提供一种蛋白序列，其中，所述蛋白序列具有序列表中SEQID No.1所示的氨基酸序列。本发明第二个方面是提供一种所述蛋白序列在保护肠上皮细胞的制剂中的应用。本发明第三个方面是提供一种含有所述蛋白序列的保护肠上皮细胞的制剂。本发明所述的蛋白序列源自于植物乳杆菌的SLP中蛋白序列，通过实验证明，将其应用于肠上皮细胞保护制剂，对肠上皮细胞具有重要的保护作用和积极效果，并且对人体无副作用。
图1是EIEC和EPEC对NCM460细胞的黏附率结构，其中，图1A为本发明蛋白序列处理前后EIEC对NCM460细胞的黏附的对比；图1B为本发明蛋白序列处理前后EPEC对NCM460细胞的黏附的对比；
图2是EIEC和EPEC对NCM460细胞通透性(TER)影响；其中，图2A为本发明蛋白序列处理前后EIEC对NCM460细胞通透性的对比；图2B为本发明蛋白序列处理前后EPEC对NCM460细胞通透性的对比；
图3是EIEC和EPEC对紧密连接蛋白(TJ)的破坏程度照片；其中，图3A为本发明蛋白序列处理前后EIEC对紧密连接蛋白(TJ)的破坏程度；图3B为本发明蛋白序列处理前后EPEC对紧密连接蛋白(TJ)的破坏程度；
图4为Western blot方法验证本发明158蛋白序列存在于LP的全菌体黏附蛋白的结果照片。
具体实施例方式下面结合附图对本发明具体实施例做进一步的说明，但不作为对本发明的限定。一种蛋白序列，具有序列表中SEQ ID No.1所示蛋白序列(简称为158)，其来源于保藏号为 CGMCC No. 1258 的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum, LP)。通过Western blot方法验证158存在于LP的全菌体黏附蛋白中
参照图4,全菌体蛋白通过纯化的全菌体黏附蛋白电泳后,用抗ant1-158作WB分析,结果可见100-130kD有与理论相符的阳性条带，说明ant1-158可与全菌体黏附蛋白反应，反映了 158蛋白序列存在于 全菌体黏附蛋白中。所述158蛋白制备的方法可参考文献Liu Z, Shen T, Zhang P, Ma Y, QinH, Lactobacillus plantarum surface layer adhesive protein protects intestinalepithelial cells against tight junction injury induced by enteropathogenicEscherichia coli, Mol Biol Rep, 2011; 38(5): 3471-3480
实施例1,抑制EIEC/EPEC对NCM460细胞的黏附
实验方法可参考文献Liu Z, Shen T, Zhang P, Ma Y, Qin H, Lactobacillusplantarum surface layer adhesive protein protects intestinal epithelial cellsagainst tight junction injury induced by enteropathogenic Escherichia coli, MolBiol Rep, 2011; 38(5): 3471-3480
如图1所示，EIEC对NCM460细胞的黏附率为15%_28%，EPEC对NCM460细胞的黏附率为20%-45%。而当本发明蛋白序列(158)预处理后(I58+EIEC，I58+EPEC), EIEC和EPEC的黏附率均明显下降，均降至10%以下，与使用植物乳杆菌进行预处理(LP+EIEC，LP+EPEC)效果相近，甚至效果更好一些。而加入ant1-MIMP (anti_I158)阻断其作用后,本发明所述蛋白序列的保护作用则消失(P〈0. 05)。实施例2,抑制EIEC/EPEC诱导的NCM460细胞通诱件(TER)的下降
试验方法参考Qin H, Zhang Z, Hang X, Jiang Y. L. , Plantarum preventsenteroinvasive Escherichia coli—induced tight junction proteins changes inintestinal epithelial cells, BMC Microbiol， 2009; 9: 63
如图2所示的实验结果表明，EIEC/EPEC干预后，NCM460细胞的TER值与对照组相比显著下降(P〈0. 05，图2A，图2B)，但当158预处理后，NCM460细胞的TER值则显著升高，24h后，EIEC对NCM460细胞通透性由25%左右上升至65 70%左右，EPEC对NCM460细胞通透性由30%左右上升至7(Γ75%左右，与直接使用植物乳杆菌(LP)效果相近。而加入ant1-MIMP (anti_I158)阻断其作用后,本发明所述蛋白序列的保护作用则消失(P〈0. 05)。实施例3,降低EIEC/EPEC对紧密连梓蛋白(TT)和F-actin的破坏作用 试验方法参考Qin H, Zhang Z, Hang X, Jiang Y. L. , plantarum prevents
enteroinvasive Escherichia coli—induced tight junction proteins changes inintestinal epithelial cells, BMC Microbiol， 2009; 9: 63
如图3所示，荧光染色法显示，对照组TJ相关蛋白表达可见荧光沿胞膜分布，边界清楚，呈网状结构。EIEC/EPEC感染Caco-2细胞后，细胞间的荧光分布则明显分散，强度减弱。细胞之间的间隙增大，而当158预处理后TJ相关蛋白的荧光强度明显得到改善，沿胞膜分布，较清晰，与使用植物乳杆菌·(LP)效果相似，IF法对F-actin检测也得到类似的结果。综上所述，本发明所述蛋白序列，能够抑制EIEC/EPEC对NCM460细胞的黏附，并抑制EIEC/EPEC诱导的NCM460细胞通透性(TER)的下降，还可降低EIEC/EPEC对紧密连接蛋白(TJ)和F-actin的破坏作用，可以用作保护肠上皮细胞的制剂使用。本领域技术人员能够理解的是，本发明上述内容中所述制剂可以是药物、或生物制剂，例如将所述蛋白序列通过载体制成药物，然后由载体将药物输送至目的区域；或者通过生物技术制成含该蛋白的重组菌株，将所述菌株制成生物制剂，在肠道内分泌该蛋白序列。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
权利要求
1.一种蛋白序列，其特征在于，所述蛋白质具有序列表中SEQ ID No.1所不的氣基酸序列。
2.一种如权利要求1所述的蛋白序列在保护肠上皮细胞的制剂中的应用。
3.一种含有如权利要求1所述的蛋白序列的保护肠上皮细胞的制剂。
全文摘要
本发明公开了一种蛋白序列，其中，所述蛋白质具有氨基酸列表中SEQIDNo.1所述序列；所述蛋白序列可应用于保护肠上皮细胞的药物药剂中；一种含有所述蛋白序列的药物。将本发明的一种源自于植物乳杆菌的SLP中蛋白序列应用于保护肠上皮细胞的药物药剂中，以及包含该序列的药物，具有保护肠上皮细胞的积极效果，并对人体无副作用。
文档编号A61P1/00GK103044532SQ201210281968
公开日2013年4月17日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者刘志华, 秦环龙, 汪建平 申请人:刘志华